Определение интенсивности дыхания спермиев по обесцвечиванию метиленовой синьки

Министерство сельского  хозяйства РФ

Департамент научно-технологической  политики образования

ФГОУ ВПО Иркутская  государственная сельскохозяйственная академия

Факультет биотехнологии  и ветеринарной медицины

Кафедра анатомии, физиологии, патофизиологии, акушерства, гинекологии и биотехники размножения животных.

Контрольная работа

По предмету «Биотехника  размножения»

Выполнила: студентка 5 курса  заочного обучения факультета БиВМ

Шифр: 10321

Бойко Мария Александровна

      Проверила: Балтухаева Т. А.

Иркутск 2013

Определение интенсивности  дыхания спермиев по обесцвечиванию метиленовой синьки.

Этот метод основан  на использовании спермиями кислорода  синьки, добавленной в сперму. Для определения интенсивности дыхания спермиев по обесцвечиванию метиленовой синьки необходимы следующие материалы и оборудование: свежеполученная сперма, раствор метиленовой синьки в концентрации 0,01% , стеклянная трубочка с каналом диаметром 0,8-1 мм и длиной 6-8 см, глазные пипетки, песочные часы, предметные стекла, лист белой бумаги.

Вначале готовят 0,01% -ный раствор метиленовой синьки. Для этого отвешивают 100 мг метиленовой синьки и растворяют ее в 100 мл 0,9%-ного раствора хлористого натрия. Полученный раствор настаивают три дня. Затем к 10 мл раствора добавляют 90 мл 0,9% -ного раствора хлористого натрия и тщательно размешивают.

На чистое предметное стекло глазной пипеткой наносят одну каплю  свежеполученной спермы быка или барана и к ней добавляют каплю раствора метиленовой синьки. Обе капли быстро перемешивают стеклянной трубочкой, и смесь набирают в ее канал, чтобы столбик в нем был длиной около 2 см. На лист белой бумаги кладут трубку окрашенной спермы и определяют по секундомеру время, в течение которого наступит обесцвечивание голубого столбика. На концах столбика остаются голубые кольца (сперма соприкасается с воздухом).

Исследования проводят при температуре 20-22°С. Полученные результаты сверяют с таблицей, по которой определяют качество спермы.

Определение концентрации спермиев в счетной камере.

Для определения концентрации спермиев в счетной камере необходимы следующие материалы и оборудование: счетная камера Горяева, смесители (меланжеры) эритроцитные и лейкоцитарные, покровные стекла Шлифованные, дистиллированная вода, спирт 96%-ный, эфир, 3%-ный раствор хлористого натрия, резиновая груша или шары Ричардсона, марлевые салфетки, спиртовые тампоны, вата, счетчик для форменных элементов крови.

Для подсчета концентрации спермиев используют в основном счетную камеру с сеткой Горяева. Она состоит из толстого предметного стекла, на котором имеются три площадки, разделенные поперечными прорезями. Средняя площадка разделена прорезью еще на две и опущена на 1/10 мм ниже, чем боковые. На каждой из средних площадок нанесены две квадратные сетки площадью по 9 мм². Каждая сетка имеет по 225 больших квадратов, из которых 25 разделены продольными и поперечными линиями на 16 маленьких квадратиков. Каждая сторона малого квадрата равна 1/20 мм, а площадь — 1/400 мм². Если накрыть среднюю пластину шлифованным покровным стеклом и притереть его к боковым пластинам (до появления радужных колец), то под ним глубина камеры будет равна 1/10 мл, а объем над поверхностью маленького квадратика составит 1/400 мм³. Для подсчета спермиев сперму предварительно разбавляют 3% -ным раствором хлорида натрия. Под влиянием гипертонического раствора хлорида натрия спермин становятся неподвижными, что облегчает технику подсчета. Для разбавления спермы используют эритроцитные или лейкоцитные смесители (меланжеры). Смеситель состоит из капилляра с шарообразным расширением, внутри которого имеется бусинка, служащая для лучшего смешивания спермы с раствором.

На эритроцитарном смесителе (с красной бусинкой-меланнере) нанесены деления: 0,5; 1,101. Таким смесителем пользуются для разбавления густой спермы быка и барана в 100 и 200 раз. На лейкоцитарном смесителе (с белой бусинкой) имеются деления: 0,5; 1; 11. Им пользуются для разбавления спермы хряка и жеребца в 10 и 20 раз. Для подсчета спермиев чистую счетную камеру и шлифованное покровное стекло протирают спиртовым тампоном или промывают эфиром, а затем сухой марлевой салфеткой. Смесители промывают дистиллированной водой, 96% -ным спиртом и эфиром и просушивают продуванием воздуха резиновой грушей или шаром Ричардсона.

В эритроцитарный смеситель набирают сперму быка до деления 1 и сперму барана до деления 0,5. Сперму хряка и жеребца набирают в лейкоцитарный смеситель до деления 0,5. После этого в смеситель набирают 3%-ный раствор хлорида натрия до деления 101 (в эритроцитарный) или до деления 11 (в лейкоцитарный). Зажимают оба конца смесителя большим и указательным пальцами и встряхивают в течение 2-3 мин. Перемешав сперму с раствором, удаляют из смесителя четыре капли жидкости. Этим достигается удаление из капилляра смесителя раствора, не смешанного со спермой. Конец капилляра смесителя обтирают салфеткой или ватой. Хорошо притирают покровное стекло к пластинкам камеры и наносят сбоку на сетку небольшую каплю разбавленной спермы. Подсчет спермиев производят при увеличении микроскопа в 200-400 раз в пяти больших квадратах (80 малых) по диагонали. Считают только головки спермиев, расположенные внутри малых квадратов и лежащие на их левых и верхних линиях. Количество считанных спермиев в каждом большом квадрате записывают. Концентрацию спермиев вычисляют по формуле:

где С — концентрация и П — количество подсчитанных спермиев; Д — степень разбавления; N — число сосчитанных малых квадра¬тов (80); Р — глубина камеры, мм.

Множитель 400 введен в формулу для пересчета на 1 мм², так как площадь малого квадрата равна 1/400 мм². Вычисленная концентрация спермиев разделена на 1 000 000, поэтому полученное содержание спермиев будет выражено в миллионах на 1 микрометр (мм³) или в миллиардах в 1 мл (см³). Для быстрого подсчета спермиев пользуются клавишным счетчиком для форменных элементов крови. При подсчете спермиев в первом большом квадрате нажимают пальцем на первую клавишу счетчика столько раз, сколько в квадрате есть спермиев. При подсчете во втором квадрате нажимают на вторую клавишу и так до пятого. Над каждой клавишей вверху цифра укажет сумму подсчитанных спермиев. После подсчета суммируют число спермиев в пяти больших квадратах. Полученное число спермиев в 80 малых квадратах в сперме быка делят на 200, в сперме барана — на 100, в сперме хряка и жеребца — на 1000. Получают число спермиев (в млрд) в 1 мл спермы. Если число спермиев быка в пяти больших квадратах 240, то концентрация спермиев составляет 240 : 200 =1,2 млрд в 1 мл спермы.

Счетные камеры и шлифованные стекла после работы тщательно моют вначале простой, а потом дистиллированной водой и насухо вытирают марлевой салфеткой. Из смесителей удаляют остатки спермы, немедленно промывают их дистиллированной водой, 96%-ным спиртом и эфиром, а затем просушивают воздухом при помощи спринцовки или шаров Ричардсона.

Определение концентрации спермиев при помощи фотоэлектрокалориметра.

Определение концентрации спермиев с использованием этих приборов состоит в том, что при пропускании через кювету со спермой пучка света определенной силы он, попадая на селеновый фотоэлемент, отклоняет стрелку гальванометра. Отклонение ее зависит от величины электрического тока, проходящего через гальванометр, которая обратно пропорциональна мутности спермы.

Для определения концентрации спермиев при помощи фото-электрокалориметра (ФЭК-М) необходимы следующие материалы и оборудование: 3,5%-ный раствор лимоннокислого натрия трех-замещенного пятиводного (тщательно профильтровать через бумажный фильтр для удаления механических примесей); микропипетка вместимостью 0,1 мл; микропипетка вместимостью 0,2 мл; пипетка градуированная вместимостью 10 мл; чистые сухие флаконы с пробками из-под пенициллина или других антибиотиков, можно использовать вместо флаконов пробирки на 15-20 мл по числу предполагаемых к исследованию эякулятов; марлевые салфетки для протирки кювет и микропипеток — 3-4; фильтровальная бумага (нарезать квадратиками 5x5 см); смесь спирта с эфиром (в равных частях) — 20 мл; промывалка на 0,5 л, наполненный дистиллированной водой для промывания кювет после каждого исследования; чашка толстостенная 0,5 л; деревянные палочки с острым концом (длина 8 см, диаметр 4 мл — 2-3 шт.); фотоэлектрокалориметр ФЭК-М.

Прежде чем приступить к работе, стрелку гальванометра необходимо освободить от фиксации, для чего снять с клемм соединительную металлическую нить и подключить гальванометр к клеммам фотоэлектрического калориметра, которые находятся внизу с левой стороны. При этом рукоятку включения гальванометра обязательно поставить в положение «выкл.», т. е. на 0 (ноль).

Стабилизатор соединительной колодкой подключают через специальное гнездо к ФЭК-М (справа внизу), а соединительной вилкой в электросеть. При переводе тумблера стабилизатора в положение «вкл.» зажигается осветительная лампа электрического фотокалориметра и появляются два параллельных пучка света, если открыта шторка.

Необходимо проверить, правильно  ли установлена осветительная лампа. Для этого следует прикрыть папиросной бумагой окна световых пучков в верхней части гнезд кюветодержателей. Если изображение нити лампы довольно четкое и располагается посередине как в правом, так и в левом окне, осветительная лампа установлена правильно. Если же изображение расплывчатое, нечеткое и сдвинуто с центра, установка осветительной лампы неправильная. В этом случае показания прибора будут неточные. Правильная установка лампы осуществляется регулировочными винтами, расположенными в передней части прибора.

Определять концентрацию спермиев на ФЭК-М начинают спустя 15-20 мин после включения лампы и засветки фотоэлементов. Для повышения точности исследований рукояткой устанавливают красные светофильтры. Левый отсчетный барабан с помощью рукоятки также выставляют на 0 (ноль) по красной шкале (шкала оптической плотности). Затем во флакон наливают 10 мл 3,5% -ного раствора лимоннокислого натрия и вносят туда микропипеткой 0,1 мл спермы быка или берут 5 мл этого раствора и 0,05 мл спермы быка. Как в том, так и в другом случае сперма разбавляется в соотношении 1:100.

Сперму барана разбавляют в соотношении 1:400, т. е. берут 10 мл 3,5% -ного раствора лимоннокислого натрия и 0,025 мл спермы.

Сперму хряка разбавляют в соотношении 1:30, т. е. к 12 мл 3,5%-ного раствора лимоннокислого натрия добавляют 0,4 мл спермы, которая перед взятием пробы должна быть профильтрована через два слоя плотной капроновой ткани для отделения студенистого секрета.

При взятии проб спермы нужно  стремиться к высокой точности. Пробы необходимо отбирать только микропипетками вместимостью 0,1-0,5 мл из середины свежеполученных эякулятов, не допуская попадания в микропипетку пены или вазелина. Перед внесением пробы спермы в раствор микропипетки следует вытирать снаружи чистой марлевой салфеткой для удаления излишней спермы. После внесения спермы в раствор микропипетку надо 2-3 раза прополаскать в этом же растворе. Температура 3,5% -ного раствора лимоннокислого натрия должна быть в пределах 18-25°С.

Для экономии времени указанное  для каждого вида животных количество 3,5%-ного раствора лимоннокислого натрия для разбавления проб спермы желательно разлить заранее в чистые сухие флакончики (пробирки) и закрыть пробками. Количество флаконов с раствором должно соответствовать количеству предполагаемых для исследования эякулятов.

После разбавления сперму тщательно перемешивают, осторожно переворачивая закрытый флакон в руке, наливают в кювету с рабочей длиной 10 мм до метки и быстро определяют ее оптическую плотность. Для этого на пути прохождения пучка света ставят в левый кюветодержатель чистую кювету рабочей длиной 10 мм, наполненную 3,5%-ным раствором лимоннокислого натрия, а в правый кюветодержатель — две такие же кюветы: одну с разбавленной спермой, другую — с 3,5%-ным раствором лимоннокислого натрия. Заполнять кюветы надо до метки. При этом кювету с разбавленной спермой устанавливают на пути прохождения пучка света (как в левом кюветодержателе), а кювету с раствором — в запасное гнездо этого же кюветодержателя. Кюветы как в правом, так и в левом кюветодержателе надо всегда устанавливать перпендикулярно к пучку света в одно и то же положение — лучше вверх до упора, то есть на расстояние, наиболее удаленное от фотоэлементов. Несоблюдение этого условия приводит к значительным ошибкам.

После установки закрывают  крышку прибора и включают гальванометр рукояткой сначала на грубую чувствительность в положение «I». Затем в правом кюветодержателе меняют местами кюветы так, чтобы на пути прохождения света стала кювета с 3,5% -ным раствором лимоннокислого натрия. Это достигается путем незначительного поднятия всего кюветодержателя и поворота его вокруг оси.

Опустив крышку прибора (при исследовании она всегда должна быть закрыта), опять включают гальванометр сначала на грубую чувствительность и, уже не трогая рукоятку нейтральных клиньев, рукояткой отсчетного барабана 2 (вращая ее по часовой стрелке) подводят отклонившуюся стрелку гальванометра к 0 (ноль). Включают гальванометр на высокую чувствительность и, вращая рукоятки этих же счетных барабанов (они между собой неподвижно спарены), точно устанавливают стрелку гальванометра на О (ноль), после чего сразу же включают гальванометр (рукоятку переводят в положение 0 (ноль)). Отсчет берут по красной шкале левого барабана и смотрят, какой величине концентрации он соответствует на калибровочной кривой (или таблице), которую выводят заранее.

Построение калибровочной  кривой. Для определения концентрации спермиев на ФЭК-М необходимо предварительно построить калибровочную кривую, изображащую зависимость оптической плотности от концентрации спермиев.

Для построения калибровочной кривой из свежевзятых эякулятов выбирают несколько таких, в которых концентрация спермиев наиболее высокая. Тщательно определяют концентрацию спермиев в счетной камере.

Из отобранных эякулятов путем разбавления их 3,5% -ным раствором лимоннокислого натрия 1:1, 1:2, 1:3 и т. д. готовят ряд образцов спермы и уточняют концентрацию спермиев в каждом из них в счетной камере.

Определяют величину оптической плотности каждого образца на приборе, как описано выше. Зная фактическую концентрацию спермиев, установленную в счетной камере, строят для спермы каждого вида животных свою калибровочную кривую. Для этого на миллиметровой бумаге откладывают: по горизонтальной оси — известные концентрации спермиев каждого образца, по вертикальной — соответствующие им величины оптической плотности. В местах пересечения перпендикуляров ставят точки. Калибровочную кривую проводят так, чтобы она прошла через большинство указанных точек, а количество точек, лежащих выше и ниже калибровочной кривой, было примерно одинаковым.

Кривая не должна быть сильно изогнутой или изломанной, а более или менее приближаться к прямой линии.

Имея калибровочную кривую, можно легко определить неизвестную концентрацию спермиев любого эякулята. Для этого нужно лишь установить его оптическую плотность на приборе и посмотреть, какой величине концентрации она соответствует на калибровочной кривой. При этом следует строго соблюдать все условия исследования, при которых выведена и калибровочная кривая. Надо применять ту же кратность разбавления спермы, использовать кюветы той же рабочей длины, те же светофильтры и тот же способ отсчета величины оптической плотности.

Калибровочную кривую следует  ежемесячно проверять, так как показания  прибора могут изменяться (стареют фотоэлементы, лампы накаливания и гальванометр).

Для удобства определения  концентрации спермиев можно пользоваться таблицами и коэффициентами-множителями, которые легко вывести из калибровочной кривой. Чтобы получить коэффициент-множитель, нужно среднеарифметическую концентрацию 15-20 образцов спермы разделить на соответствующую ей среднеарифметическую величину оптической плотности.

При помощи коэффициента-множителя и величины оптической плотности эякулята можно очень легко определить концентрацию спермиев, умножить первую величину на вторую. Обычно коэффициент-множитель при соблюдении указанных выше условий на ФЭК-М для спермы быка очень близок к 2, хотя для каждого прибора он может несколько варьироваться, поэтому калибровочную кривую необходимо выводить отдельно для каждого прибора.

Точность электрофотометрического  метода определения концентрации спермиев и источник ошибок.

По точности электрофотометрический метод определения концентрации спермиев почти не уступает методу определения в счетных камерах. Величина ошибки колеблется в пределах ±6%.

Это обусловлено в основном влиянием плазмы спермы и неточностью взятия проб. Влияние пигментации плазмы на точность результатов исследования резко ослабляется при применении красных монохроматических светофильтров. Электрофотометрический метод определения концентрации спермиев довольно прост по методике выполнения, но из-за высокой чувствительности требует исключительной аккуратности в работе.

Основными источниками ошибок могут быть:

1) грязные кюветы, флаконы, пробирки, микропипетки и пр., т. е. все те предметы, которые имеют контакт со спермой во время подготовки ее к исследованию;

2) неточность взятия проб спермы микропипетками;

3) неточность в разбавлении спермы перед исследованием;

4) всевозможные механические примеси в 3,5% -ном растворе лимоннокислого натрия (непрофильтрованный раствор);

5) загрязнение оптики прибора в результате неаккуратной работы с ним;

6) несвоевременность исследования проб спермы, что может привести к их подсыханию или биологическому загрязнению (развитию микрофлоры).

Для получения точных результатов не следует допускать перечисленных недостатков в исследовании. Кювету со спермой после каждого исследования необходимо прополаскивать дистиллированной водой не менее 3 раз. Остатки воды в кювете убирают промокательной бумагой, а для исследования очередного образца спермы берут другую кювету такой же длины (в наборе к приборам их несколько).

Кюветы берут только за боковые грани, чтобы не загрязнять рабочие плоскости.

После окончания работы все кюветы тщательно моют дистиллированной водой. Несмываемые водой загрязнения устраняют смесью спирта с эфиром. Для этого используют марлевый тампон, намотанный на деревянную палочку. Применять стеклянные или металлические предметы для протирки кювет категорически запрещается, так как ими легко нанести царапины. При выходе из строя кювет с рабочей длиной 10 мм можно пользоваться при работе с фотоэлектрическим колориметром ФЭК-М кюветами другой рабочей длины (5 или 20 мм), но при этом кратность разбавления спермы надо изменить прямо пропорционально рабочей длине выбранной кюветы. Так, если пользоваться кюветами с рабочей длиной 5 мм, которая в 2 раза меньше рекомендуемой, полученную концентрацию спермы следует увеличивать в 2 раза.

При использовании кювет  с рабочей длиной 20 мм полученную концентрацию спермы следует уменьшить  вдвое.

Определение концентрации спермиев хряка при помощи оптического  стандарта.

При отсутствии фотоэлектрокалориметра допускается определение концентрации спермиев хряка при помощи оптического стандарта. Для этого необходимы следующие материалы и приборы: стандарт; пробирка такого же диаметра, как и стандарт; 1% -ный раствор хлористого натрия; микропипетка вместимостью 0,1 мл; марлевые салфетки; газетный лист; свежеполученная сперма хряка. При этом в пустую пробирку такого же диаметра, как и стандарт, наливают 1 мл чистого 1% -ного раствора хлористого натрия. Микропипеткой набирают 0,1 мл свежеполученной профильтрованной спермы. Край микропипетки, который погружался в сперму, вытирают снаружи марлей и вносят сперму в пробирку с физиологическим раствором. Микропипетку обязательно промывают в этом же физиологическом растворе 1-2 раза. Пробирку слегка встряхивают, держат ее рядом со стандартом, который предварительно должен быть хорошо взболтан, а сзади вплотную прикладывают газетный лист или книжный текст. Пробирку со спермой и оптический стандарт мутности вплотную прикладывают к листу с текстом держат на уровне глаз падающего света. Пробирку со спермой сравнивают с различными стандартами мутности к цвету пробирке со спермой. Определяют концентрацию спермин в миллионнах в 1 мл спермы, согласно цифре, указанной в стандарте.

К исследуемой сперме добавляют  пипеткой физиологический раствор  в таком количестве, чтобы высота букв шрифта и оптическая плотность были одинаковы со стандартом (для более точной оценки желательно сравнение оптической плотности проводить на разных шрифтах). Каждый раз при добавлении раствора содержимое пробирки и стандарт встряхивают для получения равномерной взвеси.

После того как оптическая плотность исследуемой спермы и  стандарта уравняются, проводят расчет по следующей формуле:

К=50(п + 0,1),

где К — концентрация спермы, млн/мл; п — объем добавленного 1% -ного раствора хлористого натрия, мл; 50 — коэффициент.

Стандарт соответствует  оптической плотности спермы хряков с концентрацией спермиев 5 млн/мл.

П р и мер. Для выравнивания оптической плотности до стандарта к исследуемой сперме добавлено всего 4,5 мл 1%-ного раствора хлористого натрия (с учетом раствора, ранее налитого в пустую пробирку). К = 50(4,5 + 0,1) = 50 х 4,6 = 230 млн/мл. Следовательно, в 1 мл исследуемой спермы содержится 230 млн спермиев.

Определение концентрации спермиев жеребца по стандартам.

Стандарты представляют собой стеклянные запаянные пробирки одинакового диаметра с жидкостью, имитирующей сперму жеребца разной концентрации: 10-50-100-200-300-500 млн спермиев в 1 мл.

Сперму наливают в прилагаемую  пустую пробирку такого же диаметра и сравнивают со стандартом. Предварительно стандарты встряхивают, чтобы равномерно размешался осадок. Пробирки просматривают на свет, при этом подбирают стандарт, наиболее близкий по густоте к определяемой сперме, который и принимают за ее концентрацию.

Концентрация спермиев может быть определена и как промежуточная между двумя стандартами, например 75 млн (между 50 и 100 млн) и т. д. Для большей точности определения к сравниваемым пробиркам сзади вплотную прикладывают стеклянную палочку.

При концентрации более 500 млн спермиев в 1 мл спермы ее можно разбавить 7%-ным раствором глюкозы в 2 раза (1:1), затем установить концентрацию по стандартам и сделать пересчет на неразбавленную сперму.

 Определение  абсолютной выживаемости спермиев.

Для более полной характеристики качества спермы определяют абсолютный показатель выживаемости спермиев — продолжительность их жизни при различных степенях разбавления спермы синтетической средой. Для этого неразбавленную сперму и сперму при различных степенях разбавления хранят при температуре около 0°С и ежедневно определяют активность спермиев до тех пор, пока не установят полную гибель во всех пробах.

При определении абсолютной выживаемости спермиев необходимы следующие материалы и оборудование: сперма; микроскоп; термостат или обогревательный столик; пробирки емкостью по 2 мл; измерительные пипетки на 1-2 мл; специальный штатив; термос со льдом; стеклянные палочки или глазные пипетки; синтетическая среда; 2,9%-ный раствор лимоннокислого натрия.

Для определения абсолютного  показателя выживаемости спермиев 11 стерильных пробирок по 2 мл нумеруют восковым карандашом или тушью. Во все пробирки, за исключением первой, наливают пипеткой по 0,5 мл синтетической среды. В первую (пустую) и вторую пробирки наливают по 0,5 мл неразбавленной спермы. Первая пробирка служит контролем. Сперму во второй пробирке смешивают со средой и из нее переносят 0,5 мл в третью пробирку; в третьей пробирке смесь размешивают и переносят 0,5 мл в четвертую пробирку и т. д. Из последней пробирки 0,5 мл раствора выливают. Таким образом, в первой (контрольной) пробирке сперма неразбавленная, а в пробирках со второй по одиннадцатую сперма разбавлена в 2, 4, 8,16, 32, 64, 128, 256, 512 и 1024 раза. Затем оценивают активность спермиев из каждой пробирки. Пробирки со спермой устанавливают в штатив, закрывают стерильными пробками и ставят на хранение при температуре около 0°С в термос. В последующем ежедневно оценивают активность спермиев под микроскопом при температуре 40°С. Перед исследованием к капле спермы на предметном стекле добавляют две капли 2,9% -ного раствора лимоннокислого натрия, накрывают покровным стеклом и кладут на предметный столик микроскопа. Оценку активности проводят до установления гибели всех спермиев во всех пробирках. Результаты исследований заносят в таблицу. На основании полученных данных вычисляют показатель выживаемости спермиев, и результаты тоже заносят в таблицу. Показатель выживаемости (S) определяют по формуле:

S = Eat,

где Е — знак суммы; а — активность спермиев; t — показатель времени.

Показатель времени определяют по формуле:

где Т — продолжительность опыта; Тп + 1 — часы от начала опыта до последующего определения; Тп - 1— продолжительность от начала опыта до предыдущего определения.

Хорошая сперма быка и барана, разбавленная синтетической средой в 16-32 раза, должна иметь показатель выживаемости спермиев более 1400, хряка — 900, жеребца — 400.

Определение процентного соотношения нормальных и патологических форм спермиев.

Среди нормальных спермиев всегда находится более или менее значительное количество патологических форм. Чаще аномалии выявляются в хвостовой части спермиев, основании головки и в шейке. С возрастом к моменту физиологической зрелости производителя количество аномальных спермиев уменьшается. Могут встречаться самые различные патологические формы спермиев: гигантского размера или карликовые, спермин с двумя-тремя головками и общим хвостиком, с двумя хвостиками, с укороченным хвостиком, его деформацией или отсутствием, с протоплазматической капелькой, слишком большой или маленькой головкой и другие формы. Иногда встречаются спермин, лишенные головки, но способные двигаться.

Установлено, что признаки патологических спермиев — слабо  выраженный перфораторий или его отсутствие. Нарушение структуры перфоратория и оболочки спермия является признаком начальных изменений спермиев при их хранении.

Большое количество патологических спермиев свидетельствует о нарушении спермиогенеза при неблагоприятном воздействии инфицированных различной микрофлорой секретов придаточных половых желез и мочеполового канала и указывает на нарушение правил получения спермы и ее хранения.

В качестве конкретных причин образования уродливых форм спермиев отмечают: 1) слабо развитые семенники; 2) поражения семенника и придатка (гигантские и карликовые спермин); 3) длительные промежутки между коитусами, обусловливающие старение и распад спермиев в придатке (отдельные головки, изолированные хвостики); 4) половое истощение производителя вследствие большой половой нагрузки или недостаточного кормления (спермин с протоплазматическими капельками в области шейки, тела и хвоста — незрелые спермин). Чем ближе к головке расположена капелька — тем моложе спермин.

Большую роль в образовании  патологических форм спермиев играет нарушение терморегулирующей функции  мошонки.

Если в сперме жеребца  содержится до 150-300 патологических спермиев на 1000, она считается нормальной. Быки, дающие сперму с содержанием более 18% , а бараны более 14% уродливых спермиев, должны рассматриваться как бесплодные. Значительное количество патологических спермиев следует, безусловно, расценивать как признак наступающей импотенции.

Для определения процентного соотношения нормальных и патологических форм спермиев необходимы следующие материалы и оборудование: сперма; предметные стекла; спиртовая горелка; раствор фуксин-эозина или метиленовой синьки; фильтровальная бумага; пипетки; дистиллированная вода; микроскоп. На мазок кладут полоску фильтровальной бумаги, чтобы нерастворившиеся кусочки краски не осели на стекло и не мешали подсчету. Раствор краски наливают на бумагу. Краску на стекле смывают водой и высушивают мазок на воздухе. Просохший мазок просматривают под микроскопом при увеличении в 400-600 раз и подсчитывают в нескольких полях не менее 200 спермий.

В каждом поле зрения подсчитывают нормальные и патологические спермин, а затем вычисляют процент их содержания. К числу патологических форм спермиев относят: гигантские и карликовые, с деформацией головки, с двумя головками, надломом шейки, с изолированными головками, с искривленным или закрученным хвостом, с двумя хвостами, утолщением хвоста и пр.

Высокий процент патологических форм спермиев в сперме снижает ее оплодотворяющую способность и может быть одной из причин бесплодия производителей.