Вопрос  № 1

     Электронная микроскопия. Принципы устройства и  работы электронного микроскопа. Преимущества и недостатки метода. 

     Стр 36 Ченцов

     Рассматривая  характеристики светового микроскопа, можно убедиться, что единственным путем увеличения разрешения оптической системы будет использование источника освещения, испускающего волны с наименьшей длиной. Таким источником может быть раскаленная нить, которая в электрическом поле выбрасывает поток электронов, последний можно фокусировать, пропуская через магнитное поле. Это послужило основой для создания электронного микроскопа, в котором уже сейчас достигнуто разрешение в 1 А (0,1 нм). По принципу конструкции электронный микроскоп очень сходен с оптическим: в нем есть источник освещения (катод электронной пушки), конденсорная система (конденсорная магнитная линза), объектив (объективная магнитная линза), окуляр (проекционные магнитные линзы), только вместо сетчатки глаза электроны попадают на люминесцирующий экран или на фотопластинку.

     Основная  часть такого микроскопа представляет собой полый цилиндр (колонка микроскопа), из которого откачан воздух для того, чтобы не было взаимодействия электронов с молекулами газов и окисления вольфрамовой нити накаливания в катоде электронной пушки. Между катодом и анодом подается высокое напряжение (от 50 до 200-5000 кВ), что служит причиной ускорения электронов. В центре анода есть отверстие, проходя через которое электроны формируют пучок, идущий вниз по колонке микроскопа.  

     Линзы электронного микроскопа представляют собой электромагниты, поле которых может изменять путь электронов (как стеклянные линзы изменяют путь фотонов). В конденсорной линзе пучок электронов фиксируется и попадает на объект, с которым электроны взаимодействуют, отклоняются, рассеиваются, поглощаются или проходят без изменения. Электроны, прошедшие через объект, фокусируются объективной линзой, которая формирует увеличенное первичное изображение объекта. Так же как в световом микроскопе, объективная линза определяет его основные показатели. Первичное изображение увеличивается проекционной линзой и проецируется на экран, покрытый люминесцентным слоем, светящимся при попадании на него электронов. Вместо светящегося экрана изображение можно поместить на фотопластинку и получить снимок.

     Напряжение, которое используется для ускорения электронов в большинстве просвечивающих (трансмиссионных) электронных микроскопов, достигает 50-150 кВ. При напряжении в 50 кВ электрон обладает длиной волны в 0,05 А, и в этом случае теоретически можно было бы получить разрешение в 0,025 А (d ~ 0,5 l). Однако в современных конструкциях электронных микроскопов достигается разрешение около 1 А из-за  недостаточной стабильности напряжения, стабильности тока линз, неоднородности металла магнитных линз и других несовершенств прибора (теоретически возможно еще повысить разрешение электронного микроскопа в 100 раз). Но и достигнутое разрешение огромно (вспомним, что величина О-Н связи  в молекуле воды равна 0,99 А): оно сейчас уже в 106 раз выше разрешающей способности глаза! 
 
 

     На  экранах и фотопластинках электронных микроскопов можно получить увеличение до 50 000 раз, в дальнейшем при фотопечати можно получить еще 10-кратное увеличение, так что конечное увеличение, при котором максимально реализуется разрешение, может достигать 106 раз (например, если 1 мм увеличить в 106 раз, то он достигнет длины в 1 км).

     В настоящее время электронно-микроскопическое изображение с флуоресцирующего экрана с помощью цифровой телекамеры передается прямо в компьютер, где  на экране монитора его можно обрабатывать различным образом (изменять увеличение, контрастность изображения, применять денситометрию, плани- и морфометрию отдельных компонентов). Используя принтер можно получить отпечатки полученных изображений.

     Максимальное  разрешение электронного микроскопа (ЭМ) реализуется сейчас только при исследовании металлов или кристаллических решеток. На биологических объектах такого разрешения получить пока не удается из-за низкой контрастности объекта. Биологические объекты для исследования в ЭМ помещаются на медные сеточки, покрытые тонкими пленками – подложками (формвар, коллодий, углерод), состоящими в основном из углерода. Биологические объекты также в основном содержат углерод и, следовательно, мало по плотности будут отличаться от фона, будут мало контрастны. Показано, что минимальная толщина биологического объекта с плотностью около 1 г/см3, выявляемого при ускоряющем напряжении в электронном микроскопе 50 кВ, равна 50 А. Вирусы, расположенные на поддерживающей пленке, будут видны в этом случае в виде бесструктурных пятен, а молекулы нуклеиновых кислот (толщина ДНК равна 20 А ) вообще не видны из-за низкого контраста. Контраст биологических объектов можно повысить, используя тяжелые металлы или их соли.

      Вопрос № 2

     Пластиды  клеточных растений: хлоро-, хромо-, и лейкопласты, пропластиды. Хлоро-, хромо-, и лейкопласты, пропластиды. Хлоропласты: ультраструктура и функции. Фотосинтез, основные его этапы. Происхождение пластид и их роль в цитоплазматической наследственности. (ответ иллюстрировать рисунками). 

     Пластиды  – Органоиды общего значения в растительных клетках, эвглены зеленой (простейшие) (рис. 1). Различают: хлоропласты, хромопласты, лейкопласты.

     Хлоропласты – зеленые пластиды, окруженные двумя мембранами. Внутренний слой мембраны в полости хлоропласта  образуют плоские мешочки – тилокоиды. Они дисководной формы, образуют стопку ≈ 50 штук, стопки называются гранулами. В хлоропласте 40-60 гранул. Пространство между тилакоидами заполнено стромой (матриксном) хлоропласта из белков, липидов, углеводов, ферментов, АТФ, ДНК, РНК, рибосом. Хлоропласты образуются из пропластид – небольших недифференцированных телец. Хлоропласты размножаются путем деления. Хлоропласты могут превращаться осенью в хромопласты и лейкопласты. [1] 

     Рис. 1. строение хлоропласта (а), лейкопласта (б), амилопласта (в) и хромопласта (г)

     1 – внешняя мембрана; 2 – внутренняя  мембрана; 3 – матрикс (строма); 4 –  ламеллы стромы; 5 – грана; 6 –  тилакоид; 7 – крахмальное зерно; 8 – липидная капля с пигментами 

     Хлоропалсты представляют собой структуры, ограниченные двумя мембранами – внутренней и внешней. Внешняя мембрана, как и внутренняя, имеет толщину около 7 мкм, они отделены друг от друга межмембранным пространством ококло 20-30 нм. Внутренняя мембрана хлоропластов отделяет строму пластиды, аналогичную матриксу митохондирий. В строме зрелого хлоропласта высших растений видны два типа внутренних мембран. Это – мембраны, образующие плоские, протяжные ламеллы стромы, и мембраны тилакоидов – плоских дисковидных вакуолей, или мешков.

     Ламеллы стромы (толщиной околого 20 мкм) представляют собой плоские полые мешки или же имеют вид сети из разветвленных и связанных друг с другом каналов, располагающихся в одной плоскости. Обычно ламеллы стромы внутри хлоропласта лежат параллельно друг другу и не образуют связей между собой.

     Кроме мембран стромы в хлоропластах обнаруживаются мембранные тилакоиды. Это плоские  замкнутые мембранные мешки, имеющие  форму диска. Величина межмембранного пространства у них также около 20-30 нм. Таки тилакоиды образуют стопки наподобие столбика моент, называемые граными (рис. 2). Число тилакоидов на одну грану очень варьирует: от нескольких штук до 50 и более. Размер таких стопок может достигать 0,5 мкм, поэтому граны видны в некоторых объектах в световом микроскопе. Количество гран в хлоропластах высших растений может достигать 40-60. Тилакоиды в гране сближены друг с другом так, что внешние слои их мембран тесно соединяются; в месте соединения мембран тилакоидов образуется плотный слой толщиной около 2 нм. В состав граны кроме замкнутых камер тилакоидов обычно входят и участки ламелл, которые в местах контакта их мембран с мембранами тилакоидов тоже образуют плотные слои толщиной 2 нм. Ламеллы стромы, таким образом, как бы связывают между собой отдельные граны хлоропласта. Однако полости камер тилакоидов всегда замкнуты и не прееходят в камеры межмембранного пространства ламелл стромы. Ламеллы стромы и мембраны тилакоидов образуются путем отделения от внутренней мембраны при начальных этапах развития пластид.

     В матриксе (строме) хлоропластов обнаруживаются молекулы ДНК, рибосомы; там же происходит первично отложение запасного полисахарида – крахмала, в виде крахмальных зерен.

     Рис. 2. Стомы граны

     а – общий вид; б – схема разреза; 1 – тилакоид; 2 – ламелла стромы; 3 – участок спаренных мембран 

     Функции хлоропластов:

     Фотосинтез 

     Синтез  собственных белков.

     Рис. 2. Схема основных функций хлоропласта

     Световые  реакции локализованы в тилакоидах (1), темновые – в матриксе (2)

     Хлоропласты – это структуры, в которых  осуществляются фотосинтетические  процессы, приводящие в конечном итоге к связыванию углекислоты, к выделению кислороду и синтезу сахаров.

     Характерным для хлоропластов является наличие  в них пигментов хлорофиллов, которые и придают окраску  зеленым растениям. При помощи хлорофилла зеленые растения поглощают энергию солнечного света и превращают ее в химическую. Поглощение света с определенной длиной волны приводит к изменению в структуре молекулы хлорофилла, при этом она переходит в возбужденное, активированное состояние. Освобождающаяся энергия активированного хлорофилла через ряд промежуточных этапов предеает определенным синтетическим процессам, приводящим к синтезу АТФ и к восстановлению акцептора электронов НАДФН до НАФН-Н, которые тратятся в реакции связывания СО₂ и синтезе сахаров.

     Лейкопласты – бесцветные пластиды в неокрашенных частях растений: клетках, эндосперме семян, клубнях,, корнеплодах. Это двухмембранные органоиды, внутри 2-3 выроста. Форма округлая. Переходят в хлоропласты и хромопласты.

     Функция:

     Накопление  питательных веществ – крахмала, жиров, белков.

     Хромопласты – двухмембранные пластиды нитевой, пластинчатой или иной формы. Цвет желто-красно-коричнево-оранжевый  за счет пигментов каротиноидов. Находятся  в клетках плодов. Хромопласты  – конечный этап в развитии пластид - в них превращаются хлоропласты и лейкопласты.

     Функция:

     В клетке: играют роль своеобразного  светофильтра для хлоропластов в  процессе фотосинтеза; местосинтеза и  локализации растительных пигментов.

     Окраска венчиков цветов – привлекающие насекомых  опылителей.

     Окраска плодов – привлечение животных – распространение семян.

     Фотосинтез  – процесс образования органических веществ в хлоропластах из неорганических веществ под действием света.

     Фотосинтез  состоит из световой и темновой фазы. Реакции на свету протекают в  гранах (тилакоидах), реакции, не требующих света, темновые – в строме хлоропластов.

     Световые  реакции:

     А. Свет возбуждает молекулы хлорофилла мембранах тилакоидов, электроны  сходят с орбит и переносятся  за пределы мембраны тилакоидов, создавая заряженное электрическое поле.

     В. Место вышедших электронов, занимают электроны, занимают электроны образовавшиеся в результате разложения воды под  светом (фотолиза):

          С.  ОН объединяются в воду и кислород, который выделяется в атмосферу.

     Протоны Н+ не проникают через мембрану тилакоида  и накапливаются внутри, образуя  положительно заряженное электрическое  поле, что приводит к Δφ по обе  стороны мембраны. Пари достижения критической разности потенциалов  Н+ устремляются по протонному каналу в ферменте АТФ-синтеазе, встроенный в мембрану тилакоида, наружу. На выходе создается высокий уровень энергии, который идет на синтез АТФ из АДФ с присоединением фосфата. Образовавшиеся молекулы переходят в строму, где участвуют в реакциях фиксации углерода.

     Н⁺ вышедшие на поверхность мембраны тилакоида, соединяются с электронами, образуя атомарный водород, который идет на восстановление переносчика НАДФ⁺:

     Активированный  световой энергией электрон хлорофилла используется для присоединения водорода к НАДФН, переходит в строму хлоропласта, участвуя в реакциях фиксации углерода.

     Темновые  реакции:

     Темновая  фаза фотосинтеза представляет собой  ряд последовательных реакций. В  результате этих реакций из СО₂ и Н₂О образуются углеводы.

     СО₂ поступает в лист из окружающей среды, Н₂ образуется в световой фазе. Источником энергии служит АТФ, которая синтезируется в световую фазу. Эти вещества транспортируются в хлоропласты.

     Темновые  реакции идут в строме хлоропластов, куда поступают АТФ, НАДФН, от тилакоидов гран и СО₂ из воздуха. Кроме того, там находятся пентозы С₅, которые образуются в цикле фиксации СО₂ (цикле Кальвина).

     Цикл  Кальвина:

     К пентозе С₅ присоединяется СО₂ с образованием нестойкой гексозы С₆, которая расщепляется на 2 триозы (2С₃).

     Каждая  из триоз 2С₃ принимает по одной фосфатной группе от 2 АТФ, что обогащает молекулы триоз энергией.  

     Каждая  из триоз 2С₃ принимает по одному атому Н от 2 НАДН, после чего триозы объединяются:

     Другие  С₃ объединяются, образуя пентозы: 5С₃ → 3С₅, которые заново включаются к цикл фиксации СО₂. 
 

     Суммарное уравнение фотосинтеза:

     Пластидная наследственность

     Среди  органоидов  цитоплазмы   генетическая   непрерывность впервые  была  установлена  для  пластид.  У  многих   видов   растений встречаются особи, лишенные окраски, или такие,  у  которых  в  листьях имеются отдельные неокрашенные участки ткани. Клетки их вообще не имеют видимых  пластид  или  содержат  пластиды,  не  способные  образовывать  хлорофилл.   Растения,   лишенные   зеленой   окраски,   -   альбиносы,   нежизнеспособны и обычно  погибают  в  фазе  проростков.  Но  отдельные    участки ткани без зеленой окраски развиваются в зеленом листе,  питаясь    за счет нормальных тканей, снабжающих их продуктами фотосинтеза.

     Во  многих случаях изменения в структуре  и  функциях  пластид связаны  с мутациями одного хромосомного  гена.  У  кукурузы,  ячменя  и некоторых других культур изучены многочисленные  хлорофильные  мутации, наследующиеся по правилам Г. Менделя. Однако часто  наследование  таких изменений не подчиняются менделеевским закономерностям, и объяснить его можно только  исходя  из  представления  о  генетической  непрерывности пластид.   Электронно-микроско-   пическими   и   авторадиографическими методами доказано существование в пластидах ДНК-содержащих областей.  В   них  находятся  специфические  рибосомы.  Зеленые   пластиды   способны  синтезировать ДНК, РНК, белок. [4] 

     У ночной красавицы имеется  пестролистная  разновидность.  На одном и том же растении наряду  с  зелеными  ветвями  имеются  ветви  с листьями, на которых зеленая ткань чередуется с бесцветными полосами   пятнами.  Цветки  на  зеленых ветвях  такого  пестролистного  растения независимо от того, какой пыльцой опылять их, дают семена,  из  которых всегда вырастают нормальные зеленые растения. Семена с  ветвей,  листья  на которых лишены зеленой окраски, дают  неокрашенные  бесхлорофилльные   проростки. Из семян, завязавшихся на пестролистных побегах,  образуется  смешанное в различном  соотношении  потомство,  состоящее  из  зеленых,   пестролистных и неокрашенных растений.

     Аналогичное  явление  наблюдалось  у  пестролистных  растений львиного  зева,  пеларгонии,  энотеры,  подорожника.  Эти  факты  можно объяснить, предположив, что у пестролистных растений имеется  два  типа пластид: нормальные и аномальные, не способные образовывать  хлорофилл.

     При размножении из нормальных формируются  нормальные, а из аномальных – аномальные (белые) пластиды. Из семяпочки, включающей оба типа пластид,  путем митотических делений образуется яйцеклетки, несущие только  белые или и те и другие пластиды одновременно.

     Односторонняя, исключительно по материнской  линии,  передача признаков, связанных на примере реципрокных  скрещиваний  пестролистных растений и нормальных зеленых   растений. Пестролистное растение,  если его берут в качестве материнской формы, образует три типа яйцеклеток: с зелеными, смешанными и белыми пластидами. Поскольку спермии отцовского зеленолистного растения пластид не  содержат,  такое  скрещивание  даст смешанное  потомство,  в  котором  число   различных   растений   будет определяться   случайным   характером   распределения    пластид    при макроспорогенезе.

     В обратном скрещивании зеленолистное  растение  будет образовывать  яйцеклетки   с   зелеными   пластидами.  

     Оплодотворяемые спермиями пестролистных растений, они дадут потомство, состоящее только из  растений  с  зелеными листьями.  Следовательно,  при   реципрокных скрещиваниях между нормальными зеленолистными растениями или цветками    нормальными зеленолистных побегов пестролистной особи и цветками  с растений или  побегов,  несущих  аномальные  пластиды,  тип  пластид  и характер  возникающего  потомства  определяется   материнской   формой. Нормальное материнское растение дает  только  нормальное  потомство,  а аномальное – только аномальное независимо от фенотипа отцовской формы. [2]

      Вопрос № 3

     Биологические свойства клеток. Биоэлектрические потенциалы (потенциал покоя, потенциал действия): механизмы возникновения и распространения. (ответ иллюстрировать рисунками). 

     Биоэлектрические  потенциалы – электрические потенциалы, возникающие в живых клетках и тканях; показатель биоэлектрической активности, определяемой разностью электрических потенциалов между двумя точками живой ткани.

     Основными видами Б. п. являются мембранный потенциал (или потенциал покоя), потенциал  действия, постсинаптические потенциалы (см. Синапс).

     Другие  виды Б. п. различных органов и  тканей (рецепторные, секреторные, потенциалы сердца, головного мозга и др.) являются аналогами или производными вышеперечисленных Б. п. Мембранный потенциал (потенциал покоя) регистрируется между наружной и внутренней сторонами мембраны живой клетки (рис. 3).

     Его наличие обусловлено неравномерным  распределением ионов (в первую очередь  ионов натрия и калия) между внутренним содержанием клетки (ее цитоплазмой) и окружающей клетку средой (см. Мембраны биологические). Внутренняя сторона мембраны заряжена отрицательно по отношению к наружной (рис. 1). Величина мембранного потенциала различна у разных клеток: для нервной клетки она составляет 60–80 мВ, для поперечнополосатых мышечных волокон – 80–90 мВ, для волокон сердечной мышцы – 90–95 мВ.  
 

     При неизменном функциональном состоянии  клетки величина потенциала покоя не изменяется; поддержание постоянной его величины обеспечивается нормальным протеканием клеточного метаболизма. Под влиянием различных факторов (раздражителей) физической или химической природы величина мембранного потенциала может изменяться. Увеличение разности потенциалов между клеткой и окружающей средой называется гиперполяризацией, уменьшение – деполяризацией.

     Рис. 3. Измерение мембранного потенциала покоя 
 
 

     При уменьшении потенциала покоя до определенной критической величины (порог возбуждения) возникает кратковременное колебание, получившее название потенциала действия (рис. 4). Если потенциал покоя присущ всем живым клеткам без исключения, то потенциал действия характерен в основном для специализированных возбудимых образований, является показателем развития процесса возбуждения. Вслед за потенциалом действия (пиковый потенциал, или спайк) возникает следовая деполяризация мембраны (отрицательный следовой потенциал) и последующая ее гиперполяризация (положительный следовой потенциал). Амплитуда потенциала действия у большинства нервных клеток млекопитающих составляет 100–110 мВ, у скелетных и сердечных мышечных волокон – 110–120 мВ. Длительность потенциалов действия у нервных клеток 1–2 мс, у скелетных мышечных волокон 3–5 мс, у сердечных мышечных волокон – 50–600 мс. Следовые потенциалы по своей длительности намного превышают потенциал действия.

     Потенциал действия обеспечивает распространение  возбуждения от рецепторов к нервным клеткам, от нервных клеток к мышцам, железам, тканям. В мышечном волокне потенциал действия способствует осуществлению цепи физико-химических и ферментативных реакций, лежащих в основе механизма сокращения мышц.  
 
 

     Рис. 4. Потенциалы действия 

     Постсинаптические потенциалы (возбуждающий и тормозящий) возникают на небольших участках клеточной мембраны (постсинаптической  мембране), входящих в состав синапса. Величина постсинаптических потенциалов  составляет несколько милливольт, длительность – 10–15 мс. Возбуждающий постсинаптический потенциал (ВПСП) связан с деполяризацией клеточной мембраны. При достижении критической точки деполяризации возникает распространяющийся потенциал действия (рис. 2). Тормозящий постсинаптический потенциал (ТПСП), связанный с гиперполяризацией клеточной мембраны, препятствует возникновению потенциала действия.

     Механизм  возникновения Б. п. связан с наличием определенных физико-химических градиентов между отдельными тканями организма, между жидкостью, окружающей клетку, и ее цитоплазмой, между отдельными клеточными элементами. Во всех случаях местом возникновения градиентов являются мембраны, различающиеся не только по своей структуре, но и по ионообменным свойствам. Возникновение Б. п. в живых клетках обусловлено неравномерной концентрацией ионов натрия, калия, кальция и хлора на внутренней и наружной поверхности клеточной мембраны и ее различной проницаемостью для них. Величина мембранного потенциала покоя определяется соотношением концентраций, проникающих через мембрану ионов. Высокие концентрационные градиенты ионов калия и натрия поддерживаются благодаря существованию в клеточной мембране так называемого калиево-натриевого насоса, который обеспечивает выделение из цитоплазмы проникающих в нее ионов натрия и введение в цитоплазму ионов К+. Подобный насос работает против их концентрационных градиентов и требует для этого энергии. Источником энергии является аденозинтрифосфорная кислота (АТФ). Энергия, выделяемая при расщеплении локализованной в мембране АТФ-азой одной молекулы АТФ, обеспечивает выделение из клетки трех ионов натрия взамен на два иона калия, поступающих в клетку.

     Механизм  возникновения потенциала действия обусловлен последовательно изменяющейся во времени проницаемостью мембраны для ионов. Восходящая фаза потенциала действия связана с повышением проницаемости для ионов натрия благодаря все увеличивающемуся количеству открываемых натриевых каналов.

     Последующая смена активации натриевых каналов  на их инактивацию приводит к снижению проницаемости для ионов натрия и возрастанию проницаемости для ионов калия, что приводит к реполяризации мембраны и появлению ее потенциала покоя. В гладких мышцах в отличие от нервных клеток и скелетных мышц в генезе восходящей фазы потенциала действия ведущая роль отводится повышению проницаемости для ионов кальция. В мышце сердца сохранение потенциала действия на определенном уровне (плато потенциала действия) также обусловлено повышением проницаемости мембраны для ионов кальция.

     На  мембранах секреторных клеток формируются секреторные потенциалы. Их величина прямо связана с характером секреторной деятельности, что дает возможность оценивать функциональное состояние секреторных клеток. В тканях или органах может происходить суммация биоэлектрической активности отдельных клеток, работающих синхронно или асинхронно. Суммарная биоэлектрическая активность также отражает функциональное состояние того или иного органа или ткани.

     Исследование  Б. п. нашло широкое применение в  медико-биологических лабораториях, в клинической практике при диагностике различных заболеваний ц.н.с., сердечно-сосудистой и мышечной систем. При отведении суммарных Б. п. от нервных стволов, мышц, головного мозга, сердца и других органов применяют поверхностные макроэлектроды. В некоторых случаях используют внутриполостные электроды или вводимые непосредственно в ткань (например, игольчатые). Для регистрации и измерения Б. п. отдельных клеток чаще всего пользуются внутриклеточными и точечно-внеклеточными микроэлектродами.

     Электроды соединяют с усилителями переменного или постоянного тока, входящими в комплект серийно выпускаемых медицинских приборов. Усилитель может быть связан с устройством автоматизированной обработки биоэлектрических сигналов. [1] 

      Литература 

     1. Билич Г.Л., Катинас Г.С., Назарова Л.В. Цитология. - СПб.: Деан, 1999. – 111 с.

     2. Трошин А.С., Браун А.Д., Бахтин Ю.Б. Цитология.- М.: Просвещение, 1969. – 267 с.

     3. Ченцов Ю.С. Введение в клеточную  биологию: Учебник для вузов. –  4-е изд., перераб. и доп. /Ю.С.  Ченцов. – М.: ИКЦ «Академкнига», 2004. – 495 с.

     4. Э. де Робертис., Новинский Н., Саэс Ф. Биология клетки. - М.: Мир, 1967. - 473 с.