Использование аффинной хромотографии для оценки качества полимеров на основе природного сырья

Министерство  образования и науки Российской федерации

Федеральное государственное бюджетное образовательное  учреждение высшего профессионального  образования

Омский государственный  технический университет

Кафедра: «Биотехнология»

Домашняя  работа по теме:

«Использование  аффинной хромотографии для оценки качества полимеров на основе природного сырья»

Омск 2012

Содержание:

Введение…………………………………………………………………..3

1.Принцип  метода аффинной хроматографии,  историческая справка и применение………………………………………………………………………4

2.Примеры  применения аффинной хроматографии…………………..10

2.1.Полусинтетическая нуклеаза и комплементарное взаимодействие нуклеотидных фрагментов…………………………12

Список  используемой литературы…………………………………..16 
Введение

Макромолекулы, такие, как белки, полисахариды и нуклеиновые кислоты, внутри своих индивидуальных групп отличаются по физико-химическим свойствам лишь незначительно; поэтому их выделение, основанное на различиях в этих свойствах, например, с помощью ионообменной хроматографии, гель-фильтрации или электрофореза сопряжено с известными трудностями и требует много времени. Вследствие этого в ходе выделения существенно падает их активность из-за денатурации, расщепления, ферментативного гидролиза и т. п. Одним из наиболее характерных свойств этих биологических макромолекул является их способность обратимо связывать другие вещества. Например, ферменты образуют комплексы с субстратами или ингибиторами, антитела - с антигенами, а нуклеиновые кислоты, такие, как информационная РНК, гибридизуются с комплементарными ДНК и т. д. Образование специфических диссоциирующих комплексов биологических макромолекул служит основой метода их очистки, известного как аффинная хроматография.

1. Принцип метода аффинной хроматографии, историческая справка и применение

Аффинная  хроматография (или, более точно, биоаффинная  или биоспецифическая по сродству хроматография) основана на исключительной способности  биологически активных веществ связывать  специфически и обратимо другие вещества, называемые в общем случае лигандами  или аффинными лигандами, или  упрощенно аффинантами.

Если приготовить нерастворимый аффинант (обычно это делают путем ковалентной привязки к нерастворимой подложке) и раствор, содержащий биологически активные продукты, которые необходимо выделить, пропустить через колонку с этим аффинантом, то все соединения, которые в данных условиях эксперимента не обладают сродством к аффинанту, будут проходить не задерживаясь, а продукты, обнаруживающие сродство к нерастворимому аффинному лиганду, будут сорбироваться на колонке. Последние могут быть освобождены далее из комплекса с иммобилизованным лигандом, например, с помощью раствора растворимого аффинанта или путем изменения состава растворителя. Диссоциация комплекса часто может быть достигнута изменением рН, ионной силы или температуры либо с помощью специфических агентов, как это будет показано далее. Согласно О'Карра и др, следует различать биоспецифическую десорбцию и небио- специфическую десорбцию с помощью так называемых «деформирующих буферов», как показано схематически на рис.

Рис.1. Схема биоспецифической адсорбции (Л), элюирования «деформирующим» буферным раствором (Б) и биоэлгоирования растворимым конкурентным лигандом (В).

 Инг — иммобилизованный ингибитор; L — конкурентный лиганд.

Аффинная хроматография  как метод, по-видимому, впервые была применена Штаркенштайном в 1910 г. для выделения α-амилазы с помощью нерастворимого субстрата (крахмала). Принцип аффинной хроматографии, использующий аффинанты, ковалентно связанные с нерастворимой матрицей, известен более 20 лет. Кемпбелл и др, были, вероятно, первыми (1951 г.), в чьих работах этот принцип получил практическое приложение для выделения антител на колонке с целлюлозой с ковалентно присоединенным антигеном. Для выделения ферментов аффинная хроматография впервые была применена в 1953 г. Лерманом, который выделил тирозиназу на колонке с целлюлозой, эфирно связанной с остатками резорцина. В последующие годы аффинная хроматография использовалась весьма редко, что очевидно, обусловлено свойствами известных в то время нерастворимых подложек, которые ограничивали возможности образования комплексов между выделяемыми продуктами и присоединенными аффинантами. На подложках с гидрофобными или ионогенными группами часто наблюдалась неспецифическая сорбция.

Однако  наблюдается широкое развитие метода. Толчком послужило открытие Поратом  присоединения аффинанта к агарозе, активированной бромцианом.

        Куатреказас и Анфинсек показали, что агароза (наиболее распространенная продажная форма сефарозы) обладает почти всеми характеристиками идеального носителя. В 1968 г. Куатреказас и др. успешно применили аффинную хроматографию для выделения нуклеазы, химотрипсина и карбоксипептидазы А и предложили термин «аффинная хроматография». Далее развитие метода шло в основном в направлении его применения для выделения ферментов, их ингибиторов, антител и антигенов, нуклеиновых кислот, транспортных и репрессорных белков, гормонов и их рецепторов и др.

Использование аффинной хроматографии тем не менее  не ограничивается только выделением биологически активных веществ. Уже  в 1960 г. Яги и др. описали определение  небольших количеств антител  с помощью нерастворимых носителей  с привязанными антигенами. Иммобилизованные олигомеры политимидиловой кислоты использовали Эдмондс и др. для количественного определения полиадениловой кислоты. Аффинная гель-фильтрация как микрометод при экспрессных определениях молекулярных масс дегидрогеназ основана на исключении последних из гелевой среды с варьируемым размером пор; метод описан Лоу и Дином.

По своей сути аффинная хроматография - идеальный метод  для изучения взаимодействий в биохимических  процессах. Иммобилизованная лейцил-тРНК-синтетаза  использована как для выделения  изолейцил-тРНК, так и для изучения взаимодействия белка с нуклеиновой  кислотой. Взаимодействия пептидов с  белками и нуклеотидов с аминокислотами и пептидами также изучены этим методом.

Рис.2. Элюирование изоферментов лактатдегидрогеназы вогнутым градиентом NАDН.

0,2 мл образца белка  (0,2 мг) в растворе, содержащем 0.1 М  Na-фoсфатный буфер (рН~7.0), 1 мМ β-меркаптоэтанол и 1 М хлорид натрия, нанесены на колонку зой со связанным аналогом АМР <140x8 мм, содержащую 2,5 г влажного геля), уравновешенную 0.1 М Nа-фосфатным буфером (рН~7,5); затем колонка промыта 10 мл используемого буферного раствора, изоферменты элюированы вогнутым градиентом NADН (от 0,0 до 0.3 ммоль/л) в буферном растворе 1 мМ β-меркаптоэтанола. Объем фракция 1 мл; скорость потока 3,4 мл/ч.

Кроме того, метод применен для исследования механизмов ферментативных процессов и выяснения структур молекул. Аканума и др применили его для изучения связывающего участка бычьей карбоксипептидазы В, исследуя комплексообразование с иммобилизованными субстратными аналогами основных и ароматических аминокислот. Используя аффинную хроматографию, Дилени и О'Карра показали, что оксалоацетат ингибирует лактатдегидрогеназу путем образования тройного непродуктивного комплекса с комплексом фермент – NAD⁺, а не с комплексом фермент - NАDН, как предполагалось первоначально. Аффинная хроматография оказалась весьма полезной при изучении кинетики активации трипсиногена. Молекулярная структура интерферонов фибробластов и лейкоцитов человека изучена с помощью аффинной хроматографии Янковским и др.

Для разделения изоферментов лактатдегидрогеназы  Броделиус и Мосбах использовали сефарозу с присоединенными аналогами АМР; при элюировании растворами с возрастающей концентрацией NАDН получены пять пиков изоферментов (рис.2). Разделение достигается благодаря различиям в константах диссоциации К_дис двойного комплекса фермент - NАDН. Позднее Броделиус и Мосбах аналогичным образом хроматографировали ряд лактатдегидрогеназ нз различных источников, константы которых известны.

Рис. 3. Зависимость константы диссоциации бинарных комплексов фермент - NADН.

Лактатдегидрогеназы: 1 - Н₄ быка; 2 - Н₄ свиньи; 3 - М₄ быка; М₄ — кролика; 6 — М₄ свиньи.

Рис. 3. иллюстрирует прямую пропорциональность К_дис от элюирующей концентрации NADН. Линейность указывает, что в данном случае константы диссоциации комплексов фермент - NADН играют более важную роль, чем константы диссоциации комплексов фермента с иммобилизованным аффинным лигандом (АМР). Таким образом, появилась возможность определения констант диссоциации двойных комплексов фермента с NADН; метод основан на установлении элюирующих концентраций NADН. Не обнаружено различий в величинах К_дис при использовании как кристаллических, так и неочищенных препаратов ферментов. Другие белки, присутствующие в неочищенных препаратах, даже если они связывались колонкой, не влияли на картину элюирования. Это обстоятельство создает огромное преимущество таких определений по сравнению с обычными методами определения констант диссоциации, которые требуют не только чистых ферментов, но также и гомогенных изоферментов. Другим преимуществом является большая быстрота и расход очень небольших количеств фермента для каждого определения.

Использование аффинной хроматографии для определения, например, констант ингибирования ферментов, по-видимому, весьма перспективно. Данные об объемах элюатов, содержащих фермент, на колонке с иммобилизованным ингибитором, полученные при использовании различных концентраций ингибитора в растворе, позволяют определить константы ингибирования как для связанного ингибитора, так и для ингибитора в растворе. Большое преимущество этого метода состоит в том, что при использовании одного и того же ингибитора как для иммобилизации, так и для элюирования можно непосредственно сделать выводы о влиянии связей с носителем и природы носителя на изучаемое взаимодействие на основании совпадения или различий в определяемых величинах констант диссоциации. Следовательно, метод аффинной хроматографии открывает новые возможности не только для изучения взаимодействия биологически активных веществ, он перспективен также и для выяснения влияния микроокружения на образование этих комплексов.

2. Примеры применения аффинной хроматографии

Области применения аффинной хроматографии расширяются, поскольку метод основан на специфических  взаимодействиях биологически активных веществ. Этот метод успешно используется при выделении самых разных соединений. Наряду с этим он полезен при изучении различных систем; на аффинных сорбентах  можно разделять низкомолекулярные  энантиомеры и удалять нежелательные  вещества из живых организмов. Например, аффинной хроматографией можно разделить  на оптические антиподы D, L-триптофан. Используя специфическое выделение меченых пептидов, можно определить пептиды активного центра фермента, связывающего участка антител или участка пептидных цепей на поверхности молекулы. Аффинная хроматография может быть использована для изучения возможности замены природных пептидных цепей ферментов различными модифицированными синтетическими пептидами. Активные центры ферментов или антител, связывающие свойства субъединиц, специфичность ферментов по отношению к различным ингибиторам, комплементарность нуклеиновых кислот, взаимодействие нуклеотидов с пептидами, влияние присутствия различных соединений на образование специфических комплексов и т. д. могут быть исследованы с помощью аффинной хроматографии.

Проблемы  механизма ферментативной активности могут быть изучены на основании  данных аффинной хроматографии. Такие  данные позволяют высказать суждение о молекулярных структурах, например, интерферонов фибробластов или лейкоцитов. Исследовались также возможности аффинной хроматографии для удаления нежелательных веществ из крови живых организмов.

Области применения аффинной хроматографии многочисленны  и разнообразны и не ограничиваются только теми, которые перечислены выше. В последующих разделах рассмотрены некоторые примеры, иллюстрирующие возможности аффинной хроматографии.

Колоночная  хроматография с использованием иммобилизованного бычьего сывороточного альбумина, присоединенного непосредственно к сефарозе 4В, сывороточного альбумина, присоединенного к сукциниламиноэтилагарозе, или обезжиренного сывороточного альбумина (по методу Чена, рис.4), присоединенного также к сукциниламиноэтилагарозе, привела к наилучшим результатам только в последнем случае.

Рис.4. Хроматография D, L-триптофана на препарате обезжиренный бычий сывороточный альбумин-cукциниламиноэтилагароза (250x9 мм).

D, L Триптофан (500 нмоль), растворенный в 0,1 мл 0,1 М боратного буфера (рН 9,2), содержащего 1 об. % диметилсульфоксида. наносился на колонку (содержащую 630 нмоль бычьего сывороточного альбумина). Колонка элюнровалась со скоростью 30 мл/ч боратным буфером (без диметилсульфоксида) (пробы отбирались в 20 пробирок), а затем 0,1 М уксусной кислотой. Свободный объем был определен по элюированию диметилсульфоксида.

Ход хроматографического  разделения иллюстрирует рис.4. Показано, что боратным буфером элюируется только D-триптофан, в то время как уксусной кислотой только L-триптофан. Аффинная хроматография, по-видимому, может быть применена для аналогичного разделения и других энантиомерных пар.

2.1 Полусинтетическая нуклеаза и комплементарное взаимодействие нуклеотидных фрагментов

Стафилококковая нуклеаза - фермент, исследованный с  помощью аффинной хроматографии наиболее широко. Успешное выделение нуклеазы на сефарозе с присоединенным 3-(4-аминофенилфосфорил)дезокситимидин-5'-фосфатом (pdТр-сефарозе) описано еще в 1968 г. Используя хроматографию триптического гидролизата нуклеазы, меченной (дезокситимидин-3',5'-дифосфатаминофенил) дезокситимидин-3-[¹⁴С]бромацетил-n-аминофенилфосфатом на сефарозе с присоединенной нуклеазой, Вилчек получил пептиды активного центра фермента.

Рис.5. Диаграмма линейной зависимости между аминокислотными последовательностями нуклеазы и ее фрагментами, которые дают продуктивную комплементарность. Рентгеноструктурными исследованиями были показаны β-структура между остатками 12 и 35 и три α-спиральных участка между остатками 55 и 67, 99 и 106, а также 122 и 133, которые отмечены на рисунке. Нуклеаза- (127-149) не связывается с нуклеазой-(1-126).

Проведя триптический гидролиз нуклеазы в присутствии  Са²⁺ и нуклеозид-3',5'-дезокситимидиндифосфата (рdТр), Онтьес и Анфинсен получили три фрагмента: пентапептид и два полипептидных фрагмента - нуклеаза-Т-(6-48) и нуклеаза-Т-(49-149) (рис.5). Последние (оба фрагмента) были неактивными и не имели упорядоченной структуры, будучи взятыми в отдельности, но они обратимо ассоциировали с образованием нековалентно связанного комплекса, названного нуклеазой-Т'. Нуклеаза-Т' обладает 8% (1620 ед./мкмоль) активности нативного фермента (15 800 ед./мкмоль), и ее трехмерная структура близка структуре нуклеазы. Такие же результаты были получены даже при замене нативного фрагмента нуклеаза-Т-(6-48) аналогичным пептидом, синтезированным по методу Меррифилда. Аффинная хроматография вновь оказалась весьма полезной и для очистки этого синтетического 42-членного пептида. Синтетический продукт очищался на сефарозе с присоединенным фрагментом нуклеаза-Т-(49-149). Прежде всего предварительно небольшие количества нативного фрагмента нуклеаза-Т-(6-48) хроматографировались на этой же колонке. Сорбция происходила при рН~8 в присутствии хлорида кальция и рdTр (необходимых для стабилизации комплекса). Нативный фрагмент затем элюировался разбавленной уксусной кислотой (рН~3), т. е. в условиях, когда комплекс диссоциирует. Согласно предварительным результатам, предложена следующая методика очистки синтетического фрагмента. На колонку (5x1 см) наносили 5 мг синтетического пептида в 0,05 М боратном буфере (рН~8), содержащем 0,01 моль/л хлорида кальция и 0,001 моль/л pdТр. При промывании исходным буфером элюировалось некоторое количество пептида, имеющего состав и подвижность при диск-электрофорезе нативного пептида-(6-48). Однако этот элюируемый пептид не сорбировался на колонке даже при повторной хроматографии. Около 7% общего количества нанесенного синтетического пептида элюировалось 0,001 М уксусной кислотой (рН~3). Эта часть не отличалась существенно по своему аминокислотному составу от исходного материала. Пептидный фрагмент, содержащийся в элюате, затем использовался для комплементарного комплексообразования с фрагментами нуклеаза-Т-(49-149) для полной замены нативного пептида. Таким образом была получена полусинтетическая нуклеаза.

Еще одним примером продуктивного комплементарного комплексообразования является комплекс двух других фрагментов той же нуклеазы, а именно комплекс, образованный нуклеазой-(1-126), приготовленной ограниченным триптическим гидролизом трифторацетилированной нуклеазы, и бромциановым фрагментом нуклеазы-(99-149). Этот комплекс обладает 10-12% ферментативной активности нативной нуклеазы. Оба упомянутые комплексы связывались с pdТр-сефарозой.

На  pdTр-сефарозе была связана смесь трех фрагментов: 0,085 мкмоль нуклеазы-Т-(6-48), 0,060 мкмоль нуклеазы-Т-(49, 50-126) [нуклеаза-Т-(49, 50-126) представляет собой смесь пептидов - нуклеазы-Т-(49-126) и нуклеазы-Т-(50-126)], 0,067 мкмоль нуклеазы-(99-149) в присутствии 0,01 моль/л хлорида кальция в 0,2 мл 0,1 М ацетата аммония (рН~8) при 4, 10, 15 и 20 °С наносились на колонку (4x1 см) с рdТр-сефарозой. Количество комплекса, элюируемого 0,1 М уксусной кислотой, сильно зависит от температуры; оно максимально при 4°С и снижается с повышением температуры. На основании аминокислотного анализа и двумерных пептидных карт триптического гидролизата показано, что элюируемый комплекс состоит из эквимолярных количеств нуклеазы-Т-(6-48), нуклеазы-Т-(49, 50-126) и нуклеазы-(99-149). Удельная активность комплекса 15,3 ед./мкмоль. Уменьшение сорбции комплекса, наблюдаемое при росте температуры, может объясняться ухудшением комплексобразования или снижением сродства аффинного лиганда к комплексу, которое обусловлено термической неустойчивостью ферментативной активности трехфрагментного комплекса. При аффинной хроматографии любой комбинации двух из трех упомянутых выше фрагментов не происходит существенной сорбции даже при 4°С. При этой температуре не наблюдалась также сорбция трех фрагментов в отсутствие хлорида кальция или при нанесении смеси фрагментов нуклеазы-(1-120) и нуклеазы-(127-149).

Эти результаты показывают, что аффинная хроматография  может стать также важным методом изучения комплементарного образования комплексов пептидных фрагментов активных белков, приготовленных путем выделения из природного материала или синтетически.