Генная инженерия. 6

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Содержание.

 

Введение.

Глава 1. Теоретические предпосылки формирования генной инженерии как науки.

Глава 2. Возможности генной  инженерии.

Глава 3. Перспективы клонирования животных.

Заключение.

Литература.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Введение.

 

Генная инженерия -  направление исследований в молекулярной биологии и генетике, конечной целью  которых является получение с  помощью лабораторных приемов организмов с новыми, в том числе и не встречающимися в природе, комбинациями наследственных свойств. В основе генной инженерии лежит обусловленная последними достижениями молекулярной биологии и генетики возможность целенаправленного манипулирования с фрагментами нуклеиновых кислот. К этим достижениям следует отнести установление универсальности генетического кода, то есть факта, что у всех живых организмов включение одних и тех же аминокислот в белковую молекулу кодируются одними и теми же последовательностями нуклеотидов в цепи ДНК; успехи генетической энзимологии, предоставившей в распоряжение исследователя набор ферментов, позволяющих получить в изолированном виде отдельные гены или фрагменты нуклеиновой кислоты, осуществлять in vitro синтез фрагментов нуклеиновых кислот, объединить в единое целое полученные фрагменты. Таким образом, изменение наследственных свойств организма с помощью генной инженерии сводится к конструированию из различных фрагментов нового генетического материала, введение этого материала в рецепиентный организм, создания условий для его функционирования и стабильного наследования.

Цель данной работы –  характеристика генной  инженерии. 

 

 

 

Глава 1. Теоретические предпосылки формирования генной инженерии как науки.

 

Начальные работы американских учёных Уотсона и Крика были произведены  в 1953 году. Они дали возможность развиваться  генной инженерии в качестве самостоятельного раздела науки. Эти открытия заключены  в следующем:

Была открыта двойная  структура ДНК и постулирован её матричный синтез. Двойная спираль ДНК при репликации разделится и вдоль нити ДНК, специальные ферменты-полимеры, собирают точные копии материнской ДНК, таким образом в клетке перед делением две совершенно одинаковые молекулы ДНК, одна из которых после деления клетки попадает в дочернюю клетку. Таким образом дочерняя клетка несет ту же самую информацию, что и материнская, следовательно выполняет те же самые функции. Итак, в клетках живого организма возможен особый тип реакции – матричный синтез. Одна молекула – матрица, а вторая строится по её программе. репликация ДНК синтез всех видов РНК и сборка молекул белка, в соответствии со структурой и-РНК – это все варианты матричного синтеза, который происходит всегда при участии нуклеиновых кислот.

По тому же самому механизму осуществляется сборка РНК, только не двух спиралей, а одной. Этот процесс получил название – транскрипция. Поток информации в клетке обеспечивает реакции матричного синтеза: репликация ДНК(необходима для передачи наследственной информации дочерним клеткам), транскрипция(синтез и-РНК в ядре клетки) и трансляция(сборка белковой цепи на и-РНК при помощи рибосомы). [4.,c.46]

  Казалось бы, что  на рубеже 70-х годов молекулярная  биология достигла определённой  степени завершенности: были установлены  структура и механизм репликации  ДНК, провозглашена «центральная  догма» экспрессии гена (транскрипция  и трансляция), выявлены основные аспекты регуляции активности гена. В этот период главным объектом молекулярно-генетических исследований были микроорганизмы. Переход к эукариотам(включая человека) встретился с дополнительными проблемами и трудностями, и кроме того, существовавшие в то время методы не позволяли рассчитывать на получение принципиально новых результатов. Стремительный порыв в развитии молекулярной генетики в начале 70-х годов стал благодаря появлению нового экспериментального инструмента – рестриктационных эндонуклеаз. Был открыт путь для широкомасштабного получения генных продуктов(физически значимых белков) и для генетического манипулирования с различными организмами. Наши знания о структуре генетического материала и эукариот, в разных областях таких: как действие гена, популяционная генетика, эволюция и генетическая консультация, включая пренатальную диагностику. Достигнутые успехи заставили ученых задуматься об этической стороне манипулирования с человеческим зародышем, об возникновения возбудителей различных болезней в процессе генно-инженерных исследований. Многие из этих вопросов были подняты самими учеными активно работающих в данной области. В настоящее время большинство исследователей считали, что опасения касающиеся, генной инженерии, не имеют достаточно оснований, но многие этические проблемы остаются нерешенными и продолжают возникать новые.

В прошлом генетика и  медицинская генетика развивалась  как относительно независимые отрасли  науки, теперь многие из их разделов оказались  вовлечённые в общее русло  молекулярно-генетических исследований, и провести между ними грань – трудно.

Сейчас, множество ученых заняты различными работами связанные  с проблемами генной инженерии –  это и методы, основанные на использовании  рестриктационных ферментов, анализ гена человека, методы гибридизации нуклеиновых кислот, секвенирование ДНК, сортировки хромосом при помощи цитофиурометрииии и многое, многое другое. Попытаюсь дать необходимые разъяснения по важнейшим работам из этого ряда.а

Начнём с условий, которым  должен соответствовать ген человека, что бы получить полную характеристику его структуры:

1) соответствующие фрагменты  ДНК должны быть идентифицированы  однозначно.

2) они должны быть  выделены и накоплены в количестве, должностном для биохимического  анализа.

3)  должна быть определена  вся нуклеотидная последовательность.

Принципы, на которых  основаны эти три метода, кратко будут описаны ниже. Мы начнем с  описания второго, поскольку прогресс в выделении и клонировании генов был решающим для развития новой генетики.  

 

 

Глава 2. Возможности генной  инженерии. 

 

Значительный прогресс достигнут в практической области  создания новых продуктов для  медицинской промышленности и лечения  болезней человека (табл.1).

Таблица 1.

Использование генно-инженерных продуктов в медицине.

Продукт	Природные продукты и  сфера применения генно-инженерных продуктов
Антикоагуляторы	Активатор тканевого  плазминогена (АТП), активирует плазмин. Фермент, вовлечённый в рассасывание тромбов; эффективен при лечении  больных инфарктом миокарда.
Факторы крови	Фактор VIII ускоряет образование  сгустков; дефицитен у гемофиликов. Использование фактора VIII, полученного  генно-инженерными методами, устраняет  риск связанный с переливанием крови.
Факторы стимулирующие  образование колоний	Ростовые факторы иммунной системы, которые стимулируют образование  лейкоцитов. Применяют для лечения  иммунодефицита и борьбе с инфекциями.
Эритропоэтин	Стимулирует образование  эритроцитов. Применяют для лечения  анемии у больных с почечной  недостаточностью.
Ростовые факторы	Стимулируют дифференциацию и рост различных типов клеток. Применяют для ускорения лечения ран.
Гормон роста человека	Применяют при лечении  карликовости.
Человеческий инсулин	Используется для лечения  диабета
Интерферон	Препятствует размножению  вирусов. Также используется для  лечения некоторых форм раковых  заболеваний.
Лейксины	Активируют и стимулируют  работу различных типов лейкоцитов. Возможно применение при залечивании  ран, при заражении ВИЧ, раковых  заболеваний, иммунодефиците.
Моноклональные антитела	Высочайшая специфичность  связанная с антителами используется в диагностических целях. применяют  также для адресной доставки лекарств, токсинов, радиоактивных и изотопных  соединений к раковым опухолям при  терапии раков, имеется много  других сфер применения.
Супероксид дисмутаз	Предотвращает поражение  тканей реактивными оксипроизводными в условиях кратковременной нехватки кислорода, особенно в ходе хирургических  операций, когда нужно внезапно восстановить ток крови.
Вакцины	Искуственно полученные вакцины (первой была получена вакцина  против гепатита В) по многим показателям  лучше обычных вакцин.

 

В настоящее время  фармацевтическая промышленность завоевала  лидирующие позиции в мире, что  нашло отражение не только в объёмах  промышленного производства, но и  в финансовых средствах, вкладываемых в эту промышленность (по оценкам  экономистов, она вошла в лидирующую группу по объёму купли-продажи акций на рынках ценных бумаг). Важной новинкой стало и то, что фармацевтические компании включили в свою сферу выведение новых сортов сельскохозяйственных растений и животных, и тратят на это десятки миллионов долларов в год, они же мобилизировали выпуск химических веществ для быта. Добавок к продукции строительной индустрии и так далее. Уже не десятки тысяч, а возможно, несколько сот тысяч высококвалифицированных специалистов заняты в исследовательских и промышленных секторах фарминдустрии, и именно в этих областях интерес к геномным и генно-инженерным исследованиям исключительно высок.

Очевидно поэтому любой  прогресс биотехнологий растений будет  зависеть от разработки генетических систем и инструментов, которые позволят более эффективно управлять трансгенами. Ситуация аналогична той, которая наблюдается  в компьютерной индустрии, где помимо увеличения объёмов обрабатываемой информации и улучшения самих компьютеров, нужны ещё и операционные системы управления информацией, типа микрософтовских “окон”.  

Для чистого вырезания  трансгенного ДНК в растительный геном, всё больше применяют заимствованные из микробной генетики системы гомологичной рекомбинации, такие как системы Cre-lox и Flp-frt. Будущее, очевидно, будет за управляемым переносом генов от сорта к сорту, основанного на применении предварительно подготовленного растительного материала, который уже содержит в нужных хромосомах участки гомологии, необходимого для гомологичного встраивания трангена. Помимо интегративных систем экспрессии, будут опробованы автономно реплицирующиеся векторы.осбый интерес представляют искуственные хромосомы растений, которые теоретически не накладывают никаких ограничений на объём вносимой теоретической информации. [7.,c.146]

Кроме этого учёные занимаются поиском генов, кодирующих новые  полезные признаки. Ситуация в этой области меняется радикальным образом, прежде всего, существованию публичных  баз данных, которые содержат информацию о большинстве генов, бактерий, дрожжей, человека и растений, а также в следствии разработки методов, позволяющих одновременно анализировать экспрессию большого количества генов с очень высокой пропускной способностью. Применяемые на практике методы можно разделить на две категории:

1. Методы, позволяющие вести экспрессионное профилирование: субстракционная гибридизация, электронное сравнение EST-библиотек, «генные чипы» и так далее. Они позволяют устанавливать корреляцию между тем или иным фенотипическим признаком и активностью конкретных генов.
2. Позиционное клонирование, заключается в создании за счет инсерционного мутагенеза мутантов с нарушениями в интересующем нас признаке или свойстве, с последующим клонированием соответствующего гена как такового, который заведомо содержит известную последовательность (инсерция).

Вышеназванные методы не предполагают ни каких изначальных  сведений о генах, контролирующих тот  или иной признак. Отсутствие рационального  компонента в данном случае является положительным обстоятельством, поскольку  неограничен нашими сегодняшними представлениями о природе и генном контроле конкретного интересующего нас признака.

Кроме всего этого  группа ученых, таких как Марк Адам (ведущий сотрудник института  геномных исследований в штате Мэриленд – США,  частной исследовательской  компании, занимающейся исключительной работой в области картирования генов), Крэйк Вентер (директор этого института) и соавторами, разрабатывается проект «Геном человека». Цель этого проекта заключается в выяснении последовательности оснований во всех молекулах ДНК в клетках человека. Одновременно должна быть установлена локализация всех генов, что помогло бы выяснить причину многих наследственных заболеваний и этим открыть пути к их лечению. Что бы последовательно приближаться к решению проблемы картирование генов человека, было сформулировано пять основных целей:

1. Завершить составление детальной генетической карты, на которой были бы помечены гены, отстоящие друг от друга на расстоянии не превышающем в среднем 2 млн. оснований (1 млн. оснований принято называть мегобазой);
2. составить физические карты каждой хромосомы (разрешение 0.1 Мб);
3. получить карту всего генома в виде охарактеризованных клонов (5 тыс. оснований в клоне или 5 Кб);
4. завершить к 2004 году полное секвенирование ДНК (разрешение одного основание);
5. нанести на полностью завершенную секвенсовую карту все гены человека (к 2005 году).

Ожидалось, что, когда  все указанные цели будут постигнуты, исследователи определят все  функции генов и разработают  методы биологического и медицинского применения полученных данных.

Рассмотрев темпы ускорения  работы в рамках проекта «Геном человека», руководители этого проекта объявили 23 октября 1998г., что программа будет полностью завершена гораздо раньше, чем планировалось, и сформулировали «Новые задачи проекта «Геном человека»:

1. полностью завершить в декабре 1998 года работу по секвенирование генома «Круглого червя» c. elegans (это было сделано в срок);
2. закончить предварительный анализ последовательности ДНК человека к 2001 году, а полную последовательность к 2003 году;
3. картировать к 2002 году геном плодовой мухи;
4. начать секвенирование генома мыши с использованием методов ДНК искусственных хромосом дрожжей (завершить этот проект к 2005 году). [5.,c.51]

 

Помимо этих целей, официально включен в поддерживаемый правительством США и рядом других правительств проект, некоторые исследовательские  центры объявили о задачах, которые  будут решаться в основном за счет частных фондов и пожертвователей. Так, ученые калифорнийского университета (Беркли), Орегонского университета и Ракового исследовательского центра имени Фрейда Хатчинсона начали программу «Геном собаки».

Международное общество секвенирование в феврале 1996 года приняло  решение о том, что любая последовательность нуклиотидов размером 1-2 Кб должна быть обнародована (через Интернет) в течение 24 часов после ее установления.

 

 

Глава 3. Перспективы клонирования животных

 

Идея клонирования животных, т.е. получение генетически идентичных копий, родилась благодаря успешным экспериментам по пересадке ядер дифференцированных клеток в энуклеированные  яйцеклетки или ооциты, выполненным  на амфибиях. Цель этих экспериментов  была сугубо теоретическая - выяснить вопрос, способно ли ядро (геном) дифференцированной клетки к репрограммированию и восстановлению тотипотентности, т.е., будучи помещенным в цитоплазму яйца, способно ли оно обеспечить полное развитие подобно оплодотворенной яйцеклетке. Фактически речь шла о возможности обратимости эмбриональной дифференцировки и выяснению вопроса: претерпевает ли геном в процессе развития необратимые изменения или модификации? Успешные опыты J.Gurdon и его сотрудников, показавшие возможность развития взрослых амфибий из реконструированных яйцеклеток после трансплантации в них ядер из клеток эпителия кишечника плавающей личинки (головастика), были интерпретированы как убедительное доказательство, что геном дифференцированных клеток способен к репрограммированию в цитоплазме яйцеклетки и восстановлению тотипотентности, подобно оплодотворенному яйцу. Из этих результатов логично вытекало, что используя технику трансплантации ядер из соматических клеток взрослых особей в энуклеированные яйца или ооциты, можно получать генетические копии животного, служившего донором ядер дифференцированных клеток. Безусловно, клонирование животных открывало бы заманчивые перспективы для генетического копирования животных, прежде всего сельскохозяйственных, тех, которые имеют те или иные выдающиеся показатели продуктивности.

Однако первые попытки применить  описанный выше подход для клонирования млекопитающих были безуспешными и  даже скандальными. Сенсационные результаты Illmensee по рождению мышей, развившихся  после пересадки кариопластов из разных частей предимплантационных  эмбрионов мыши в энуклеированные яйца, не были подтверждены другими исследователями. Эти результаты вызвали еще большие сомнения после заявления лаборанта Illmensee, что результаты опытов Illmensee были фальсифицированы. В начале 80-х годов эксперименты по трансплантации ядер дифференцированных клеток в энуклеированные яйца или ооциты показали, что у мышей тотипотентность утрачивается после 2-го деления-дробления. Другой экспериментальный подход для изучения тотипотентности эмбрионов был основан на разделении бластомеров на ранних стадиях развития (до 16-клеточной стадии) и независимой их трансплантации приемным матерям. Результаты этих экспериментов показали, что у мышей тотипотентность утрачивается после 4-клеточ-ной стадии, хотя у овец такая потеря происходит на более поздней стадии развития (после 16-клеточной стадии). Открытие импринтинга и его существенной роли в развитии млекопитающих сделало еще более проблематичной возможность клонирования млекопитающих, поскольку выяснилось, что материнский и отцовский геномы имеют разный вклад в нормальное развитие эмбриона, причем эти функциональные различия родительских геномов формируются в процессе овогенеза и сперматогенеза, импринтируются и реализуются в течение всего онтогенеза. [7.,c.22]

Тем не менее, исследования тотипотентности  и плюрипотентности в эмбриональном  развитии продолжались с использованием новых экспериментальных подходов. Уже в конце 80-х годов стало  очевидным, что ооцит на стадии М2 (второе меойтическое деление) обладает факторами, способными репрограммировать геном клеток, полученных из внутренней клеточной массы бластоцисты после их трансплантации в энуклеированный ооцит М2. Здесь следует отметить значительный вклад в разработку этой техники шотландской группы исследователей под руководством Ian Wilmut и американских исследователей Keefer, Mathews и First. В 1996 г. вышли две публикации по успешному рождению ягнят и развитию эмбрионов коров до 80-85 дней беременности в экспериментах по трансплантации кариопластов, полученных из клеток культуры эмбриональных стволовых клеток, в энуклеированные ооциты М2 (Campbell et al., 1996; Keefer et al., 1996). По-видимому, эти успехи подтолкнули Ian Wilmut и его коллег попытаться использовать в качестве доноров ядра (кариопласты) дифференцированных клеток, взятых от эмбрионов или взрослых животных. Результатом этих экспериментов явилось рождение Dolly, овцы, развившейся из ооцита М2, у которого было заменено собственное ядро на ядро клетки из культуры эпителиальных клеток, полученной из молочной железы взрослой лактирующей овцы. Вне всяких сомнений, это выдаюшийся успех в клонировании животных. Впервые предложен, хотя и сложный в техническом отношении, способ получения генетических копий млекопитающих. Несомненно также и то, что клонирование станет сильнейшим стимулом для развития нового направления в биотехнологии животных и откроет широкие возможности в селекции сельскохозяйственных животных.

В теоретическом плане работа группы Ian Wilmut показала, что в процессе развития геном не претерпевает каких-либо необратимых изменений, по крайней мере, в части высокодифференцированных соматических клеток. Более того, возможно репрограммирование генома соматических клеток путем трансплантации его в цитоплазму ооцита М2. Фактически это исследование заложило теоретическую базу клонирования животных, хотя здесь имеется много неясностей и нужны дополнительные экспериментальные исследования.

Уместно в этом контексте упомянуть  недавние результаты, полученные в  лаборатории генетических основ  онтогенеза Института цитологии и генетики СО РАН. Здесь были впервые получены гибридные клетки путем слияния высокоплюрипотентных стволовых эмбриональных клеток с клетками селезенки взрослой мыши. Некоторые клоны гибридных клеток имели нормальный диплоидный набор хромосом и дополнительную Х-хромосому, происходящую из высокодифференцированной клетки. В экспериментах по микроинъекциям гибридных клеток в полость бластоцисты была получена серия химерных животных, что показало сохранение высокой плюрипотентности в гибридных клетках. Однако самым впечатляющим результатом этих опытов было обнаружение функциональной "соматической" Х-хромосомы (происходящей от дифференцированной клетки) в разных тканях и органах химер. Показана возможность репрограммирования индивидуальной хромосомы, происходящей от дифференцированной клетки, при введении ее в геном плюрипотентных эмбриональных клеток. Иными словами, получены сходные данные по обратимости дифференцировки на уровне индивидуальных хромосом генома дифференцированной клетки, подобно реактивации целого генома в опытах Ian Wilmut. Другим следствием этого исследования является возможность переноса индивидуальных хромосом от одного животного в геном другого этого же или близкого вида. Таким образом, открывается перспектива использовать плюрипотентные гибридные клетки в качестве носителей-векторов для переноса индивидуальных хромосом между животными и создавать уникальные генотипы, не существующие в природе, поскольку их невозможно получить обычным половым путем.

 

Заключение.

 

Главная стратегическая задача будущего сформулирована следующим  образом: изучить однонуклеотидные вариации ДНК в разных органах  и клетках отдельных индивидуумов и выявить различия между индивидуумами. Анализ таких вариаций даст возможность  не только подойти к созданию индивидуальных генных портретов людей, что в частности даст возможность лечить болезни, но  и определить различия между популяциями. А также выявлять географические районы повышенного риска, что поможет давать чёткие рекомендации о необходимости очистке территории от загрязнения и выявить производства, на которых есть большая опасность поражение геномов персонала.  

Эта грандиозная задача рождает не одни радужные ожидания всеобщего блага, но и вполне осознанную тревогу юристов и борцов за индивидуальные права человека. Так, в частности, высказываются возражения против распространения персональной информации без решения тех, кого она касается. Один пример помогает понять эти тревоги: уже сейчас страховые компании нацелились на добывание таких сведений правдами и неправдами, они намериваются использовать данные против тех, кого они страхуют. Например, если подающий на страховку несёт потенциально болезнетворный ген, компании не хотят страховать таких людей вовсе или же пытаются заломить бешенные суммы за их страховки. Исходя из этого, .конгресс США уже принял ряд законов, направленный на строгий запрет распространения генетической информации относительно отдельных людей, юристы всего мира интенсивно работают в данном направлении.   

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Литература.

 

1. В. Азерников. Концепции современного естествознания. Москва, 1998г.
2. Н. Н. Воронцов, Л. Н. Сухорукова. Концепции современного естествознания. Москва, 2001г.
3. Л. Я. Кулинич. Концепции современного естествознания. Москва, 1999г.
4. Б. М. Медников. Концепции современного естествознания. Москва, 1999г.
5. Э. Рис, М. Стернберг. Генетика. Москва, 1998г.
6. А. С. Трошин, А. Д. Браун, Ю. Б. Вахтин, Л. Н. Жинкин,  
   К. М. Суханова. Генная инженерия. Москва, 2003г.
7. Дубнищева А.С. Концепции современного естествознания. Москва, 2002г.