ОГЛАВЛЕНИЕ 
 

Вопрос № 30

     Способы культивирования микроорганизмов. Поверхностное и глубинное, периодическое и непрерывное культивирование.

     Ответ:

     Существует  два способа культивирования  микроорганизмов – продуцентов  ферментов: поверхностный и глубинный.

     Первый  способ, применяемый для культивирования  микроскопических грибов, характеризуется  развитием мицелия на поверхности твердого или жидкого субстрата. На жидком субстрате образуется пленка мицелия, продуцирующего не только амилолитические ферменты, но и органические кислоты, инактивирующие их, поэтому используют твердые субстраты с развитой поверхностью – пшеничные отруби, дробину барды, картофельную мезгу и др.

     Максимальная  активность ферментов достигается  при культивировании грибов на пшеничных  отрубях. При поверхностном культивировании  пшеничные отруби должны быть увлажнены  и простерилизованы. В стерильных условиях готовят посевную культуру, но выращивают грибы в нестерильных условиях в кюветах, устанавливаемых в негерметичных камерах. Теплоту, выделяющуюся в процессе роста грибов, удаляют продуванием через растильную камеру стерильного кондиционированного воздуха.

     Поверхностный способ выращивания микроскопических грибов имеет ряд преимуществ. Так  как во время роста гриба отруби не перемешиваются, посторонние микроорганизмы не распространяются по всей их массе  и вызывают лишь незначительное местное инфицирование, которое, как правило, не влияет на активность ферментов. Однако все же необходимо стерилизовать воздух, среды и оборудование.

     Недостаток  поверхностного способа – необходимость  устанавливать множество кювет, работу с которыми трудно механизировать. Себестоимость культуры гриба-продуцента высока, причем в основном из-за затраты большого количества ручного труда. Механизация процесса выращивания возможна путем создания непрерывнодействующих установок, или бескюветных аппаратов с вертикальным толстым слоем питательной среды и интенсивным продуванием воздуха через этот слой.

     Глубинную культуру микроорганизмов выращивают на жидкой питательной среде при  энергичной аэрации в герметически закрытых аппаратах и в стерильных условиях. Процесс полностью механизирован. Стерильность глубинной культуры микроорганизма-продуцента ферментов положительно отражается на результатах сбраживания сусла дрожжами.

      Известны  следующие способы глубинного культивирования: периодический, непрерывно-циклический и непрерывно-проточный.

      Периодический способ характеризуется несменяемостью питательной среды в ферментере, состав которой в процессе развития постепенно изменяется. Процесс протекает по-стадийно: в ферментер набирают питательную среду и задают посевной материал; после размножения микроорганизмов и накопления продуктов их обмена зрелую культуру выгружают, а все оборудование, коммуникации и запорные устройства промывают, а затем стерилизуют паром.

      При непрерывноциклическом способе микроорганизмы, расположенные на неподвижной насадке в ферментере, омываются средой, протекающей в замкнутом контуре, до полного потребления ими питательных веществ. После этого зрелую культуру выгружают, начиная с последнего, аппараты промывают, стерилизуют и цикл повторяют с последнего головного ферментера. Богатая питательными веществами среда в ходе такой циклической ферментации постепенно истощается; по времени пребывания среды в зоне реакции этот процесс более продолжителен, чем периодический.

      Непрерывно-проточный способ культивирования микроорганизмов более совершенен. Суть его заключается в том, что микробная популяция развивается в проточной питательной среде. Способ имеет две разновидности: гомогенно-непрерывный и градиентно-непрерывный. В первом случае выращивание ведут в одном ферментере; при тщательном перемешивании среды и аэрации обеспечивается одинаковое состояние культуры во всем объеме жидкости. В ферментер при этом непрерывно поступает свежая среда, а из него также непрерывно вытекает избыток зрелой культуральной жидкости.

      Градиентно-непрерывное  культивирование осуществляют в  батарее ферментеров, соединенных  переточными трубами. Засеянная среда с большим содержанием углеводов и других ингредиентов непрерывно перетекает из одного ферментера в другой и также непрерывно вытекает в виде готовой культуры.

      Непрерывным культивированием в проточных средах можно выращивать микроорганизмы в  условиях, оптимальных для их стадии развития. При этом такие важные факторы, как концент-

     рация питательных веществ, количество продуктов обмена, рН, содержание растворенного кислорода, резко изменяющиеся при периодическом способе культивирования, поддерживаются постоянными на заданном уровне или изменяются по разработанной программе.

      Способы непрерывного культивирования в  производстве ферментных препаратов для спиртового производства еще находятся в стадии производственных испытаний. Поэтому, к сожалению, в настоящее время на заводах до сих пор применяют периодическое культивирование микроорганизмов.

Вопрос  № 37

     Взаимосвязь микроорганизмов с окружающей средой. Классификация факторов внешней среды (экологических факторов), влияющих на микроорганизмы. Что понимается под понятиями «Гибель микроорганизмов», «реактивация», «мутагенное», «бактерицидное» действие.

     Ответ:

     Все существующие микроорганизмы живут в непрерывном взаимодействии с внешней средой, в которой они находятся, поэтому подвергаются разнообразным влияниям. В одних случаях они могут способствовать лучшему развитию, в других подавлять их жизнедеятельность. Необходимо помнить, что изменчивость и быстрая смена поколений позволяет приспосабливаться к разным условиям жизни. Поэтому быстро закрепляются новые признаки.

     Находясь  в процессе развития в тесном взаимодействии со средой, микроорганизмы не только могут  изменяться под её воздействием, но могут изменять среду в соответствии с особенностями. Так микробы в процессе дыхания выделяют продукты обмена, которые в свою очередь изменяют химический состав среды, поэтому меняется реакция среды и содержание различных химических веществ.

     Все факторы, влияющие на развитие микробов, делят на:

• Физические
• Химические
• Биологические

     Ниже  подробнее рассмотрим каждый из факторов.

     1. Физические факторы 

     Температура

     По  отношению к температурным условиям микроорганизмы разделяют на термофильные, психрофильные и мезофильные.

• Термофильные виды. Зона оптимального роста равна 50-60°С, верхняя зона задержки роста - 75°С. Термофилы обитают в горячих источниках, участвуют в процессах самонагревания навоза, зерна, сена.
• Психрофильные виды (холодолюбивые) растут в диапазоне температур 0-10°С, максимальная зона задержки роста 20-30°С. К ним относит большинство сапрофитов, обитающих в почве, пресной и морской воде. Но есть некоторые виды, например, иерсинии, психрофильные варианты клебсиелл, псевдомонад, вызывающие заболевания у человека.
• Мезофильные виды лучше растут в пределах 20-40°С; максимальная 43-45°С, минимальная 15-20°С. В окружающей среде могут переживать, но обычно не размножаются. К ним относится большинство патогенных и условно-патогенных микроорганизмов.

     Высокая температура вызывает коагуляцию структурных  белков и ферментов микроорганизмов. Большинство вегетативных форм гибнет при температуре 60°С в течение 30 мин, а при 80-100°С – через 1 мин. Споры бактерий устойчивы к температуре 100°С, гибнут при 130°С и более длительной экспозиции (до 2 ч.).

     Для сохранения жизнеспособности относительно благоприятны низкие температуры (например, ниже 0°С), безвредные для большинства  микробов. Бактерии выживают при температуре  ниже –100°С; споры бактерий и вирусы годами сохраняются в жидком азоте (до –250°С).

     Влажность

     При относительной влажности окружающей среды ниже 30% жизнедеятельность  большинства бактерий прекращается. Время их отмирания при высушивании  различно (например, холерный вибрион  – за 2 суток, а микобактерии – за 90 суток). Поэтому высушивание не используют как метод элиминации микробов с субстратов. Особой устойчивостью обладают споры бактерий.

     Широко  распространено искусственное высушивание  микроорганизмов, или лиофилизация. Метод включает быстрое замораживание с последующим высушиванием под низким (вакуумом) давлением (сухая возгонка). Лиофильную сушку применяют для сохранения иммунобиологических препаратов (вакцин, сывороток), а также для консервирования и длительного сохранения культур микроорганизмов.

     Влияние концентрации растворов на рост микроорганизмов  опосредовано изменением активности воды как меры доступной для организма  воды. И если содержание солей вне  клетки окажется выше их концентрации в клетке, то вода будет выходить из клетки. Угнетение патогенных бактерий хлористым натрием обычно начинается при его концентрации около 3%.

     Излучения

     Солнечный свет губительно действует на микроорганизмы, исключением являются фототрофные виды. Наибольший микробицидный эффект оказывает коротковолновые УФ-лучи. Энергию излучения используют для дезинфекции, а также для стерилизации термолабильных материалов.

     УФ-лучи (в первую очередь коротковолновые, т.е. с длиной волны 250-270 нм) действуют на нуклеиновые кислоты. Микробицидное действие основано на разрыве водородных связей и образовании в молекуле ДНК димеров тимидина, приводящем к появлению нежизнеспособных мутантов. Применение УФ-излучения для стерилизации ограничено его низкой проницаемостью и высокой поглотительной активностью воды и стекла.

     Рентгеновское и g-излучение в больших дозах также вызывает гибель микробов. Облучение вызывает образование свободных радикалов, разрушающих нуклеиновые кислоты и белки с последующей гибелью микробных клеток. Применяют для стерилизации бактериологических препаратов, изделий из пластмасс.

     Микроволновое излучение применяют для быстрой повторной стерилизации длительно хранящихся сред. Стерилизующий эффект достигается быстрым подъемом температуры.

     Ультразвук

     Определенные  частоты ультразвука при искусственном  воздействии способны вызывать деполимеризацию органелл микробных клеток, под действием ультразвука газы, находящиеся в жидкой среде цитоплазмы, активируются и внутри клетки возникает высокое давление ( до 10 000 атм). Это приводит к разрыву клеточной оболочки и гибели клетки. Ультразвук используют для стерилизации пищевых продуктов (молока, фруктовых соков), питьевой воды.

     Давление

     Бактерии  относительно мало чувствительны к  изменению гидростатического давления. Повышение давления до некоторого предела  не сказывается на скорости роста обычных наземных бактерий, но в конце концов начинает препятствовать нормальному росту и делению. Некоторые виды бактерий выдерживают давление до 3 000 – 5 000 атм, а бактериальные споры - даже 20 000 атм.

     В условиях глубокого вакуума субстрат высыхает и жизнь невозможна.

     Фильтрование

     Для удаления микроорганизмов применяют  различные материалы (мелкопористое  стекло, целлюлоза, коалин); они обеспечивают эффективную элиминацию микроорганизмов  из жидкостей и газов. Фильтрацию применяют для стерилизации жидкостей, чувствительных к температурным воздействиям, разделения микробов и их метаболитов (экзотоксинов, ферментов), а также для выделения вирусов. 

      2. Химические факторы 

     Способность ряда химических веществ подавлять  жизнедеятельность микроорганизмов зависит от концентрации химических веществ и времени контакта с микробом. Дезинфектанты и антисептики дают неспецифический микробицидный эффект. Бактерицидным действием обладают химические вещества различных групп: кислоты, щелочи, спирты, поверхностно-активные вещества, фенолы и их производные, соли тяжелых металлов, окислители, группа формальдегида, газообразные вещества и др. Большое разнообразие природы и химической структуры указанных веществ обусловливает и различные механизмы их бактерицидного действия на микробную клетку.

     Бактерицидное действие кислот зависит от их электролитической  диссоциации, то есть концентрации Н-ионов  в растворах и их окисляющего  действия. Чувствительность к кислотам различна у разных микроорганизмов. Так, показано, что если оптимальная концентрация Н-ионов для CI. botulinum соответствует 7,6, то при доведении рН до 4,6 наступает гибель этих бактерий. Самое низкое значение рН, при которой еще наблюдался рост, — это 4,8; при рН 4,7 могут прорастать только споры, а при рН 4,6 наступает прекращение роста вообще.

     Бактерицидная активность едких щелочей зависит  от степени диссоциации и концентрации ОН-ионов. Наибольшей бактерицидной  силой обладает КОН, затем следуют  NaOH и другие щелочи. Так же как и в отношении кислот, бактерии обладают определенной щелочной устойчивостью.

     Спирты. При разведении спирт приобретает бактерицидные свойства, причем наибольшей бактерицидностью обладает 70 %-ный спирт. Более высокие концентрации свертывают белок, который выпадает на поверхности бактерий и уменьшает проникновение спирта в глубь клетки. Бактерицидность спиртов увеличивается с возрастанием молекулярной массы в ряду: метиловый — этиловый — пропиловый — бутиловый — амиловый и т.д.

     Поверхностно-активные вещества — это жирные кислоты, мыла, детергенты. Все они изменяют энергетические соотношения на поверхности раздела, устремляются к поверхности раздела клетки и повреждают клеточную оболочку, не затрагивая внутренних структур клетки.

     Красители. К красителям с бактерицидными свойствами относят бриллиантовый зеленый, этакридин, флавакридин и др. В основе их действия лежит выраженное сродство с фосфорнокислыми группами нук-леопротеидов.

     Фенолы  и их производные первоначально  повреждают клеточную стенку, а затем  и белки бактериальной клетки.

     Соли  тяжелых металлов (свинец, медь, цинк, серебро, ртуть) и их соли оказывают  коагулирующее влияние на цитоплазму либо на ферментные системы, связывая их сульфгидрильные группы.

     Окислители  — хлор, йод, марганцовокислый калий, перекись водорода и др., окисляют существенные компоненты цитоплазмы (сульфгидрильные группы активных белков, фенольные, тиоэтильные, индольные, аминные).

     Формальдегид  также денатурирует белки, он убивает  как вегетативные формы, так и  споры. Его применяют для обезвреживания дифтерийного и столбнячного токсинов, благодаря чему они превращаются в анатоксины.

     Химические  вещества (хлор, формальдегид, щелочи, кислоты, фенол и др.) используются в практике в качестве дезинфицирующих  веществ. Дезинфекция заключается  в уничтожении патогенных микробов. К ней обычно прибегают для обеззараживания помещений, скотных дворов, территории.

     Химиотерапевтические  средства проявляют избирательное  противомикробное действие.

     По  механизму действия противомикробные вещества разделяются на:

     а) деполимеризующие пептидогликан клеточной стенки,

     б) повышающие проницаемость клеточной  мембраны,

     в) блокирующие те или иные биохимические  реакции,

     г) денатурирующие ферменты,

     д) окисляющие метаболиты и ферменты микроорганизмов,

     е) растворяющие липопротеиновые структуры,

     ж) повреждающие генетический аппарат или блокирующие его функции.

     У микроорганизмов химической деструкции, прежде всего, подвергаются белки и липиды цитоплазматической мембраны, белковые молекулы жгутиков, фимбрий, секс-пили, порины клеточной стенки грамположительных бактерий, связывающие белки периплазмы, протеиновые капсулы, экзотоксины, ферменты-токсины и ферменты питания. Деструкция гетерогенных полимеров (белки, полиэфиры и др.) происходит как при действии окислителей, так и при действии гидролизующих и детергентных антисептиков (кислоты, щелочи, соли двух- и поливалентных металлов и др.). 

     3. Биологические факторы 

     К биологическим средствам могут быть отнесены препараты, содержащие живых особей - бактериофагов и бактерий, обладающих выраженной конкурентной активностью по отношению к патогенным и условно-патогенным для человека и животных видам микробов. Они вводятся в организм в жизнеспособном состоянии. Фаги и антагонисты оказывают прямое повреждающее действие на патогенных и условно-патогенных микробов; изготовленные из них лекарственные препараты предназначены для местного применения, для них характерна специфичность действия на микроорганизмы и безвредность для пациента; целью их внесения в организм человека и животных является лечение или профилактика инфекционных заболеваний. По механизму действия они близки к химическим антисептикам.

     Необходимо  также помнить и о молочнокислых бактериях, которые вызывают процесс молочнокислого брожения. Некоторые молочнокислые бактерии способны синтезировать антибиотики и с их помощью подавлять развитие болезнетворных микробов.

     Препараты, содержащие бактерии (эубиотики или пробиотики): колибактерин, лактобактерин, бифидумбактерин, бификол, микрококкобактерин, линекс, бактисубтил и другие.

     Препараты, содержащие бактериофаги: бактериофаг брюшнотифозный, бактериофаг дизентерийный, бактериофаг сальмонеллезный, бактериофаг коли-протейный, бактериофаг стафилококковый, бактериофаг стрептококковый, бактериофаг пиоцианеус, бактериофаг синегнойный, бактериофаг клебсиеллезный, пиофаг комбинированный и другие.

     Что понимается под понятиями  «Гибель микроорганизмов»?

     Под гибелью микроорганизмов понимается полное разрушение их клеток.

     Реактивация микроорганизмов

     Реактивация (микроорганизмов) – процесс, происходящий с участием энзимов, при котором восстанавливаются поврежденные участки нуклеиновых кислот (ДНК/РНК) микроорганизмов. Способность к реактивации имеется не у всех микроорганизмов. Различают фотореактивацию, которая запускается под воздействием света и темновую реактивацию, которая происходит без участия света. Фотореактивация встречается чаще и, как правило, более выражена.   Реактивация не является процессом специфичным только для УФ обеззараживания. Реактивация возможна после любого вида воздействия, если степень воздействия оставляет возможность для реактивации. В случае с УФ обеззараживанием при обеспечении достаточной дозы облучения микроорганизм получает необратимые повреждения, и реактивация становится невозможна.

     Мутагенное  действие микроорганизмов

     Мутагенное  действие микроорганизмов – воздействие, приводящее к повреждению наследственного аппарата бактериальной клетки. Результатом являются мутации.

     Бактерицидное действие

     Воздействие, вызывающее гибель микроорганизмов.

Вопрос  № 67

     Понятие об условно-патогенных микроорганизмах. Привести примеры условно-патогенных микроорганизмов. В чём сходство и различия условно-патогенных микроорганизмов от патогенных?

     Ответ:

     Условно-патогенные микроорганизмы вызывают в определенных условиях заболевания у людей  с пониженной сопротивляемостью организма. Встречаются среди бактерий, грибков, простейших и вирусов. Чаще всего входят в состав естественной микрофлоры организма человека и животных, реже обитают в окружающей среде.

     Пример:

     Стафилококк, протеи, уреаплазма.

     Сходства:

     Также как и патогенные, обладают рядом факторов патогенности, способностью к колонизации (заселению) организма, выраженной гетерогенностью и изменчивостью популяции, определяющей быстрое приобретение устойчивости к неблагоприятным факторам, в т. ч. к антимикробным препаратам. Понятие условной патогенности не является достаточно четким.

     В отличие от условно-патогенных, патогенные вызывают заболевание в любом  случае, а не только в случае сниженной  сопротивляемости.

Вопрос  № 79

     Санитарно-показательные  микроорганизмы, их характеристика. Требования, предъявляемые к санитарно-показательным микроорганизмам.

     Ответ:

     Патогенные  микроорганизмы попадают в почву, воду, воздух, на пищевые продукты из выделений  больных людей и животных, а  также выделений бактерио- и вирусоносителей.

     Непосредственно обнаружить патогенные микробы в объектах внешней среды чрезвычайно трудно ввиду их малой концентрации. Кроме того, их наличие, как правило, не удается зафиксировать в межэпизоотический и межэпидемический периоды. Выявлению патогенных микроорганизмов препятствуют также сапрофитные микроорганизмы, обитающие во внешней среде в большом количестве.

     Поэтому делались попытки найти косвенные  показатели загрязнения внешней  среды патогенными микроорганизмами. Для этих целей оказалось возможным  использовать микроорганизмы, постоянно обитающие в организме человека и животных (толстом отделе кишечника и верхнем отделе дыхательных путей). Такие микроорганизмы были названы санитарно-показательними. В основном они являются комменсалами и только при изменении условий проявляют условно-патогенные свойства.

     Санитарно-показательные  микроорганизмы должны удовлетворять  следующим требованиям:

     - постоянно обитать в естественных  полостях организма человека  или животного и в большом  количестве выделяться во внешнюю  среду;

     - продолжительность выживания во внешней среде санитарно-показательных микроорганизмов должна быть такой же или несколько большей, чем соответствующих патогенных микробов;

     - быть более устойчивыми к воздействию  физических и химических факторов  внешней среды, чем патогенные микроорганизмы;

     - не должны размножаться во  внешней среде;

     - должны легко выделяться из  объектов внешней среды, не  подавляться сапрофитами;

     - при попадании во внешнюю среду  не должны быстро изменять  свои биологические свойства.

     Из  постоянных обитателей толстого отдела кишечника в качестве санитарно-показательных микроорганизмов приняты следующие: бактерии группы кишечных палочек, энтерококки, сульфитредуцирующие анаэробы (преимущественно Cl. perfringens), бактерии рода Proteus, кишечные бактериофаги; из постоянных обитателей слизистых оболочек верхнего отдела дыхательных путей стрептококки (зеленящий стрептококк Streptococcus viridans и гемолитический стрептококк Streptococcus haemolyticus); стафилококки гноеродный, или золотистый Staphylococcus pyogenes (aureus).

Список литературы

1. Непрерывное и периодическое культивирование  микроорганизмов. - Красноярск, 1972.
2. Шлегель Г. Г. История микробиологии. - М: изд-во УРСС, 2002.
3. Вербина Н. М., Каптерёва Ю. В. Микробиология пищевых производств. - М.: изд. ВО "АГРОПРОМИЗДАТ", 1988.
4. Ветеринарная микробиология/П.А. Емельякенко, Г.В. Дунаев, Д.Г. Кудлай и др.; — 304 с, ил. — (Учебники и учеб. пособия для высш. с.-х. учеб. заведений).
5. Земсков М.В. и др Основы общей микробиологии, вирусологии и иммунологии. Изд. 2-е, испр. и доп. М., «Колос», 1977.
6. http://collegemicrob.narod.ru/microbilogy/
7. www.maginfo.net.ru/2006/11/12/22360287.html