Флуометрический анализ

Содержание

Введение…………………………………………………………………………..3

Глава I Теоретические основы флуориметрического анализа………………....6

    1. Понятие и сущность флуориметрии…………………………………………6
    2. Физическая сторона флуориметрического анализа………………………..9
    3. Нелинейная флуориметрия сложных органических веществ…………….11
    4. Обратные задачи флуориметрии насыщения……………………………...16
    5. Приборы для проведения флуориметрического метода в фармацевтическом анализе………………………………………………….19

Глава II Применение флуориметрического анализа к некоторым лекарственным веществам………………………………………………………20

  1. Определение содержания рибофлавина (витамина В2) методом флуориметрии………………………………………………………………..20

2.2 Флуориметрическое определение содержания родамина………………...22

2.3 Флуориметрическое определение кверцетина в лекарственных формах

       рутина………………………………………………………………………..24

2.4 Флуориметрическое определение 2-амино-4-окси-6- птеридинкарбоновой

      кислоты в лекарственных формах фолиевой кислоты……………………25

Заключение………………………………………………………………………26

Список используемой литературы……………………………………………..27

 

 

 

Введение

Вопросы стандартизации и контроля качества лекарственных средств продолжают оставаться актуальными направлениями развития фармацевтического анализа. Это обусловлено, в том числе, общим увеличением числа лекарственных средств, введением в качестве лекарственных, новых биологически активных веществ, принадлежащих к различным классам природных и синтетических соединений.

Проблема  ухудшения качества продукции отечественного фармацевтического рынка неоднократно обсуждался на заседаниях правительства  РФ и связывается специалистами  с тремя основными факторами:

  1. Нелегальный ввоз лекарственных препаратов и биологически активных добавок из-за рубежа.
  2. Несовершенство законодательной базы регулирующей оборот лекарственных средств на территории страны.
  3. Высокие технические возможности нелегального производства препаратов - фальсификатов и ограниченные аналитические возможности выявления подделки лекарственных средств. [1]

Поэтому совершенствование способов контроля качества при производстве и особенно количественное определение при  клиническом использовании может  считаться одной из наиболее важных задач современной клинической  фармации.

Разработка  методик контроля качества лекарственных  средств базируется на использовании  новейших аналитических методов, таких  как ВЭЖХ и ГЖХ, ИК и ЯМР-спектроскопия, масс-спектрометрия. Не теряют своей  значимости ТСХ, спектрофотометрия. Однако условием испытания подлинности остается идентификация ионов и функциональных групп органических веществ, входящих в структуру молекул, посредством их химического анализа. Химия развивается столь быстро, что даже при наличии экспрессных инструментальных, химические методы не только сохраняют свое значение, но и продолжают развиваться. [4]

Преимущества, которые дает флуориметрия в анализе  лекарственных средств в различных  объектах, способствовали введению этого  метода в перечень фармакопейных.

В функциональном анализе фармацевтических соединений предполагается обычно, что  молекулу органического соединения можно рассматривать как сумму  практически независимых функциональных групп и, следовательно, принимается, что физические и химические свойства соединения определяются свойствами этих функциональных групп. При проведении идентификации сложных молекул, несомненно, следует учитывать взаимное влияние функциональных групп, которое  может вызвать неожиданное изменение  свойств этих групп, а также отклонения наблюдаемых свойств от теоретически ожидаемых.

Методы  флуоресцентного анализа имеют  важное самостоятельное значение особенно в промышленности при получении  фармацевтических препаратов, так как  проведение функционального анализа - важная и часто необходимая стадия при определении качественного  состава сложных смесей. [13]

Учитывая  вышесказанное, нами показан поиск  теоретически обоснованного подхода  к разработке реакций флуоресцентного  определения. В основу подхода была положена идея получения конкретного  производного, флуоресцирующего в видимой  области спектра. Результатом исследования стали флуоресцентные реакции и  разработанные на их основе методики обнаружения и количественного  определения примесей в лекарственных  препаратах.

Чистота - одно из основных требований, предъявляемых  к лекарственным препаратам, обуславливающим  как возможность получения чистого  соединения, так и его стабильность. Это требование непрерывно растет по отношению к лекарственным препаратам. Содержание основного вещества в  настоящее время пока составляет не более 97-98%, поэтому как методы очистки, так и методы контроля очень важны при оценке качества лекарственных  средств. [36]

 

Глава I Теоретические основы флуориметрического анализа

    1. Понятие и сущность флуориметрии

Флуориметрия (ее называют также люминесцентным анализом) – это определение концентраций вещества в соответствии с интенсивностью флуоресценции, которая возникает в процессе облучения изучаемого вещества с помощью ультрафиолетовых лучей. [8, 9]

 При наличии соответствующих  условий таким методом можно  детектировать присутствие даже  ничтожных количеств. Процедуры  флуорометрии делят на макроанализ, когда исследования производятся невооруженным глазом, и на микроанализ, когда определения осуществляют посредством микроскопа и других приборов. В качестве метода диагностики и спектрального анализа в отношении сложной органики люминесцентный анализ имеет достоинства, способствующие его чрезвычайной привлекательности. [5] 

 В первую очередь потому, что многие из органических  соединений имеют способность  флуоресцировать в случаях оптического  возбуждения при квантовом выходе, который можно полагать достаточным для достоверного и уверенного решения задач диагностики. Именно поэтому флуориметрия считается одним из наиболее чувствительных методов в оптической спектроскопии. [6]

Флуориметрия - один из эмиссионных аналитических  методов и относится к фотометрическим  методам. Позволяет обнаруживать микро- и нанограммовые количества анализируемых  веществ с достаточной точностью, что используется в анализе примесей. Наличие двух характерных максимумов (в спектре возбуждения и в  спектре излучения флуоресценции) увеличивает избирательность определения. Изменение цвета и выхода флуоресценции  при смене растворителя и рН используется для идентификации и исследования структурных особенностей молекул.

     Во  флуоресцентном  анализе растворов  обычно используются следующие свойства:

     а) способность к флуоресценции  самого соединения в зависимости  от свойств растворителя ( рН, диэлектрическая  проницаемость);

     б) возникновение или  изменение флуоресцентных свойств  в присутствии катионов металлов (хелатообразование);

     в) образование флуоресцирующих  ассоциатов;

     г) возникновение или  изменении флуоресценции флуорогенного  метчика при присоединении к  нему определяемого соединения;

     д) возникновение флуоресценции  в процессе взаимодействия исследуемого соединения и реагента в результате образования нового соединения с высоко поглощающей устойчивой структурой;

     е) возникновение флуоресценции  в результате присоединения к  исследуемому соединению "флуорофора" - группировки, повышающей поглощающую и излучающую способность;

     ж) возникновение флуоресценции  в результате электронных перегруппировок  внутри молекулы без изменения  ее формулы (окислительно-восстановительные  процессы);

     з) «тушение» собственной  флуоресценции одного вещества в присутствии друг. [7, 30]

Тем не менее, флуоресцентный метод  имеет ряд недостатков, основными  из которых можно считать низкий порог концентрационного тушения  и необходимость использования  стандартных образцов при проведении анализа флуоресцирующих соединений. Эти недостатки существенно ограничивают использование флуориметрии в фармацевтической и биофармацевтической практике, не позволяя проводить флуоресцентные определения в растворах веществ, имеющих концентрацию более 15-20 мкг/мл. Необходимость разбавления анализируемых проб приводит к увеличению систематических ошибок анализа и заметно снижает экспрессность методик. [2]

Одна из главных проблем связана с растворителем пробы. Нередко случается, что некоторая методика вполне пригодна для определения данного соединения, однако проба оказывается нерастворимой в рекомендуемом растворителе. В настоящее время известно, что титрование можно проводить во многих органических растворителях. Если рекомендуемый в методе растворитель не растворяет пробу, то всегда удается подобрать другой растворитель, в котором можно провести титрование. При выборе растворителя следует учитывать реакционную способность проб. Например, ангидриды кислот или хлорангидриды реагируют со многими растворителями, однако, можно подобрать растворители, которые с ними не реагируют и в которых можно провести титрование. К таким растворителям относятся диметилформамид, ацетон и хлорбензол. Кроме того, некоторые растворители могут оказывать влияние на аналитическую реакцию. Поэтому необходимо подобрать такие растворители, в которых растворяются и проба, и реактив и возможно протекание химического процесса.

Применение неводных высококипящих растворителей позволяет ускорять особенно медленные аналитические реакции. [18, 35]

 

 

    1. Физическая сторона флуориметрического анализа

Поглощение  света, безусловно, является необходимым  условием флуоресценции, но в тех  случаях, когда поглощение раствора слишком высоко, световой поток не проходит через него и не может  служить источником возбуждения. Как  известно, при высоких концентрациях  участки раствора, расположенные  ближе к источнику возбуждения, поглощают большее количество света, чем дальше расположенные. Интенсивность  освещения раствора и, соответственно, излучение прогрессивно убывают  по мере удаления от источника (внутреннее экранирование).

Процесс флуоресценции веществ подчиняется  законам светопоглощения, как и  все оптические методы анализа: интенсивность  проходящего через раствор вещества светового потока уменьшается согласно закону Бера - Ламберта: I = I0 -kcl,

где: I - интенсивность светового потока, проходящего через раствор;

Iо- интенсивность падающего света;

К - коэффициент поглощения раствора;

С - концентрация вещества;

l - длина пути светового потока в поглощающем растворе вещества.

Интенсивность флуоресценции (испускаемой во всех направлениях) зависит от количества поглощаемого флуоресцирующим объектом света и квантового выхода флуоресценции :

F = I0 (1 – 10-D),

где: F - общая интенсивность флуоресценции;

D - оптическая плотность раствора.

При малых величинах D« 0,1 формула имеет следующий вид:

F = 10 ф(1 - (1 - D + D2/2' - D3/3' In), или F = I0*D. Таким образом, зависимость F от D (с учетом значения квантового выхода и интенсивности возбуждающего света) является линейной, что более удобно для экспериментальных исследований. Переход к линейной зависимости позволяет рассчитывать концентрацию флуорофоров по законам светопоглощения.

Однако  необходимо вычислить минимальное  значения оптической плотности раствора D0, при которых ошибка измерения интенсивности флуоресценции не превышает некоторой заданной величины.

Как правило, линейная зависимость флуоресценции  от концентрации раствора наблюдается  до тех пор, пока количество флуоресцирующего вещества не становится настолько большим, что раствор начинает поглощать  значительное количество возбуждающего  света. Боуен и Уокс показали, что  для получения линейной зависимости  раствор должен поглощать менее 5% возбуждающего света. Поэтому Dn = 2,0x0,05 = 0,1, то есть предел линейной зависимости флуоресценции от концентрации определяется достижением оптической плотности D = 0,1.

Поскольку D = KCL, то одной и той же оптической плотности могут соответствовать различные концентрации в зависимости от толщины поглощающего слоя. Следовательно, использование кювет с различной толщиной рабочего слоя позволяет применять флуориметрию для измерения высоких концентраций без предварительного разбавления проб. При практическом использовании этого приема выявлена закономерность, связывающая изменения толщины рабочего слоя кюветы и предела обнаружения методики: при уменьшении рабочего слоя в 2 раза верхний пределе линейности калибровочного графика увеличивается в среднем в 1,4 раза.

Измерения отношения интенсивности флуоресценции  вещества к интенсивности облучающего  пробу светового потока (F/I0) позволяет определять величину, подобную оптической плотности в спектрофотометрии. Эта величина зависит только от концентрации исследуемых веществ при использовании стандартных кювет, что позволяет стандартизовать измерения флуоресценции и избавится от необходимости использования стандартных растворов.

 

    1. Нелинейная флуориметрия сложных органических веществ

Сложные органические соединения играют большую роль в природе, широко используются в самых различных технологиях. Поэтому разработка методов и средств их обнаружения, измерения концентрации и определения состояния (то есть методов диагностики) была и остается актуальной научной и технической проблемой. Особый интерес представляют сложные органические соединения, которые входят в состав природных сред и живых организмов или которые попадают в эти объекты, а иногда специально вводятся в них с теми или иными целями. [21]

Очевидно, что наиболее ценными являются такие методы и средства, которые обеспечивают диагностику без разрушения объекта (то есть in vivo), непосредственно в среде обитания сложного органического соединения (то есть in situ), с высокой чувствительностью, экспрессно, а в ряде случаев (например, в системах экологического мониторинга) дистанционно.

Природа преподнесла нам подарок: многие органические соединения обладают способностью флуоресцировать при оптическом возбуждении с квантовым выходом, достаточным для решения диагностических задач. Все они обладают полосами флуоресценции, положение, форма и интенсивность которых могут быть использованы для диагностики указанных соединений. [34]

Флуориметрия как метод спектрального анализа и диагностики сложных органических соединений обладает достоинствами, делающими ее чрезвычайно привлекательной. Во-первых, полоса флуоресценции смещена (и иногда весьма значительно) в длинноволновую область спектра относительно полосы поглощения, что позволяет при регистрации флуоресценции отстраиваться от фона, создаваемого упругим рассеянием фотонов на неоднородностях среды (рассеянием Рэлея и Ми), и эффективно подавлять этот фон. Во-вторых, сечение флуоресценции для хорошо флуоресцирующих соединений настолько велико, что позволяет регистрировать флуоресценцию сред с чрезвычайно низкой концентрацией флуоресцирующих молекул. [15]

Замена обычных источников возбуждающего излучения на лазеры значительно улучшает характеристики флуоресцентного анализа в классическом варианте (в частности, еще больше поднимает чувствительность). Но главная, принципиально новая возможность, которая открывается с применением лазеров во флуориметрии, связана с насыщением флуоресценции - нелинейной зависимостью числа фотонов флуоресценции от плотности потока фотонов возбуждающего излучения. На этом основана нелинейная флуориметрия. Но прежде чем перейти к изложению физических основ этого нового метода спектроскопии, посмотрим, так ли велика необходимость в этом методе. А для этого укажем на трудности (и подчас весьма серьезные), с которыми сталкивается классическая (линейная) флуориметрия. Для разных объектов в различных задачах диагностики эти трудности проявляются по-разному. Для определенности рассмотрим, какие препятствия возникают на пути решения задач диагностики природных органических комплексов (ПОК) в водных средах. Первое препятствие - большая ширина полос флуоресценции ПОК и перекрытие полос разных ПОК, одновременно присутствующих в природных водах. Определяющий вклад в спектр флуоресценции этих сред дают четыре класса ПОК: фотосинтезирующие организмы - фитопланктон, водное гумусовое вещество, аминокислоты в свободном состоянии или в составе белковых соединений, нефти в виде пленки на поверхности, эмульсии и в растворенной форме в объеме воды. [13, 27]

Второе препятствие - идентичность или близость полос флуоресценции представителей одного класса ПОК.

Третье препятствие. Изменение состояния ПОК, как правило, практически не отражается на форме и положении полос флуоресценции, но влияет на ее интенсивность. Это затрудняет определение концентрации ПОК по интенсивности флуоресценции и не дает возможности проводить диагностику состояния ПОК (например, фотосинтетической активности водорослей). [31]

Преодолеть указанные препятствия и решить в полной мере проблему диагностики ПОК невозможно в рамках только феноменологического подхода, то есть оперируя лишь спектрами излучения и возбуждения флуоресценции, хотя, конечно, эти спектры дают большой объем информации. Необходимо выходить на молекулярный уровень и в дополнение к спектрам использовать молекулярные фотофизические параметры: сечения поглощения, флуоресценции, возбуждения флуоресцирующих молекул, константы скоростей внутримолекулярных переходов и межмолекулярного переноса энергии. При этом указанные параметры необходимо измерять in vivo и in situ, причем в условиях дефицита информации о локальных концентрациях молекул в ПОК. [14]

В настоящее время единственный способ измерения указанных параметров - нелинейная флуориметрия (флуориметрия насыщения). Важно подчеркнуть, что на этом пути решаются не только прикладные задачи диагностики ПОК, но и фундаментальные проблемы: установление механизмов

Причин для этого может буть несколько более физически понятная состоит в следующем. Если плотность потока фотонов F столь велика, что среднее время между их попаданиями в площадку, численно равную сечению поглощения молекулы oabs, меньше времени жизни молекулы в возбужденном состоянии, то молекула не успевает вернуться в основное состояние к моменту попадания в нее следующего фотона и этот фотон пролетает мимо молекулы - мы (при величине квантового выхода флуоресценции л = 1) лишаемся одного фотона флуоресценции (если слой среды оптически тонкий, то есть оabs ln0 < 1, где l - толщина слоя, n0 - концентрация молекул). Это явление обеднения основного состояния приводит к просветлению слоя среды и нелинейной зависимости Na (F) - к насыщению флуоресценции. Есть и другие механизмы насыщения флуоресценции, на Очевидно, что параметры кривой насыщения Nfl (F) определяются фотофизическими характеристиками молекулы и, следовательно, эти характеристики могут быть определены по параметрам кривой насыщения. Решение такой обратной задачи и составляет существо нелинейной флуориметрии (флуориметрии насыщения) как метода спектрального анализа любых флуоресцирующих атомов и молекул. Особенно актуален этот метод применительно к сложным органическим соединениям и комплексам. [26]

Какой бы алгоритм решения обратной задачи ни использовался, мы должны располагать теоретической (расчетной) кривой насыщения флуоресценции, которая может быть получена путем решения системы кинетических (скоростных) уравнений для населенностей энергетических состояний флуоресцирующих молекул. [28]

Узловым моментом этой процедуры является рациональный выбор физической модели, описывающей взаимодействие оптического излучения с ансамблем флуоресцирующих органических молекул или комплексов. В математической формулировке это определяет число параметров, подлежащих определению при решении обратной задачи. [17]

Для сложных органических молекул в случае, когда можно пренебречь взаимодействием между ними, приоритетными параметрами, влияющими на кривую насыщения, являются:

а) сечение поглощения оabs = о13, определяющее вероятность перехода молекулы из основного синглетного состояния S0 (c уровня 1) в первое возбужденное синглетное состояние S1 (уровень 3) под действием потока фотонов с плотностью F (см"2 с"1);

б) время жизни х3 молекулы в состоянии S1, то есть на уровне 3;

в) квантовый выход молекул в нижнее триплетное состояние T1 (на уровень 2) в результате перехода S1 - T1, называемого интеркомбинационной конверсией: лT = k32/k3, где k3 = k31 + k'31 + k32; k31 и k’31 - скорости излучательных и безызлучательных переходов из S1 в S0; k32 - скорость перехода S1 - > T1.

Параметр kj (его размерность с"1) характеризует вероятность перехода с уровня на уровень j таким образом, что если n - концентрация молекул в исходном состоянии то kipi - число молекул (в единице объема), перешедших за 1 секунду из состояния в состояние j. В рассматриваемой модели имеются три канала дезактивации уровня S1, которые характеризуются параметрами k31, k31 и k32. Поэтому полное число молекул (в единице объема), покидающих уровень S1 в 1 секунду, равно k3n3 и, следовательно, х3 = k-1 - время жизни этого уровня.

Число фотонов флуоресценции, испущенных элементом объема dV= dx*dy*dz в интервале времени от t до t + dt. [19]

 

    1. Обратные задачи флуориметрии насыщения

Зная характеристики кривой насыщения, можно в принципе определить фотофизические параметры молекулы или комплекса. Задачи такого рода называются обратными. В общем случае они являются некорректными.

Однако, используя априорную информацию о фотофизических процессах, формирующих флуоресценцию сложных органических соединений и комплексов, можно ограничить число параметров модели и пределы их изменения так, чтобы задача стала корректной по А.Н. Тихонову, то есть удовлетворяла трем условиям: решение существует, решение единственно и устойчиво. В нашей задаче устойчивость гарантирована ограниченностью числа восстанавливаемых параметров: в рассмотренных к настоящему времени обратных задачах нелинейной флуориметрии число определяемых параметров варьировали от одного до трех и в будущем оно едва ли превысит пять. [3]

Что касается единственности решения, то она доказана для трехпараметрической модели, описываемой системой кинетических уравнений с определяемыми параметрами. Таким образом, эта обратная задача является корректной по А.Н. Тихонову. Есть все основания полагать, что добавление четвертого параметра - константы скорости синглет-синглетной аннигиляции g не приведет к утрате этого свойства, хотя здесь требуется отдельное доказательство. [24]

Теоретически устойчивая обратная задача может стать неустойчивой на практике.

Причинами практической неустойчивости являются погрешности (шумы) входных данных и отклонение реальных процессов от модели, по которой рассчитывают теоретические зависимости (в нашем случае кривые насыщения). Практическая неустойчивость возникает, когда шумы входных данных или отклонение процессов от модели превышают некоторые допустимые величины. Пороги возникновения практической неустойчивости зависят как от характера фотофизических процессов в объекте, так и от свойств алгоритма решения обратной задачи. В общем случае кривые насыщения флуоресценции - исключительно неблагоприятный класс входных данных для обратных задач. Это монотонные кривые без каких-либо резких элементов, за которые можно было бы "зацепиться". Для одного типа объектов кривые насыщения по форме мало отличаются друг от друга. [11]

Это приводит к тому, что практическая неустойчивость возникает уже при весьма низком уровне погрешностей входных данных: для двухпараметрической задачи это единицы процентов, для трехпараметрической менее процента, что трудно обеспечить в эксперименте. Однако это имеет место при использовании наиболее распространенного метода решения обратных задач - метода наименьших квадратов (МНК). В его основе лежит процедура минимизации функционала невязки между экспериментальными и теоретическими данными путем вариации искомых параметров в ограниченном объеме их возможных значений. Если экспериментальная кривая неидеальна (снята с большими погрешностями или не соответствует теоретической модели), одного интегрального параметра (невязки) оказывается недостаточно, чтобы найти наилучшую аппроксимирующую кривую, рассчитанную для значений параметров модели в допустимой (из физических соображений) области их значений. [20]

Некоторое время ситуация казалась тупиковой, и метод нелинейной флуориметрии мог умереть, не успев родиться. На помощь пришла современная компьютерная техника искусственных нейронных сетей (ИНС).

Уникальным свойством нейросетей является их способность обучаться на примерах и не просто запоминать, а обобщать представленную информацию, выявлять скрытые закономерности и классифицировать предъявляемые данные. В ИНС для операции с экспериментальными данными создается сеть нейронов, каждый из которых имеет некоторое количество входов и один выход. Математически нейрон можно описать как взвешенный сумматор:

y = т (2, wixt),

где y - значение выходной величины, T - передаточная функция (обычно нелинейная), xi - значения входных величин, w: - веса связей. ИНС состоит из нескольких слоев нейронов. Входной слой имеет количество нейронов, равное количеству элементов в наборе входных данных, в нашем случае количеству точек на кривой насыщения. Выходной слой должен иметь число нейронов, совпадающее с числом определяемых параметров. На первом этапе работы сети происходит ее обучение на известных данных с целью получения наилучшей матрицы весов w. [16]

Процесс обучения часто занимает продолжительное время, зато хорошо обученная сеть быстро и с высокой точностью выдает значения искомых параметров при предъявлении ей набора экспериментальных данных.

Применительно к нашей обратной задаче принципиальное отличие техники ИНС от традиционного метода наименьших квадратов состоит в том, что ИНС узнает кривую насыщения не по одному интегральному параметру (невязке), а по большому числу признаков. Набор этих признаков формируется в процессе тренировки сети и является ее секретом. Как показали модельные расчеты (численные компьютерные эксперименты), алгоритмы решения обратных задач, основанные на технике ИНС, уже сейчас обеспечивают вполне приемлемую практическую устойчивость решения, а ведь возможности ИНС в этой области далеко не исчерпаны. [25, 32]

 

    1. Приборы для проведения флуориметрического метода в фармацевтическом анализе

Приборы, предназначенные для измерения флуоресценции, можно разделить на три категории: – флуориметры, флуоресцентные приставки к спектрофотометрам и спектрофлуориметры.

Каждый такой прибор включает в себя шесть основных узлов:

 – источник возбуждающего  света;

 – селектор частоты возбуждающего  света и частоты люминесценции;

 – кюветное отделение, предназначенное  для размещения кюветы с измеряемым образцом (стандартным образцом или пробой);

 – фотоприемник люминесценции (фотоэлемент, фотоумножитель, фотодиод);

 – усилитель сигнала;

 – миллиамперметр.

Во флуориметрах селекция частот возбуждающего света и света флуоресценции осуществляется с помощью светофильтров. Флуориметры применяют для проведения серийных анализов, где снижение селективности не является большим недостатком, а высокая чувствительность, напротив, представляет собой важное достоинство. [22]

При измерении флуоресценции с помощью флуориметров существенное значение имеет правильный выбор светофильтров, возбуждающего флуоресценцию (первичный светофильтр), и света флуоресценции (вторичный светофильтр). Первичный светофильтр должен пропускать свет в области поглощения определяемого вещества и не должен пропускать свет в области, отвечающей флуоресценции вещества. Вторичный светофильтр должен пропускать флуоресценцию, но возбуждающий свет должен им полностью поглощаться. Источниками возбуждающего света во флуориметрах обычно служат ртутные лампы низкого давления. С целью получения практически сплошного спектра излучения внутренние стенки этих ламп часто покрывают люминофором. [12, 34]