Фармацевтична промисловість України

Реферат

Темою цієї роботи є виробництво  інсуліну в формі суспензії для  інєкцій за допомогою генно-інженерного  штаму Escherichia coli. Обсяг роботи складає 66 сторінки, включає вступ, вісім розділів, та списик використаної літератури, містить 6 таблиць та 2 рисунка.

Ключові слова: інсулін, Escherichia coli, технологія.

ЗМІСТ

Вступ……………………………………………………………………………….4

Розділ 1. Аналіз стану проблеми ………………………………………………...7

             1.1. Характеристика інсуліну…………………………………………... 7

             1.2. Одержання генно-інженерного інсуліну людини……………..….11

Розділ 2. Технологічна частина………………………………………………....13

             2.1. Характеристика готової продукції………………………………...13

             2.2. Обгрунтування вибору технологічної схеми виробництва інсуліну…………………………………………………………………………...28

   2.3. Характеристика біологічного агента……………………………...37

             2.4. Опис технологічного процесу……………………………………..41

             2.5. Матеріальний баланс……………………………………………….59

             2.6. Контроль виробництва……………………………………………..65

РОЗДІЛ 3. Охорона праці…………………………………………………….…78

ВСТУП

Фармацевтична промисловість  України

Фармацевтична галузь України  включає в себе виробництво лікарських засобів і виробів медичного  призначення, оптову і роздрібну  торгівлю, спеціалізоване зберігання і розподіл (дистрибуцію) за допомогою  налагодженої збутової мережі (аптеки, аптечні пункти тощо). Фармацевтична  галузь у розвинутих країнах належить до числа найбільш динамічних і рентабельних, але водночас виступає як особливий  сегмент ринку, що регулюється державними органами влади, а також контролюється  страховою медициною. В останні  роки фармація починає інтегруватися  зі сферою медичних послуг.

Фармацевтична галузь посідає  значне місце і в економіці  України, оскільки є важливим сегментом  національного ринку, багато в чому визначає національну і оборонну безпеку країни, відрізняється великою  наукоємною і розвиненою кооперацією. Упродовж п’яти останніх років галузь демонструє стійку тенденцію до зростання  в грошовому вираженні на рівні  менше 20% на рік. Якщо в 2002-2003 рр. вважалося  великим досягненням приблизитися до обсягу ринку в розмірі 1 млрд USD, то в 2007 р. обсяг ринку перевищив 2 млрд USD.

Українська фармацевтична  промисловість виробляє близько 1400 із 3000 препаратів, що продаються в Україні. Фармацевтичні компанії України  виробляють лікарські засоби майже  в усіх формах (твердих, рідких, порошкоподібних  тощо). Основними групами є серцево-судинні  препарати, анальгетики, вітаміни, засоби для лікування респіраторної  та ендокринної систем, шлунково-кишкового  тракту і антибіотики.

Фармацевтичні субстанції в  Україні виробляють 49 зареєстрованих суб’єктів підприємницької діяльності. У структурі вироблених субстанцій 76 найменувань синтетичного походження, а 82 – природного. Субстанції вітчизняного виробництва складають всього лише 30% від загальної кількості, всі  інші імпортуються з Китаю, Німеччини, Індії, Росії та США.

На фармацевтичному ринку  сьогодні наявна продукція понад 300 виробників з країн далекого зарубіжжя, країн СНД і Балтії, а також 160 вітчизняних виробників, серед  яких 22 виробники, що займалися виробництвом лікарських засобів ще за часів Радянського  Союзу.

Українські фармацевтичні  компанії намагаються диверсифікувати  асортимент з метою задоволення  потреб покупців, з кожним роком  покращуючи якість і асортимент продукції, що випускається. Одним із основних факторів розвитку ринку фармацевтики є загальне зростання купівельної  спроможності населення. Однак дана причина зовсім не єдина. За даними експертів, на ринку спостерігається  тенденція до збільшення частки більш  дорогих і, як правило, ефективніших препаратів за рахунок зниження сегмента дешевих класичних препаратів. Є  також суб’єктивні причини збільшення на ринку частки дорогих препаратів: покупець, як і в інших сферах споживання, наслідує віянням моди. Часто виходить, що фактично люди платять  лише за нову упаковку і бренд.

Актуальність

В Україні, як і в усьому світі, постійно збільшується кількість  хворих цукровим діабетом і в цей  час воно досягає 1,5 млн. чоловік, з  яких більше    300 000 мають потребу  в щоденному прийомі інсуліну. Інсулін відноситься до життєво  важливих лікарських засобів, які Всесвітня  організація охорони здоров'я  рекомендує самостійно виробляти тим  країнам, населення яких перевищує 40 млн. чоловік. Саме тому виробництво  конкурентоспроможного препарату  є актуальним.

Новизна

В даному виробництві використовується як біологічний агент Escherichia coli XLI-Blue/pInsR. Штам-продуцент E.coli XLI-Blue/pInsR характеризується наявністю рекомбінантної плазмідної ДНК pInsR, яка зумовлює стійкість до тетрацикліну і ампіциліну.

Ранише як продуцент проінсуліна  використовувався штам  Е. coli pPINS07,  який мав такі недолки : досить невелика експресія гена відповідного за синтез проінсуліна, відсутність стійкості до антибіотиків,  максимальна  потужність виробництва за умови використання  штаму  Е. coli pPINS07   становить 10 кг/рік.

Клітини E. coli XLI-Blue/pInsR є продуцентом проінсуліна. При індукції ізопропіл-бета-D-тіогалактозідом відбувається інтенсивний синтез даного білка, що накопичується у вигляді тілець включення. Вихід проінсуліна становить більше 30% від сумарного білка клітини, шо дозволить збільшити потужність до 30 кг/рік.[ Патент RU 2383624 C2]

РОЗДІЛ 1. АНАЛІЗ СТАНУ ПРОБЛЕМИ

1.1. Характеристика інсуліну

За хімічною будовою інсулін  — це білок, молекула якого складається  з 51 амінокислоти, що утворюють два  поліпептидні ланцюги, з’єднані між  собою двома дисульфідними містками. У фізіологічній регуляції синтезу  інсуліну домінуючу роль відіграє концентрація глюкози в крові. Проникаючи в  Р-клітини, глюкоза метаболізується  і сприяє підвищенню внутрішньоклітинного вмісту АТФ. Остання, блокуючи АТФ-залежні  калієві канали, викликає деполяризацію  клітинної мембрани. Це сприяє проникненню  в Р-клітини йонів кальцію (через  потенціалзалежні кальцієві канали, які відкрилися) і звільненню інсуліну шляхом екзоцитозу. Крім того, на секрецію інсуліну впливають амінокислоти, вільні жирні кислоти, глікоген, І секретин,електроліти (особливо С2+),автономна нервова  система (симпатична не- і рвова система  має гальмівний, а парасимпатична — стимулюючий вплив).

Фармакодинаміка. Дія інсуліну спрямована на обмін вуглеводів, білків, І жирів, мінералів. Головне в  дії інсуліну — його регулюючий вплив на обмін вуглеводів, зниження вмісту глюкози в крові, і Це досягається  тим, що інсулін сприяє активному  транспорту глюкози та деяких інших  гексоз, а також пентоз через клітинні І мембрани та їх утилізації печінкою, м’язовою і жировою тканинами. Інсулін  стимулює гліколіз, індукує синтез ферментів  (глюкокінази, фосфофруктокінази  і піруваткінази), стимулює пентозофосфатний  цикл, активуючи глюкозофосфатдегідрогеназу, підвищує синтез глікогену, активуючи  глікогенсинтетазу, активність якої  знижена у хворих на цукровий діабет. З іншого боку, гормон пригнічує  глікогеноліз (розкладання глікогену) та гліконеогенез.

Інсуліну належить важлива  роль у стимуляції біосинтезу нуклеотидів, підвищенні вмісту 3,5-нуклеотаз, нуклеозидтрифосфатази, у тому числі в ядерній оболонці, І де вона регулює транспорт м-РНК  з ядра І до цитоплазми. Інсулін  стимулює біосин- І тез нуклеїнових  кислот, білків. Паралель- І но з активізацією анаболічних процесів І інсулін  гальмує катаболічні реакції  розпаду білкових молекул. Він стимулює І також процеси ліпогенезу, утворення  гліцерину і введення його до ліпідів. Поряд з синтезом тригліцеридів, інсулін активує в жирових клітинах синтез фосфоліпідів (фосфатидилхоліну, фосфатидилетаноламіну, фосфатидилінозиту і кардіоліпіну), стимулює також біосинтез холестерину, необхідного, подібно до фосфоліпідів і деяких глікопротеїдів, для побудови клітинних мембран.

За недостатньої кількості  інсуліну пригнічується ліпогенез, підвищується ліполіз, пероксидне окиснення  ліпідів, у крові й сечі підвищується рівень кетонових тіл. Внаслідок  зниженої активності ліпопротеїдліпази  в крові зростає концентрація Р-ліпопротеїдів, які мають суттєве  значення в розвитку атеросклерозу. Інсулін запобігає втраті організмом рідини і К+ з сечею.

Суть молекулярного механізму  дії інсуліну на внутрішньоклітинні процеси розкрито не повністю. Першою ланкою дії інсуліну є зв’язування  із специфічними рецепторами плазматичної мембрани клітин-мішеней, насамперед у  печінці, жировій тканині і м’язах.

Інсулін з’єднується з  ос-субодиницею рецептора (містить  основний інсулінзв’язувальний домен). При цьому стимулюється кіназна  активність Р-субодиниці рецептора (тирозинкіназа), вона аутофосфорується. Створюється  комплекс «інсулін + рецептор», який шляхом ендоцитозу проникає всередину клітини, де інсулін звільняється і запускаються клітинні механізми дії гормону.

У клітинних механізмах дії  інсуліну беруть участь не тільки вторинні посередники: цАМФ, Са2+, комплекс кальцій-кальмодулін, інозиттрифосфат, діацилгліцерол, а  й фруктпозо-2,6-дифосфат, який називають  третім посередником інсуліну в його впливі на внутрішньоклітинні біохімічні процеси. Саме зростання під впливом інсуліну рівня фруктозо-2,6-дифосфату сприяє утилізації глюкози з крові, утворенню з неї жирів.

На кількість рецепторів і здатність їх до зв’язування  впливає низка чинників, зокрема  кількість рецепторів зменшена у  випадках ожиріння, інсулінонезалежного  цукрового діабету, периферичного  гіпер-інсулінізму.

Рецептори інсуліну існують  не тільки на плазматичній мембрані, а  й у мембранних компонентах таких  внутрішніх органел, як ядро, ендоплазматична  сітка, комплекс Гольджі.

Введення інсуліну хворим на цукровий діабет сприяє зниженню рівня  глюкози в крові й накопиченню  глікогену в тканинах, зменшенню  глікозурії і пов’язаних з нею  поліурії, полідипсії.

Внаслідок нормалізації білкового  обміну зменшується концентрація в  сечі азотних сполук, а внаслідок  нормалізації жирового обміну в крові  й сечі зникають кетонові тіла —  ацетон, кислоти ацетооцтова і  оксимасляна. Припиняється схуднення  і зникає надмірне відчуття голоду (булімія). Зростає детоксикаційна функція  печінки, підвищується опірність організму  інфекціям.

Класифікація. Сучасні препарати  інсуліну різняться між собою  за швидкістю і тривалістю дії. їх можна розділити на такі групи:

1. Препарати інсуліну  короткої дії, або прості інсуліни (моноінсулін МК ак-трапід, хумулін,  хоморап та ін.) Зниження рівня  глюкози в крові після їх  введення починається через 15-30 хв, максимальний ефект спостерігається  через 1,5-2 год, дія продовжується  до 6-8 год.

2. Препарати інсуліну  подовженої дії:

а) середньої тривалості (початок через 1,5-2 год, тривалість 8-12 год) — суспензія-інсулін-семіленте, Б-інсулін;

б) тривалої дії (початок  через 6 — 8 год., тривалість 20-30 год.) —  суспензія-інсулін-ультраленте. Препарати  подовженої дії вводять підшкірно  або внутрішньом’язово.

3. Комбіновані препарати,  що містять у своєму складі  інсулін 1—2-ї груп, наприклад  25 % простого інсуліну і 75 % інсуліну-ультраленте.

Деякі препарати випускають у шприц-тюбиках.

Препарати інсуліну дозуються  в одиницях дії (ОД). Дозу інсуліну для  кожного хворого підбирають індивідуально  в умовах стаціонару під постійним  контролем рівня глюкози в  крові й сечі після призначення  препарату (1 ОД гормону на 4-5 г глюкози, що виділяється з сечею; точніший метод розрахунку — врахування рівня  глікемії). Хворого переводять на дієту  з обмеженням кількості легкозасвоюваних вуглеводів.

Залежно від джерела отримання  розрізняють інсулін, виділений  з підшлункових залоз свиней (С), великої рогатої худоби (Г), людський (Н — hominis), а також синтезований методами генної інженерії.

За ступенем очищення інсуліни тваринного походження поділяють на монопікові (МП, зарубіжні — MP) і  монокомпонентні (МК, зарубіжні —  МС).

Показання. Інсулінотерапія  абсолютно показана хворим на інсулінзалежний  цукровий діабет. її слід починати тоді, коли дієта, нормалізація маси тіла, фізична  активність і пероральні протидіабетичні  препарати не забезпечують потрібного ефекту. Інсулін застосовують під  час діабетичної коми, а також  хворим на діабет будь-якого типу, якщо захворювання супроводжується ускладненнями (кетоацидозом, приєднанням інфекції, гангреною тощо); для кращого засвоєння  глюкози при захворюваннях серця, печінки, хірургічних операціях, у  післяопераційному періоді (по 5-Ю  ОД); для поліпшення харчування хворих, виснажених тривалою хворобою; рідко  для терапії шоком — у психіатричній  практиці при деяких формах шизофренії; у складі поляризуючої суміші при  захворюваннях серця.

Протипоказання: захворювання з гіпоглікемією, гепатит, цироз  печінки, панкреатит, гломерулонефрит, нирково-кам’яна хвороба, виразкова  хвороба шлунка і дванадцятипалої  кишки, декомпенсовані вади серця; для  препаратів подовженої дії — коматозні стани, інфекційні захворювання, в період хірургічного лікування хворих на цукровий діабет.

Побічна дія: болючість ін’єкцій, місцеві запальні реакції (інфільтрати), алергічні реакції.

При передозуванні інсуліну може виникнути гіпоглікемія. Симптоми гіпоглікемії: неспокій, загальна слабкість, холодний піт, тремтіння кінцівок. Значне зниження глюкози в крові призводить до порушення функцій мозку, розвитку коми, судом і навіть смерті. Хворі  на цукровий діабет для запобігання  гіпоглікемії повинні мати при собі кілька шматочків цукру. Якщо після  прийняття цукру симптоми гіпоглікемії не зникають, потрібно терміново внутрішньовенно  ввести 20-40 мл 40 % розчину глюкози, підшкірно 0,5 мл 0,1 % розчину адреналіну. У випадках значної гіпоглікемії внаслідок  дії подовжених препаратів інсуліну хворих з цього стану вивести  важче, ніж з гіпоглікемії, викликаній препаратами інсуліну короткої дії. Наявність у деяких препаратах подовженої дії білка протаміну пояснює  досить часті випадки алергічних реакцій. Проте ін’єкції препаратів інсуліну подовженої дії менш болючі, що пов’язано з вищим рН цих  препаратів.[1]

1.2. Одержання генно-інженерного інсуліну людини

В 1980 р. американськими вченими  Міллером і Бакстером був уперше описаний процес клонування людського  гена в Еscherichia coli з наступною індукцією й одержанням білка, ідентичного людському. Цим білком був інсулін людини.

У промислових умовах рекомбінантний інсулін уперше отриманий американською  фармацевтичною компанією Eli Lilly разом  з біотехнологічною компанією Genentech (США).

Генно-інженерний інсулін виготовляють шляхом ферментації генетично змінених мікроорганізмів (кишкової палички, дріжджів), які здатні синтезувати попередник інсуліну (проінсулін) у складі химерного протеїну. З отриманого біосинтетичним шляхом проміжного продукту ензиматичним шляхом реконструюють інсулін людини.

Дана схема багато в  чому нагадує процес біосинтезу інсуліну в острівцях Лангерганса, де гормон спочатку з'являється у вигляді  білка-попередника (проінсулину), а  потім протеолітичними ферментами від проінсулину відщеплюється  сполучний С-пептид у спеціальних  везикулах. У виробництві для  розщеплення ГБ використають подібні  по специфічності ферменти: трипсин  і карбоксипептидазу Б. Гідроліз проводять шляхом обробки ферментами послідовно або одночасно.

Технологія одержання генно-інженерного інсуліну людини, також заснована на використанні генетично модифікованих дріжджових культур у ролі суперпродуцентів інсуліну людини. Використання еукаріот, що мають подібну з людською систему процессінгу білків, у ролі продуцентів інсуліну дозволило одержати гормон або його попередника в нативній формі. Значною перевагою даної технології є повна відсутність у препараті бактеріальних ендотоксинів і пірогенів клітинної стінки. Незважаючи на всі ці переваги одержання інсуліну з використанням бактеріальних штаммів-суперпродуцентів залишається кращим завдяки більше високому рівню експресії інсуліну в складі гібридного білка.

РОЗДІЛ 2. ТЕХНОЛОГІЧНА ЧАСТАНА

2.1.Характеристика готової продукції

ІНСУЛІН 100 суспензія для ін'єкцій, 100 МО/мл у флаконах по 10 мл.

Склад на один флакон:

Діючі речовини:  10 мл суспензії містить 1000 МО iнсулiну людського бiосинтетичного, що еквівалентно 34,7 мг.

Допоміжні речовини:  Цинку хлорид (3.2 мг/мл), гліцерин(100 мг/мл), метакрезол (1,5 мг/мл), фенол (0,65 мг/мл), натрію фосфат двозаміщений дигідрат (2,1 мг/мл), протаміну сульфат(10,2), вода для ін'єкцій.

Фармаколгічна дія 

Фармакодинаміка. ІНСУЛІН 100 є суспензією людського інсуліну. Цукрознижувальний ефект інсуліну полягає у сприянні поглинанню глюкози тканинами після зв'язування інсуліну з рецепторами м'язових і жирових клітин, а також в одночасному пригніченні виділення глюкози з печінки.

ІНСУЛІН 100 є інсуліном тривалої дії. У середньому характер дії після підшкірної    ін'єкції такий:

початок дії:                         протягом 1,5 години;

максимальний ефект:        від 4 до 12 годин;

тривалість дії:                    приблизно 24 години.

Фармакокінетика. Період напіввиведення інсуліну з крові становить кілька хвилин. Тому характер дії препарату інсуліну зумовлений виключно характеристиками його абсорбції.  Цей процес залежить від ряду факторів (наприклад, дози інсуліну, способу і місця ін'єкції, товщини підшкірної клітковини, типу діабету), що зумовлює значну варіабельність ефекту препарату інсуліну як в одного, так і в різних хворих.

Абсорбція. Пік концентрації у плазмі настає протягом 2-18 годин після підшкірної ін'єкції.

Розподіл. Значного   зв'язування   інсуліну   з   білками   плазми   крові,   за   винятком циркулюючих антитіл до нього (при їхній наявності), виявлено не було.

Метаболізм. Людський   інсулін розщеплюється інсуліновими протеазами чи інсулін-деградуючими ферментами і, можливо, протеїндисульфідизомеразою. Виявлено  ряд ділянок, у яких відбуваються гідроліз молекули людського інсуліну. Жоден із метаболітів, що утворилися після гідролізу, не має біологічної активності.

Елімінація. Тривалість напіввиведення інсуліну визначається швидкістю його всмоктування з підшкірної клітковини. От чому тривалість напіввиведення (tЅ) вказує на швидкість всмоктування, а не елімінації інсуліну з плазми крові (tЅ інсуліну з кровотоку становить всього кілька хвилин). За даними проведених досліджень, tЅ становить                5-10  годин. Можна вважати, що фармакокінетика інсуліну в дітей, підлітків і дорослих практично однакова.

Специфікація на ІНСУЛІН 100

 Властивості

Опис. Нейтральна каламутна біла водна суспензія. Визначається візуально.

Ідентифікація

А. Переглядають хроматограму, одержану у випробувані «Кількісне визначення».

Результати: на хроматограмі випробовуваного розчину час  утримування основного піка має  співпадати із часом утримування  основного піка на хроматограмі розчину  порівняння.

B. Пептидне  картування (2.2.55).

Селективний розрив пептидних  зв'язків

Випробовуваний розчин. Готують  розчин 2.0 мг/мл випробовуваної субстанції в 0.01 М розчині кисіоти хлористоводневої, 500 мкл одержаного розчину переносять у чисту пробірку і додають 2.0 мл HEPES буферного розчину рН 7.5 Р  і 400 мкл розчину І мг/мл протеази Staphylococcus aureus штам VS. тип XV11-B P. Пробірку закривають та інкубують при температурі 25 °С протягом 6 год. Реакцію зупиняють  додаванням 2.9 мл сульфатного буферного  розчину рН 2.0 Р.

Розчин порівняння. Готують  аналогічно випробовуваному розчину, замість випробовуваної субстанції додають ФСЗ  інсуліну лізпро.

Хроматографічне розділення

Рідинна хроматографія (2.2.29).

Колонка:

— розмір: 0.10 м х 4.6 мм.

— нерухома фаза: силікагель октадецилсилільний для хроматографії      Р (3 мкм) із розміром пop 8 нм.

— температура: 40 °С.

Рухома фаза:

— рухома фаза А: змішують 200 мл сульфатного буферного розчину  рН 2.0 Р. 700 мл води Р і 100 млацетонітрилу для хроматографії Р: фільтрують і дегазують;

— pyxoмa фаза В: змішують 200 мл сульфатного буферного розчину рН 2.0 Р, 400 мл води Р, 400 мл ацетонітрилу для хроматографії Р; фільтрують і дегазують;

Таблиця 1.1

Програма хроматографії

           Швидкість рухомої фази: 1 мл/хв.

Детектування: спектрофотометрично  за довжини хвилі 214 нм.

Урівноваження колонки: не менше 15 хв за вихідних умов. Хроматограму холостого  розчину одержують, використовуючи наведений вище градієнт.

Об'єм інжекції: 50 мкл.

Придатність хроматографічної системи:

— хроматоірами випробовуваного  розчину та розчину порівняння мають  співпадати із хроматограмою інсуліну людського, що додається до ФСЗ інсуліну людського,

— на хроматограмі розчину  порівняння ідентифікують піки, що відповідають фрагментам I, II і III:

— коефіцієнт симетрії: не більше 1.5 для піків, що відповідають фрагментам II і III,

— коефіцієнт розділення: не менше 3.4 для піків, що відповідають фрагментам II і III.

Результати: хроматографічний профіль випробовуваного розчину  має відповідати хроматографічному  профілю розчину порівняння.

ПРИМІТКА : час утримування  фрагмента І однаковий для  інсуліну свинячого та для інсуліну людського. Часи утримування фрагментів II і IV однакові для всіх інсулінів. Час  утримування фрагмента III однаковий  для інсуліну бичачого та для інсуліну свинячого.

 Випробування

Стерильність. (2.6.1) Випробування проводять, використовуючи метод мембранної фільтрації або метод прямого висівання. Незалежно від методу випробування проводять відповідний негативний контрольний дослід, використовуючи зразки, стерильність яких була доведена раніше. Метод мембранної фільтрації треба використовувати в усіх випадках, коли природа випробовуваного лікарського засобу це дозволяє — для випробування лікарських засобів у вигляді водних розчинів, що піддаються фільтрації; карських засобів, що змішуються або розчиняються у водних розчинниках, або оліях, які не мають антимікробної активності за умов випробування.

Випробування методом  мембранної фільтрації. Використовують мембранні фільтри з номінальним  розміром пор не більше 0.45 мкм, здатні ефективно затримувати мікроорганізми. Для водних, розведених спиртових  розчинів та розчинів в оліях, наприклад, використовують целюлозно-нітратні мембранні фільтри, а для концентрованих спиртових розчинів — целюлозно-ацетатні мембранні фільтри. Якщо необхідно, для деяких лікарських засобів, наприклад, для антибіотиків, можуть бути використані спеціальні мембранні фільтри.

Умови проведення випробування треба регулярно контролювати шляхом аналізу проб, відібраних відповідним  чином у робочій зоні, або проведення інших контрольних заходів, викладених у відповідних Директивах Європейського  Співтовариства і примітках до керівних матеріалів з GMP.

Токсичність. (2.6.9) Випробування проводять на здорових білих мишах масою 19-21г, на яких раніше не проводили ніяких дослідів.

За 24 год. до випробування та під час його проведення тварини  повинні знаходитися в приміщенні з постійною температурою. За 2 год. до зважування та відбору тварин для  проведення випробувань у них  відбирають корм і воду.

Кожну серію препарату  випробовують на 5 мишах. Розчинник, концентрація розчину (тест-доза) та спосіб введення вказані в окремих статтях.

Препарат вважають витримавшим  випробування, якщо протягом передбаченого  терміну спостерігання не загине жодна із піддослідних мишей. У випадку  загибелі однієї миші дослід повторюють на 5 мишах масою 20±0,5 г; у випадку загибелі при початковому випробуванні двох мишей повторне випробування проводять на 15 тваринах. Якщо при повторному випробуванні ні одна миша не загине, тобто сумарна гибель тварин в обох дослідах не перевищить 10%, препарат вважається витримавшим випробування. В противному випадку препарат бракують.

Для випробування на токсичність  відбирають по 2 флакона із кожної серії, що містить не більше 10 000 флаконів. При кількості в серії флаконів більше 10 000 відбирають по 3 флакона  із кожної серії. Для проведення випробування із відібраних флаконів готують загальний розчин (змішана проба). Загальна кількість лікарського засобу повинна бути достатньою для проведення трьох повних випробувань.

Пірогенність. (2.6.8) Випробування проводять на здорових кроликах масою 2-3,5 кг, яких тримали на повноцінному раціоні. Кожний кролик повинен знаходитися в окремій клітці в приміщенні з постійною температурою. Коливання температури не можуть перевищувати±3°С.

Протягом тижня, що передує  досліду, кролики не повинні втрачати масу. Зважування їх проводять до дачі корму не менш ніж 3 рази через день. Тварини, які втрачають масу, до досліду  не придатні. Протягом 3 діб перед  випробуванням у кожного піддослідного  кролика міряють температуру, яка  повинна бути в межах 38,5-39,5°С. тварини з більш високою чи більш низькою температурою для досліду не придатні. Крім того, кроликів, вперше назначених для випробування лікарських засобів, перевіряють на реактивність шляхом внутрішньовенного введення 10мл/кг 0,9 % стерильного непірогенного розчину натрію хлориду, який відповідає вимогам фармакопейної статті. У випадку зміни температури  у кроликів більш ніж на ±0,4°С тварини вважаються непридатними для досліду.

Для дослідження відбирають не менш ніж 2 флакони від кожної серії, що містить від 1 000 до 10 000 флаконів. При кількості в серії флаконів більш ніж 10 000 відбирають по 3 флакони  із кожної серії. Із відібраних флаконів готують загальний розчин (змішана  проба). Від серії, яка містить  до 1 000 флаконів, для випробування відбирають по 1 флакону.