Перспективы использования ДНК технологий в селекции сельскохозяйственных животных

МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА РФ

ДЕПАРТАМЕНТ НАУЧНО-ТЕХНИЧЕСКОЙ ПОЛИТИКИ И ОБРАЗОВАНИЯ

ФГБОУ ВПО КОСТРОМСКАЯ ГСХА

ФАКУЛЬТЕТ ЗАОЧНОГО ОБУЧЕНИЯ

КАФЕДРА ЧАСТНОЙ ЗООТЕХНИИ, РАЗВЕДЕНИЯ И ГЕНЕТИКИ

Контрольная работа

 по дисциплине

  «генетика в животноводстве»

«Перспективы использования ДНК технологий в селекции сельскохозяйственных животных »

                                                Выполнила:    студентка 6 курса

                                                                               заочного обучения

                                                                                     специальность «Зоотехния»                                                                               

                                                                        шифр   80510

                                                                                    Смирнова И.Ю.

                                                            Проверил: к.с.-х.н., доцент кафедры

                                                                                  частной зоотехнии,

                                                                                     разведения и генетики  

Кострома

2013 г

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ ………………………………………………. 2

1. ПЕРСПЕКТИВЫ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ДНК

   ТЕХНОЛОГИЙ В СЕЛЕКЦИИ  СЕЛЬСКО-

   ХОЗЯЙСТВЕННЫХ ЖИВОТНЫХ……………………5

ЗАКЛЮЧЕНИЕ…………………………………………….18

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ…………..20

ВВЕДЕНИЕ

 Комплексной программой развития биотехнологий на территории РФ до 2020 года в качестве приоритетов в области животноводства определены разработка и внедрение геномных и постгеномных методов создания форм животных, а также методов геномной паспортизации. Все это отличные способы повышения эффективности селекционно-племенной работы.

Существенный прогресс в области селекции сельскохозяйственных животных в последние десятилетия в мире связан с разработкой и внедрением технологии генной и геномной селекции. Последние имеют высокий инновационный потенциал, однако их последующее внедрение в России требует разработки собственных систем или вхождения международные системы оценки племенной ценности. Технологии генной селекции, которые не потеряли сегодня своей актуальности в мире, разрабатываются и внедряются сегодня институтами Россельхозакадемии практически на всех основных видах основных сельскохозяйственных животных. Наибольшие успехи достигнуты в области свиноводства, где предложено к внедрению 15 генов, влияющих на все основные экономически значимые признаки свиней, отмечает Н.А. Зиновьева [2].

 Генетическое совершенствование  пород сельскохозяйственных животных  предусматривает международный  обмен генофондом с целью использования  лучших мировых селекционных  достижений. Однако ввоз племенного  материала из-за рубежа сопряжен  с неконтролируемым проявлением  и распространением наследственных  аномалий, способных нанести существенный  вред развитию животноводства  и поставить под угрозу биологическую  безопасность страны, отмечает Е.А. Гладырь [1].

Наиболее крупная на сегодняшний день база данных, содержащая информацию о наследственных дефектах 186 видов животных, ОМIA Университета Сиднея. Она содержит фенотипическое описание 398 наследственных аномалий крупного рогатого скота и 214 аномалий свиней. Для элиминации рецессивных наследственных аномалий в популяции сельскохозяйственных животных необходима разработка и освоение системы ДНК-идентификации животных – носителей мутантных аллелей, отмечает Н.А. Зиновьева [4].

Потенциал российских пород и системы крупномасштабной селекции еще не использован полностью, аборигенные породы совершенствуются и развиваются, и в ближайшей перспективе именно они составят основу новых направлений селекционной работы с сельскохозяйственными видами животных. До настоящего времени большинство экспериментов по получению трансгенных животных выполнено на лабораторных видахживотных. Решение этой проблемы для сельскохозяйственных животных требует сложных и трудоемких исследований, тем не менее, использование биотехнологий в селекции достаточно успешно развиваются. В России ведущим научно-исследовательским учреждением, в котором под руководством академика Н.А. Зиновьевой ( до 2012 года институт возглавлял академик Л.К. Эрнст)  проводятся работы по получению трансгенных животных, является Всероссийский институт животноводства РАСХН.

Создаются принципиально новые линии и породы скота с повышенной устойчивостью к опасным болезням и высокой продуктивностью на основе получения генных конструкций, связанных с механизмом регулирования обмена веществ и развития животных, формирования важнейших хозяйственно полезных признаков (удой, рост, шерстность, яйценоскость и др.). Уже накоплен определенный объем научной информации по трансгенным конструкциям, включающим гены соматотропинового цикла. Что позволяет получить трансгенных животных с усиленным синтезом белка, Л.К. Эрнст [7].

1. ПЕРСПЕКТИВЫ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ  ДНК ТЕХНОЛОГИЙ В СЕЛЕКЦИИ  СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ ЖИВОТНЫХ

 Современный  этап развития биотехнологий  основан на широком использовании  ДНК-технологий. Большому прогрессу ДНК-технологий способствовало то, что была осознанна их важность и перспективность в решении многих проблем человека в области экологии, медицины, промышленности и сельского хозяйства. ДНК-технологии -новый раздел молекулярной генетике, основная цель которого – исследование и изменение наследственного материала на разных уровнях его организации: геномной, генной, хромосомной, пишет Ю.Н. Козлов [6].

На сегодняшний день приоритетные направления ДНК- технологий это оценка генофонда сельскохозяйственных животных, ДНК-паспортизация сельскохозяйственных животных , маркирование признаков продуктивности, диагностика наследственных заболеваний  и диагностика инфекций.

Оценка генофонда сельскохозяйственных животных.

Разработка методов генетического маркирования животных по повторяющимся последовательностям ДНК является важной задачей в связи с реализацией программ по сохранению и использованию генетических ресурсов. Для оценки генетического сходства и разнообразия животных можно использовать свойство гипервариабельности часто повторяющихся последовательностей ДНК. Частые повторы ДНК (сателлиты, мини- и микросателлиты) обладают более высокой степенью изменчивости, чем структурные гены. Методы рестрикционного анализа позволяют достаточно простым и быстрым способом выявить в геноме повторяющиеся элементы, различающиеся на уровне популяций, видов и более высоких таксономических групп, пишет Л.А. Калашникова [5].

Принцип метода заключается в том, что специальные ферменты - рестриктазы узнают короткие последовательности (сайты узнавания) и делают разрезы в ДНК. Рестриктаза разрезает исследуемую ДНК на определенное количество фрагментов фиксированной длины. Эти фрагменты разделяются электрофорезом.

Если в структуре ДНК произошли изменения, например, замена одного основания на другое вследствие точковой мутации, то при этом исчезает или возникает сайт узнавания. Изменяется картина распределения фрагментов - полос на геле. Различия описываются как полиморфизм длин рестриктных фрагментов (ПДРФ). Варианты ПДРФ рассматриваются как локус- специфические генетические маркеры.

Метод прямого рестрикционного анализа часто повторяющейся фракции ДНК даёт информацию о множестве локусов генома и открывает хорошую возможность для изучения генетической дивергенции. Использование целого ряда рестриктаз для анализа ядерного генома позволяет получить воспроизводимую картину распределения семейств повторяющихся последовательностей ДНК.

Метод чрезвычайно прост в исполнении, надёжен и не требует больших материальных и временных затрат. Полиморфизм повторяющейся фракции генома животных может быть выявлен прямым способом без использования молекулярной гибридизации и радиоактивного мечения, отмечает Л.А. Калашникова [5].

С помощью метода ПДРФ может быть выявлено сколь угодно большое количество отличительных признаков, позволяющих с высокой степенью достоверности определять видовую принадлежность тканей, а также мяса и мясных продуктов при ветсанэкспертизе. Модификации метода рестрикционного анализа повторяющейся фракции ДНК позволят решать не только конкретные проблемы систематики, но могут принести пользу в исследованиях микроэволюционных процессов формирования видов, комбинации внесённых в популяцию структурных генов с аборигенными повторяющимися последовательностями, обеспечивающими регуляторные функции генома, и т.д.

Данные о полиморфизме митохондриальной ДНК (мт ДНК) можно использовать для филогенетического анализа, маркирования породных и внутрипородных особенностей животных, выявления связей с хозяйственно-полезными признаками и наследственных дефектов. В митохондриальном геноме находится 37 генов, включённых в центральный метаболизм. Мутационная изменчивость мтДНК в среднем в 5-10 раз выше, чем уникальных последовательностей ядерного генома. Материнский характер наследования в сочетании с наличием высокополиморфных участков дают уникальное преимущество использования маркирующих характеристик мтДНК для генетической идентификации особей в рамках семейств на основе сходства митотипа любых родственников по материнской линии, отмечает Л.А. Калашникова [5].

При исследовании различных пород крупного рогатого скота обнаружены две различные митохондриальные линии и множество уникальных гаплотипов. Ни один из митотипов, найденных в азиатской группе пород, не был выявлен в афро- европейской группе, и наоборот.

Вариации в структуре мтДНК могут влиять на уровень энергетического метаболизма, коррелирующий с продуктивностью животных и их воспроизводительной способностью. Материнский цитоплазматический эффект оказывает влияние на молочную продуктивность, содержание жира и белка в молоке.

Митохондриальная генетическая вариабельность вносит вклад не только в дивергенцию пород, но и в результаты их скрещивания. Энергетический метаболизм - один из наиболее важных механизмов гетерозиса. Цитоплазматическая наследственность является причиной различной продуктивности животных при реципрокных скрещиваниях.

Предполагается, что митохондрнальные гены вовлечены в механизм репродуктивной изоляции. Успех или неуспех отдалённых скрещиваний может быть обусловлен тем, представитель какого вида является женским партнёром.

Применяя метод ПЦР, можно избежать длительной и трудоёмкой процедуры выделения мтДНК и использовать для анализа препараты тотальной ДНК, пишет Л.А. Калашникова [5].

 Одним из вариантов анонимных маркеров является RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA). Высокополиморфные анонимные последовательности RAPD амплифицируют с помощью ПЦР с использованием одного короткого произвольного праймера. Для рандомной амплификации фрагментов ДНК используют случайные декануклеотиды - короткие праймеры длиной в 10 нуклеотидных оснований. К настоящему моменту синтезирован и протестирован на полиморфизм достаточно большой объем подобныхпраймеров. Секвенирование ряда ампликонов показало, что они могут быть представлены участками часто повторяющейся и умеренно повторяющейся ДНК, а также входить в состав структурных генов.

RAPD - в большей степени доминантные, чем кодоминантные маркеры: полиморфизм последовательности сводится к присутствию или отсутствию данного маркера, а не изменению длины. В настоящее время RAPD - технология широко используется в изучении генома (конструирование генетических карт, анализ генетической структуры популяций, генотипирование, маркирование признаков). Метод RAPD - анализа имеет ряд достоинств - это быстрота, простота детектирования и необходимость малого количества ДНК для анализа (5-25 нг), отмечает Л.А. Калашникова [5].

ДНК-паспортизация животных.

Исследования в области ДНК-паспортизации животных проводятся, начиная с конца 90-х годов прошлого века. С этой целью в институтах отделения зоотехнии созданы и постоянно пополняются ДНК-банки основных видов и пород сельскохозяйственных животных и птицы. Решение задачи создания генетических паспортов пород сельскохозяйственных животных, поставленных в программе, требует разработки методов и тест-систем, позволяющих с высокой точностью проводить генетическую дифференциацию пород, типов и линий животных.

Проводимые в течение ряда лет исследования, показали, что наиболее эффективным типом маркеров в этой связи являются микросателлиты. И сегодня предлагаются мультилокусные системы анализа этих маркеров для всех основных видов животных, позволяющие с высокой точностью дифференцировать популяции и породы внутри видов.

 Инновационный потенциал предложенных систем ДНК-паспортизации заключается в их использовании в контроле происхождения и чистопородности племенного материала. Последнее имеет особую актуальность  в области свиноводства и птицеводства, базирующихся, как известно, на системе гибридизации, эффективность которой во многом определяется чистопородностью исходных форм и линейностью кроссов. 
Следует отметить  всероссийский масштаб восстребованности технологии ДНК-паспортизации КРС и свиней, внедрение которых осуществляется более чем в 30 субъектах РФ.

Поступательный рост коммерческих исследований на подтверждение достоверности происхождения методами ДНК-анализа отмечается в коневодстве, где эти методы постепенно вытесняют иммунно-генетические. Число образцов, исследованных во ВНИИ коневодства, увеличилось с 4 в 2008 году до более 3 000 в 2012 году, отмечает Н.А. Зиновьева [2].

Маркирование признаков продуктивности.

Среди множества генов, контролирующих хозяйственно - полезные признаки, можно выбрать группу мажорных генов, вносящих наибольший вклад в формирование и функционирование данных признаков. Современные методы молекулярной биологии (ПЦР, ПДРФ и др.) позволяют быстро идентифицировать гены, ответственные за количественные признаки животных, оценить их сочетание (генотип) у производителей и молодняка. Значительную помощь селекции в молочном животноводстве может оказать генетическая информация об аллельных вариантахгенов, кодирующих синтез белков (казеинов, бета-лактоглобули-на молока), и их сочетаниях в геноме, пишет Л.А. Калашникова [5].

Анализ мировых информационных ресурсов позволил выделить ряд потенциальных ДНК-маркеров продуктивных признаков крупного рогатого скота и свиней, для определения полиморфизма которых разработаны аналитические тест-символы (таблица 1).

Таблица 1

Спектр потенциальных ДНК-маркеров продуктивности крупного рогатого скота и свиней

*Указаны только диагностируемые аллели; потенциальный «желательный» аллель выделен жирным шрифтом.

 Как показано  в таблице 1, предполагаемые для  внедрения в сельхозпредприятиях России маркеры крупного рогатого скота затрагивают, главным образом, показатели молочной продуктивности. Диагностируемые маркеры свиней охватывают более широкий спектр экономически значимых показателей: многоплодие, сохранность поросят, качество мяса, откормочная и мясная продуктивность, пишет Н.А. Зиновьева [3].  

Исследования показали полиморфизм всех изучаемых ДНК-маркеров, при этом частоты встречаемости желательных аллелей характеризуется достаточно высоким размахом  изменчивости  в зависимости от породной

принадлежности животных и используемой селекционной стратегии.

Внедрению маркерной селекции должен предшествовать анализ распределения аллелей  в генотипе каждого из потенциальных ДНК-маркеров.

В качестве задач на ближайшую перспективу ставится дальнейшее расширение спектра маркеров и разработка мультилокусных систем анализа, позволяющих выполнять одновременный анализ полиморфизма нескольких генов и направленных на снижение себестоимости и повышение производительности ДНК-диагностики, пишет Н.А. Зиновьева [3].

Полиморфизм гена каппа-казеина крупного рогатого скота

Основная часть белков молока (78-85%) представлена казеинами. На сегодняшний день известно семь аллелей каппа- казеина крупного рогатого скота: А, В, С, Е, F, G, Н. Изучение гена каппа-казеина показало существование нуклеотидных замен, которые характеризуют различные аллельные варианты.

Из всех известных аллельных вариантов каппа-казеина выделяют В-аллельный вариант, который ассоциируется с более высоким содержанием белка в молоке и более высоким выходом сыра, а также лучшими коагуляционными свойствами молока, отмечает Л.А. Калашникова [5].

Ранее генотип казеина не включали в показатели селекции, так как производители могли быть оценены только в зрелом возрасте путем типирования молочных белков их потомства. Благодаря методу полимеразной цепной реакции с последующим рестрикционным анализом стало возможным идентифицировать генотип каппа-казеина на ранних стадиях развития животного, что значительно ускоряет решение селекционных задач. Сегодня во многих генетических- центрах мира проводят исследования крупного рогатого скота по идентификации и рациональному использованию казеиновых генотиплв [5].

Полиморфизм гена соматотропина крупного рогатого скота

Соматотропин наряду с функцией регуляции роста животных обладает лактогенным, инсулиноподобным, диабетогенным, жиромобилизующим и нейротропным действием. Регуляторная функция соматотропного гормона реализуется не только в прямом действии на органы - мишени, клетки которых имеют специальные рецепторы на плазматических мембранах, но и в модифицирующем, "пермиссивном" влиянии на эффекты других гормонов и биологически активных соединений.

Развитие техники анализа нуклеиновых кислот позволило перенести исследование генетического полиморфизма на уровень ДНК, что позволяет выявить все возможные варианты конкретного гена. Ген гормона роста (GH - growthhormone) состоит из более 2 тысяч пар оснований. Изменения, которые могут в них происходить (делеции, инсерции, замены и др.), означают образование новых аллелей гена. На уровне структуры белка генетический полиморфизм проявляется лишь только в том случае, если различия между ДНК-аллелями связаны со значащими изменениями в кодирующей части, отмечает Л.А. Калашникова [5].

У европейских пород крупного рогатого скота на уровне белка идентифицированы два аллеля соматотропина, они различаются аминокислотными остатками в положении 127 полипептида. Нуклеотидная замена в V экзоне кодона Leu (СТО) на кодон Val (GTG) приводит к появлению аллельных вариантов и является причиной замены аминокислоты лейцина на валин в положении 127 полипептидной цепи. Аллельные варианты соматотропина, связанные с положением 127 полипептида, наблюдаются у всех изученных пород.

В работе M.C.Luci и соавторов (1993) описано влияние генотипов с аллельными вариантами, связанными с наличием валина либо лейцина в положении 127 полипептидной цепи, на молочную продуктивность. Из представленных в работе данных следует, что гомозиготные коровы по аллелю валина имели более высокую молочную продуктивность.

Диагностика наследственных заболеваний.

 Одним из элементов системы генетической паспортизации сельскохозяйственных животных является контроль над распространением наследственных заболеваний. Сегодня   разработаны и внедрены системы анализа 11 генов наследственных заболеваний у 4 видов сельскохозяйственных животных. Наиболее интенсивно работы ведутся в свиноводстве и скотоводстве, где риск распространения наследственных аномалий особенно велик вследствие интенсивного использования искусственного осеменения и стратегии селекции на лидера, отмечает Н.А. Зиновьева [2].

 Диагностика мутации BLAD и CVM крупного рогатого скота

Особенности ведения современного сельского хозяйства в мировом масштабе приводят к появлению ряда новых проблем. Широкий обмен генетическим материалом между разными странами сопровождается распространением различных инфекционных заболеваний (например, губчатая энцефалопатия у крупного рогатого скота в Англии), а также заболеваний, вызываемых редкими мутациями, возникающими у выдающихся представителей коммерческих пород. В отдельных случаях наблюдается очень высокая скорость распространения таких мутаций. Огромный экономический ущерб в результате их распространения приводит к необходимости строгого генетического контроля импортируемого генетического материала.

Высокая скорость распространения неблагоприятных мутаций возможна только при рецессивном характере их наследования. Не исключено, что быстрое распространение отдельных рецессивных мутаций у сельскохозяйственных видов обусловлено преимуществом гетерозигот в отношении проводимого человеком искусственного отбора.

BLAD (BovineLeukocuytesAdhesionDeficiency), снижение адгейзии лейкоцитов крупного рогатого скота.

Единственным существующим к настоящему времени методом, позволяющим безошибочно выявить носительство мутации BLAD в гетерозиготе, является анализ продуктов амплификации участка гена CD 18 по полиморфизму длин рестрикционных фрагментов с использованием рестриктаз TaqI и НаеШ.

В 2001 году группа датских ученых объявила, что обнаружен ген, вызывающий CVM (ComplexVertebralMalformation) –комплексное уродство позвоночника и разработан тест для его идентификации. Ученые заявили, что CVM становится мировой проблемой в селекции голштинского скота.  Благодаря современным ДНК-технологиям CVM-носители могут быть выявлены в молодом возрасте, тем самым появилась возможность управлять генетической ситуацией в породе, пишет Ю.Н. Козлов [6].

На сегодняшний день проведена большая работа в области анализа рецессивных вредных мутаций (BLAD и CVM). На BLAD проверено 275 быков и на CVM-561 бык производитель станции искусственного осеменения, обнаружена достаточно высокая частота этих мутаций, и быки носители уже выбракованы, что предотвратило  серьезную генетическую опасность этих мутаций для скотоводства, отмечал Л.К. Эрист [7].

Диагностика стрессчувствительности свиней по RYRl-гену

При селекции на мясность часть животных приобретает отрицательные признаки - чувствительность к воздействию стресс- факторов (транспортировка, физическая нагрузка, температура, иммобилизация, галотановый наркоз) и низкое качество мяса (бледное, водянистое, мягкое). Эти признаки имеют генетическую природу, затрагивающую галотановый локус. Повышенная чувствительность к стрессам ведет к экономическому ущербу за счет плохого качества свинины и внезапной смерти животных. Уровень потерь зависит от генетического состава животных [5].

Исследования галотанового локуса генома свиней позволили выявить мутацию в рианодоин - рецепторном гене (RYR1- ген). Показано, что мутация в RYRl-гене является причиной чрезмерно острой реакции свиней на стресс - злокачественного гипертермического синдрома. Наличие этой мутации подтвердилось у различных пород свиней, и было установлено её рецессивное  наследование. На основании анализа последовательности ДНК был предложен метод генной диагностики предрасположенности свиней к стрессам и сконструированы праймеры для ПЦР-анализа аллельных вариантов RYR1 - гена (Г. Брэм, Б. Бренинг, 1993).

Результаты анализов, проведённых в лаборатории биохимической генетики ВНИИплем, указывают, что свиньи новой специализированной скороспелой мясной породы (СМ1) имеют в своем геноме ген, поврежденный мутацией и несущий предрасположенность к стрессам. Частота встречаемости мутантного аллеля составляет в среднем 0,04. Носителями гена в гетерозиготной форме являются 13% хряков и 5% свиноматок.

По результатам проведённых исследований можно заключить, что селекция на мясность сопровождается появлением дефектных генов у свиней крупной белой породы, которая в целом характеризуется высокой устойчивостью к стрессам. Частота гетерозиготных носителей дефектных аллелей у животных мясного направления крупной белой породы составляет в разных регионах Российской Федерации от 2,4% до 9,0%.

Гетерозиготные животные являются фенотипически устойчивыми к стрессу, поэтому особое значение приобретает выявление носителей дефектного аллеля методами генной диагностики. Использование метода ПЦР-ПДРФ позволяет выявить у животных наличие скрытых мутаций в составе гетерозиготного генотипа и контролировать распространение мутантного гена в популяции, пишет Л.А. Калашникова [5].

Диагностика инфекций

Общеизвестно, какое огромное распространение имеет лейкоз, в нашей стране и в мире им поражены десятки миллионов животных. Попытка создания вакцины не увенчалась успехом, отмечал Л.К. Эрнст [7]. Поэтому точная и точная диагностика играет огромную роль в выявлении носителей лейкоза.

Диагностика инфицированности крупного рогатого скота вирусом бычьего лейкоза (BLV- BovineLeukemiaVirus) до сих пор выполняется по оценке наличия у животных антител к антигенам BLVс помощью РИД диагностики. Выполнение такого анализа возможно у животных только после 6 месяцев постнатального развития, его точность зависит от используемых вирусных антигенов и титра антител в крови животного. Метод характеризуется невысокой точностью - известно, что РИД - положительный диагноз подтверждается при патологоанатомическом анализе только в 1 - 8 % случаев (Н.И.Баскаков, А.А.Манько, 1991).

В последнее время все большее распространение получают методы выявления инфекционных агентов путем тестирования присутствия их генетического материала в различных клеточных популяциях хозяина с использованием ПЦР.

В Институте агроэкологии и биотехнологии УААН разработан метод выявления генетического материала BLVв лейкоцитах крупного рогатого скота. Наилучшие результаты были получены с использованием праймеров к гену Env (Y.Yoshinakaetal., 1986).

Размер продуктов амплификации ДНК из культуры FLJC воспроизводился от эксперимента к эксперименту и четко соответствовал заданному по первичной последовательности генов. Он составлял для гена Env- 367 пн, для гена Gag- 364 пн. Выполненные исследования на клеточной культуре FLK, инфицированной вирусом BLV, позволили нам прийти к заключению, что данные две пары праймеров позволяют выявлять наличие интегрированной в клеточный геном ДНК провирусаBLV.