Физико-химические методы анализа антибиотиков

Федеральное агентство  по образованию

Государственное образовательное учреждение

высшего профессионального  образования

Казанский национальный исследовательский технологический  университет

Курсовая работа

на тему:

            «Физико-химические методы анализа антибиотиков»

                                                                       Выполнил: студентка гр.620311

                                                                       Тарасова А.О

                                                                       Проверил:

Содержание

Введение

Литературный  обзор

1. Антибиотики
1. Характеристика антибиотиков
2. Классификация антибиотиков
2. Физико-химические методы анализа антибиотиков
1. Бумажная хроматография и электрофорез
2. Колориметрия и спектрофотометрия в видимом свете

2.3 Спектрофотометрия в ультрафиолетовом свете

2.4 Инфракрасная спектроскопия

2.5 Флюорометрия

2.6 Оптическое вращение

2.7 Электрохимические методы

2.8 Полярография

2.9 Амперметрическое (полярометрическое) титрование

2.10 Кондуктометрия

2.11 Радиоактивные изотопы в анализе антибиотиков

Выводы

Список цитируемой литературы

Введение

Антибиотики занимают особое место в современной медицине. Они являются объектом изучения различных  биологических и химических дисциплин. Наука об антибиотиках развивается бурно. Если это развитие началось с микробиологии, то теперь проблему изучают не только микробиологи, но и фармакологи, биохимики, химики, радиобиологи, врачи всех специальностей [1-5].

Антибиотики представляют собой самую многочисленную группу лекарственных средств. Они используются для предотвращения и лечения воспалительных процессов, вызванных бактериальной микрофлорой. Сфера антибиотиков - это быстро прогрессирующие инфекции или бактериальное заражение жизненно важных органов, с которыми иммунная система не может справиться сама. Антибиотики незаменимы при остром развитии болезни - ангины и пневмонии, а также при инфекционном воспалении, которое локализуется в закрытых полостях (отит, гайморит, остеомиелит, абсцесс, флегмона).

За последние 35 лет открыто около ста антибиотиков с различным спектром действия, однако, в клинике применяется ограниченное число препаратов. Это объясняется  главным образом тем, что большинство  антибиотиков не удовлетворяют требованиям  практической медицины [2, 3].

В настоящее  время ведутся активные работы по изысканию антибиотиков нового поколения, эффективных при лечении вирусных и раковых заболеваний.

Литературный  обзор

1. Антибиотики

1. Характеристика антибиотиков

Термин «антибиотик» был впервые предложен С.А. Ваксманом (США). Под этим термином он подразумевал вещества, образуемые микроорганизмами и обладающие антимикробным действием (от лат. «анти»- противо и «биос» - жизнь), т. е. действующие против основных жизненных свойств микробов. В дальнейшем вещества, обладающие антибиотическими свойствами, были обнаружены в растениях - фитонциды (В.П. Токин), крови человека и животных - эритрин (Л.А. Зильбер в Л.М. Якобсон) и других природных источниках [1, 2]. В связи с этим понятие «антибиотик» расширилось, и в настоящее время под антибиотиками следует понимать специфические продукты жизнедеятельности, обладающие высокой физиологической активностью по отношению к определенным группам микроорганизмов (вирусам, бактериям, актиномицетам, грибам, водорослям, протозоа) или к злокачественным опухолям, избирательно задерживая их рост или полностью подавляя развитие [3].

Начало развития науки  об антибиотиках относится к 40-м  годам нашего столетия, когда было открыто сильное химиотерапевтическое средство против бактериальных инфекций - пенициллин.

В результате большой  работы советских ученых и медицинской  промышленности СССР в сравнительно короткое время было организовано производство всех важнейших антибиотиков, имеющих  значение для медицинской практики [2, 4].

Работа по изысканию  антибиотиков требует тесного сотрудничества микробиологов (изыскание продуцентов  новых антибиотиков), химиков (выделение  активно действующих веществ  из культуральной жидкости продуцентов), химиотерапевтов, фармакологов, гистологов, испытывающих лечебное действие новых антибиотиков в опытах на животных.

В этом комплексе  необходимо также участие инженеров  и технологов, располагающих специальным  оборудованием, необходимым для  получения образцов новых антибиотиков в количествах, требуемых для дальнейшего изучения [2-5].

Для успешной работы в этом направлении в нашей  стране были созданы специализированные научные институты: НИИ по изысканию  новых антибиотиков АМН СССР, Ленинградский  НИИ антибиотиков; Всесоюзный НИИ  антибиотиков Министерства медицинской промышленности СССР, и др.

Развитие отечественной  науки об антибиотиках (изыскание, установление строения, разработка производственных методов получения) связано с  именами крупнейших советских ученых: 3.В. Ермольевой, М.М. Шемякина, Г.Ф. Гаузе, М.Т. Бражниковой, А.С. Хохлова, С.М. Навашина и многих других.

Известно уже  около 3000 антибиотических веществ, из которых химиотерапевтическим действием  обладает около 300.

По своей  химической природе антибиотики  представляют органические соединения, относящиеся к самым различным классам соединений [4].

Антибиотики, в  отличие от других продуктов жизнедеятельности, имеют два характерных свойства [2]:

• проявляют высокую биологическую активность по отношению к чувствительным к ним организмам. Даже в очень небольших концентрациях они проявляют высокое физиологическое действие, например пенициллин оказывает бактерицидное- действие в отношении чувствительных к нему бактерий в концентрации 0,000001 г/мл;
• обладают избирательностью действия. Каждый антибиотик проявляет свое действие лишь по отношению к отдельным», вполне определенным организмам или к группам организмов, не проявляя при этом заметного действия на другие формы микроорганизмов. Например, пенициллин задерживает развитие лишь некоторых грамположительных бактерий (кокков, стрептококков и др.) и не оказывает действия на грамотрицательные бактерии, грибы или другие группы микроорганизмов. Таким образом, каждый антибиотик характеризуется своим специфическим, антимикробным спектром действия [6].

Учение об антибиотиках - молодая синтетическая ветвь современного естествознания. Впервые в 1940 году был получен в кристаллическом виде химиотерапевтический препарат микробного происхождения - пенициллин - антибиотик, открывший летоисчисление эры антибиотиков [7].

Многие учёные мечтали о создании таких препаратов, которые можно было бы использовать при лечении различных заболеваний человека, о препаратах, способных убивать патогенных бактерий, не оказывая вредного действия на организм больного.

Пауль Эрлих (1854-1915) в результате многочисленных опытов синтезировал в 1912 году мышьяковистый препарат - сальварсан, убивающий in vitro возбудителя сифилиса. В 30-х годах прошлого столетия в результате химического синтеза были получены новые органические соединения - сульфамиды, среди которых красный стрептоцид был первым эффективным препаратом, оказавшим терапевтическое действие при тяжёлых стрептококковых инфекциях [5-7].

В 1937 году в нашей  стране был синтезирован сульфидин - соединение, близкое к пронтозилу. Открытие сульфамидных препаратов и применение их в медицинской практике составило известную эпоху в химиотерапии многих инфекционных заболеваний, в том числе сепсиса, менингита, пневмонии, рожистого воспаления, гонореи и некоторых других [6].

Луи Пастер и  С. Джеберт в 1877 году сообщили, что аэробные бактерии подавляют рост Bacillus anthracis.

В конце XIX века В.А. Манассеин (1841-1901) и А.Г. Полотебнов (1838-1908) показали, что грибы из рода Penicillium способны задерживать в условиях in vivo развитие возбудителей ряда кожных заболеваний человека.

И.И. Мечников (1845 - 1916) ещё в 1894 году обратил внимание на возможность использования некоторых сапрофитных бактерий в борьбе с патогенными микроорганизмами.

В 1896 году Р. Гозио  из культурной жидкости Penicillium brevicompactum выделил кристаллическое соединение - микофеноловую кислоту, подавляющее рост бактерий сибирской язвы [4].

Эммирих и Лоу  в 1899 году сообщили об антибиотическом  веществе, образуемом Pseudomonas pyocyanea, они  назвали его пиоцианазой; препарат использовался в качестве лечебного фактора как местный антисептик.

В 1910-1913 годах O. Black и U. Alsberg выделили из гриба рода Penicillium пеницилловую кислоту, обладающую антимикробными свойствами.

В 1929 году А. Флемингом  был открыт новый препарат пенициллин, который только в 1940 году удалось выделить в кристаллическом виде.

С получением пенициллина  как препарата (1940 год) возникло новое  направление в науке - учение об антибиотиках, которое необычайно быстро развивается  в последние десятилетия [8].

В 70-х годах ежегодно описывалось более 300 новых антибиотиков. В 1937 году Вельш описал первый антибиотик стрептомицетного происхождения актимицетин, в 1939 году Красильниковым и Кореняко был получен мицетин и Дюбо - тиротрицин. Впоследующем число антибиотиков росло очень быстрыми темпами.

Большинство бактерий состоит из одной клетки; каждая имеет защитную оболочку (рис.1.). Их классифицируют и распознают по свойствам их клеточных оболочек. Это обычно проявляется при помощи метода окраски, разработанного Х. Грамом в 1884г. Грамположительные бактерии легко окрашиваются первым красителем, а грамотрицательные - не окрашиваются [7, 8].

Бактерии  также можно классифицировать по их форме. Кокки - круглые, бациллы имеют  форму палочек, а спирохеты - спирали. Если кокки выстроены в прямую линию, их называют стрептококками; если они в виде грозди, тогда их называют стафилококками. Диплококки встречаются парами.

По  другой классификации бактерии делятся  на тех, которым требуется свободный  кислород в воздухе - аэробов, и которым  он не требуется - анаэробов.

У анаэробных и аэробных бактерий во многих инфекциях  общая роль. Как анаэробы, так  и аэробы могут быть и грамположительными, и грамотрицательными. Анаэробные бактерии особенно часто встречаются в  голове и шее, верхних дыхательных путях, нижнем отделе желудочно-кишечного тракта, половых органах и иногда - в коже и мягких тканях. Их роль в инфекциях не всегда признается, частично по причине сложностей с подтверждением диагноза, так как необходимо собрать и перевезти образцы в "безвоздушном" контейнере, чтобы не допустить загрязнения аэробными бактериями [6, 8]. Несколько антибиотиков очень "широкого спектра", введенных в практику в последние годы, весьма малоактивны в отношении анаэробных патогенных микроорганизмов; это важно учитывать, когда такие средства предлагаются в качестве монотерапии при смешанных инфекциях.

Рис.1. Основные механизмы действия ряда антибиотиков на бактериальную клетку [6].

Некоторые бактерии, особенно те, которые живут  в кишечнике человека, играют существенную роль в его жизни. Например, некоторые из них синтезируют витамины. Неразборчивое использование антибиотиков широкого спектра действия может уничтожить эти полезные бактерии.

При назначении антибактериальных препаратов происходит подавление роста не только патогенных микроорганизмов, но и нормальной микрофлоры кишечника. В результате размножаются сапрофитные микробы, приобретая патогенные свойства и высокую устойчивость к лекарственным препаратам. К ним относятся стафилококки, протей, дрожжевые грибки, энтерококки, синегнойная палочка, клебсиелла [7].

Рис.2. Основные возбудители заболеваний и антибиотики  воздействующие на них.

2.  Классификация антибиотиков

По химическому  строению антибиотики делятся на:

• бета-лактамные антибиотики;
• аминогликозиды;
• тетрациклины;
• макролиды;
• линкозамиды;
• гликопептиды;
• полипептиды;
• полиены;
• антрациклиновые антибиотики.

Основу молекулы бета-лактамных антибиотиков составляет бета-лактамное кольцо. К ним относятся:

- пенициллины - группа природных и полусинтетических антибиотиков, молекула которых содержит 6-аминопенициллановую кислоту, состоящую из 2 колец - тиазолидонового и бета-лактамного. Среди них выделяют:

- биосинтетические (пенициллин G - бензилпенициллин);

- аминопенициллины (амоксициллин, ампициллин, бекампи-циллин);

- полусинтетические "антистафилококковые" пенициллины (оксациллин, метициллин, клоксациллин, диклоксациллин, флуклоксациллин), основное преимущество которых - устойчивость к микробным бета-лактамазам, в первую очередь стафилококковым;

- цефалоспорины - это природные и полусинтетические антибиотики, полученные на основе 7-аминоцефалоспориновой кислоты и содержащие цефемовое (также бета-лактамное) кольцо, т. е. по структуре они близки к пенициллинам. Они делятся на цефалоспорины:

- 1-го поколения - цепорин, цефалотин, цефалексин;

- 2-го поколения - цефазолин (кефзол), цефамезин, цефаман-дол (мандол);

- 3-го поколения - цефуроксим (кетоцеф), цефотаксим (кла-форан), цефуроксим аксетил (зиннат), цефтриаксон (лонга-цеф), цефтазидим (фортум);

- 4-го поколения - цефепим, цефпиром (цефром, кейтен) и др.;

- монобактамы - азтреонам (азактам, небактам);

- карбопенемы - меропенем (меронем) и имипинем, применяемый только в комбинации со специфическим ингибитором почечной дегидропептидазы циластатином - имипинем/цилас-татин (тиенам).

Аминогликозиды  содержат аминосахара, соединенные  гликозидной связью с остальной  частью (агликоновым фрагментом) молекулы. К ним относятся:

- синтетические аминогликозиды - стрептомицин, гентамицин (гарамицин), канамицин, неомицин, мономицин, сизомицин, тобрамицин (тобра);

- полусинтетические аминогликозиды - спектиномицин, амика-цин (амикин), нетилмицин (нетиллин).

Основу молекулы тетрациклинов составляет полифункциональное гидронафтаценовое соединение с  родовым названием тетрациклин. Среди них имеются:

- природные тетрациклины - тетрациклин, окситетрациклин (клинимицин);

- полусинтетические тетрациклины - метациклин, хлортетрин, доксициклин (вибрамицин), миноциклин, ролитетрациклин.

Препараты группы макролидов содержат в своей молекуле макроциклическое лактоновое кольцо, связанное с одним или несколькими углеводными остатками. К ним относятся:

- эритромицин;

- олеандомицин;

- рокситромицин (рулид);

- азитромицин (сумамед);

- кларитромицин (клацид);

- спирамицин;

- диритромицин.

К линкозамидам относятся линкомицин и клиндамицин. Фармакологические и биологические  свойства этих антибиотиков очень близки к макролидам, и, хотя в химическом отношении это совершенно иные препараты, некоторые медицинские источники  и фармацевтические фирмы - производители химиопрепаратов, например делацина С, относят линкозамины к группе макролидов.

Препараты группы гликопептидов в своей молекуле содержат замещенные пептидные соединения. К ним относятся:

- ванкомицин (ванкацин, диатрацин);

- тейкопланин (таргоцид);

- даптомицин.

Препараты группы полипептидов в своей молекуле содержат остатки полипептидных соединений, к ним относятся:

- грамицидин;

- полимиксины М и В;

- бацитрацин;

- колистин.

Препараты группы полиенов в своей молекуле содержат несколько  сопряженных двойных связей. К ним относятся:

- амфотерицин В;

- нистатин;

- леворин;

- натамицин.

К антрациклиновым антибиотикам относятся противоопухолевые антибиотики:

- доксорубицин;

- карминомицин;

- рубомицин;

- акларубицин.

Есть еще несколько  достаточно широко используемых в настоящее время в практике антибиотиков, не относящихся ни к одной из перечисленных групп: фосфомицин, фузидиевая кислота (фузидин), рифампицин.

Беталактамные антибиотики (b - лактамы) - самая большая группа антимикробных препаратов, включающая более 50 (25% от общего числа антибактериальных препаратов) наименований, объединенных наличием в их химической структуре b-лактамного кольца, отвечающего за антимикробную активность; при разрушении b-лактамного кольца антимикробная активность препарата теряется. Основные особенности и приемущества перед другими группами лекарственных средств связаны со способностью этих препаратов подавлять рост возбудителей инфекций без серьезного побочного воздействия на организм больного.

Концентрации антибиотиков в сыворотке крови и жидкостях организма человека должны соотносится с двумя основными подходами. Первый из них заключается в фармакокинетической оценке препаратов.

Определяя уровни препаратов в организме, можно установить характер всасывания, распределения, проникновения в ткани, метаболической деградации и экскреции антибиотиков. При втором подходе используются уровни концентраций антибиотиков в крови для модификации дозирования антибиотиков с целью достижения максимальной терапевтической эффективности и устранения дозозависимой токсичности [7].

Классификация b - лактамов по химическому строению приведена на рис.3. Большую часть b - лактамных антибиотиков составляют пенициллины и цефалоспорины. Основа всех пенициллинов представлена тиазолидиновым кольцом, соединенным с b - лактамным кольцом, имеющим аминогруппу (R–NH-). Путем изменения радикалов были созданы полусинтетические пенициллины, резистентные к b - лактамазам, кислотоустойчивые, активные в отношении грамотрицательных микроорганизмов.

Рис. 3. Классификация антибиотиков b - лактамного ряда по химическому строению

Пенициллины можно  подразделить на следующие подгруппы:

• Природные (феноксиметилпенициллин, бензилпенициллин);
• Аминопенициллины (ампициллин, амоксициллин);
• Пенициллиназостабильные (оксациллин, клоксациллин, диклоксациллин);
• Защищенные (амоксициллин/клавуланат, «Ампиокс»)

Новые перспективы  повышения эффективности b-лактамов открылись в связи с получением ингибиторов беталактамаз (клавулановая кислота, сульбактам). Их применение в комбинации со старыми пенициллинами (ампициллин, тикарциллин) повысило эффективность полусинтетических пенициллинов в отношении резистентных штаммов до уровня цефалоспоринов III поколения, расширило спектр их действия [8]. Сулациллин –комбинированный препарат, состоящий из ампициллина и ингибитора беталактамаз сульбактама в соотношении 2:1. Действующим началом сулациллина является ампициллин, второй компонент сочетания – сульбактам – самостоятельной антибактериальной активностью не обладает. Сульбактам в составе сулациллина восстанавливает антибактериальную активность ампициллина в отношении устойчивых возбудителей, расширяет его антимикробный спектр. Сулациллин по показаниям и терапевтической эффективности приближается к цефалоспоринам II – III поколения [9].

Основа всех цефалоспоринов представлена дигидротиазолидиновым  кольцом, соединенным с b - лактамным кольцом. Собственно антимикробная активность природных цефалоспоринов (цефалоспорин-С) низкая, однако присоединение различных радикалов в положении 7 и в положении 3 резко усиливает их биологическую активность и устойчивость к b-лактамазам.

Цефалоспорины принято делить на четыре поколения, отличающихся между собой по спектру  антимикробного действия.

Первое  поколение: цефазолин, цефалотин, цефалоридин - препараты для парентерального введения; цефрадин, цефалексин, цефадроксил - препараты для приема внутрь.

Второе  поколение: цефамандол, цефокситин, цефотетан, цефметазол, цефуроксим - для парентерального применения; цефуроксим аксетил, цефаклор - для приема внутрь.

Третье  поколение: цефотаксим, цефоперазон, цефтриаксон, цефтизоксим, цефтазидим, цефодизим, цефменоксим, цефиксим, цефоперазон, цефсулодин, цефтазидим. цефпирамид, цефпимазол - для парентерального применения: цефтибутен, цефетамет пивоксил, цефподоксим проксетил, цефдинир, цефиксим, цефпрозид - для перорального применения.

Четвертое поколение: цефпиром и цефепим.

Название и  формулы b-лактамных антибиотиков приведены в табл. 1.

Таблица 1. Название и химическая формула антибиотиков b-лактамного ряда

2.  Физико-химические методы анализа антибиотиков

Для качественной идентификации антибиотиков, в отличие  от ряда групп природных соединений (алкалоиды, гликозиды), не существует общих, групповых реакций. Различные антибиотики дают те или другие реакции, преимущественно цветные [10, 11].

Для идентификации антибиотиков в настоящее время широко используется спектральная характеристика.

Для количественного определения  антибиотиков используются различные  методы: биологические, химические, физико-химические.

Биологические методы основаны на непосредственном биологическом  действии антибиотика на применяемый  тест-микроорганизм, чувствительный к данному антибиотику.

Из биологических методов  количественного определения антибиотиков наибольшее распространение получил  метод диффузии в агар с турбидиметрическим определением, основанным на измерении  концентрации клеток тест-микроба, образующих определенную оптическую плотность среды (мутность) в результате их роста в присутствии небольшого количества антибиотиков.

Недостатками биологических  методов контроля являются затраты  большого количества времени на анализ, а также зависимость точности результатов анализа от многих внешних факторов [6-14].

В последние  годы широкое распространение для  количественного определения антибиотиков получили химические и физико-химические методы, из которых наибольшее применение имеют фотоколориметрический и спектрофотометрический методы. Последние основаны на использовании определенных свойств антибиотиков: цветные реакции, появление или исчезновение характерных полос в УФ- или ИК-областях спектра под воздействием различных реагентов (кислот, щелочей и др.).

Задача качественно  анализа определить неизвестный  антибиотик встаёт как при изучении новых антибиотиков, так и в  практике, если нужно показать присутствие  антибиотика в фармацевтических препаратах.

Многие антибиотики, как, например, пенициллин, стрептомицин, эритромицин, бацитрацин, неомицин, полимиксин и т. д., не являются химически индивидуальными веществами, а представляют собой смесь нескольких структурно сходных веществ. Бумажная хроматография и электрофорез на бумаге позволяют выделить эти составные части и отделить их количественно [13].

1.   Бумажная хроматография и электрофорез

Многие антибиотики, как, например, пенициллин, стрептомицин, эритромицин, бацитрацин, неомицин, полимиксин и т. д., не являются химически индивидуальными веществами, а представляют собой смесь нескольких структурно сходных веществ. Бумажная хроматография и электрофорез на бумаге позволяют выделить эти составные части и отделить их количественно [12-19].

Для изучения антибиотиков можно применять нисходящую, восходящую и горизонтальную хроматографию. Выбор системы растворителей зависит от химической природы антибиотика [12-16].

Зоны отдельных  антибиотиков выявляются на хроматограммах или электрофотограммах чаще всего  биоавтографически, т. е. методом, подобным определению антимикробной активности антибиотиков чашечным методом. Хроматограмму на узкой полоске фильтровальной бумаги после её высушивания кладут на лоток с твёрдой агаровой средой, засеянной суспензией тест-микроба. Лоток помещают на несколько часов в термостат при 37º. В ходе инкубации микроб, посеянный на агар, вырастает, так что агар мутнеет и становится молочно-белым. Он не растёт, однако, вокруг тех мест полосок фильтровальной бумаги, где находятся антибиотически активные вещества. В этих местах остаются чистые прозрачные округлые зоны, которые с первого же взгляда указывают на расположение антибиотически активных составных частей первоначальной смеси. Измеряя диаметр прозрачной зоны, можно установить и количество соответствующей составной части путём сравнения этого диаметра с диаметром зоны стандарта, хроматографируемого одновременно с анализируемыми образцами.