Флуоресценция

Федеральное агентство морского и речного транспорта РФ

МОРСКОЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ  УНИВЕРСИТЕТ

имени адмирала Г.И. Невельского 

Морского  физико-технического института 
 
 
 
 

Курсовая  работа по  флуоресценции   
 
 
 
 

                                                                       Выполнил: Демиденко А. А.,

    студент 20.31 группы

Руководитель: Майор А. Ю.  
 
 
 
 
 
 

Владивосток

2010

Оглавление.

0. Введение.
1. Глава 1 – основы спектроскопии.
1. Диаграмма Яблонского.
2. Характеристики испускания флуоресценции.
3. Стоксов сдвиг.
4. Независимость спектра испускания от длины волны возбуждения.
5. Правило зеркальной симметрии.
2. Глава 2 – Технические составляющие.
1. Фото - электронный умножитель.
2. Электронно - оптический преобразователь.
3. Приборы с зарядовой связью.
1. Металл - окисел - полупроводник (МОП-ёмкость).
2. Зарядовая связь.
3. Сдвиговый регистр с зарядовой связью.
4. Фоточувствительные приборы с зарядовой связью (ФПЗС).
3. Глава 3 – Флуориметры.
1. Проточный лазерный флуориметр.
2. Малогабаритный ЛИФ спектрометр.
4. Заключение.
5. Список используемой литературы.

Введение 
 
 

    Решение проблем окружающей среды и рационального  использования природных ресурсов во многом зависит от разработки и  внедрения методов дистанционного экспресс-анализа малых примесей в атмосфере и воде. В естественных водных средах такими примесями являются биологическая связь, растворенные органические и минеральные вещества, многочисленные загрязнители. Большими возможностями в анализе примесей располагает лазерная спектроскопия, использующая комбинационное рассеивание света, флуоресцентный анализ.

    В настоящее время для оперативного мониторинга водных экосистем широко применяют оптические методы  позволяющие  определять концентрацию фитопланктона и других веществ. Наибольшее распространение получили спектральные методы. Особенно актуальными такие исследования стали после выявления прямой зависимости биологической продуктивности морей и океана от содержания в воде фитопланктона.

    Определение концентрации фитопланктона по оптическим характеристикам морской среды может выполняться пассивными и активными методами. Первый широко используют с применением авиа- и спутниковых носителей. Эти методы основаны на измерении яркости отражаемой от поверхности воды солнечной энергии в широком диапазоне длин волн. Они позволяют собирать масштабные данные о поверхности водной среды, но имеют существенные ограничения: малое пространственное разрешение и невозможность измерения глубинных профилей. Использование пассивных методов ограничивается их не высокой точностью, что обусловлено сильным влиянием состояния атмосферы в месте проведения измерений.

    Активные методы основаны на облучении воды лазерным лучом и регистрации спектра флуоресценции. Различают лидарные, прокачиваемые и погружные флуориметры.   Самыми оптимальными являются проточные флуориметры, которые обладают высокой точностью и большим пространственным разрешением. 
 

     Глава: 1

    Основы  спектроскопии. 

   Люминесценция- испускание фотонов из электронно-возбужденных состояний – делится на два типа в зависимости от природы основного и возбужденного состояния. В синглетном возбужденном состоянии электрон на энергетически более высокой орбитали и второй электрон на орбитали с более низкой энергией имеют противоположную ориентацию спинов. Говорят, что эти электроны спарены. В триплетном состоянии эти электроны не спарены, т.е. их спины имеют одинаковую ориентацию. При возвращении электрона из возбужденного сингнетного состояния в основное ориентация его спина не должна меняться.  Изменение ориентации спина необходимо при переходе из триплетного состояния в синглетное основное состояние.

   Флуоресценция- это испускание, происходящее при  возвращении спаренного электрона на более низкую орбиталь. Такие переходы квантовомеханически “разрешимы”, а типичные величины скоростей испускания для них~10⁸ с^-1. Высокие значения скорости испускания приводят к временам затухания флуоресценции 10⁸ с(10 нс). Время жизни- это средний период времени, в течение которого флуорофор находится в возбужденном состоянии. Фосфоресценция- это испускание, происходящее при переходе между состояниями различной мультиплетности, как правило из возбужденного триплетного состояния в синглетное основное. Такие переходы не разрешены, и константы скорости испускания малы. Типичный диапазон времени затухания фосфоресценции — от миллисекунд до секунд, что главным образом зависит от вклада других процессов дезактивации.

   Флуоресцентные спектральные данные обычно представляют в виде спектров испускания. Спектр испускания флуоресценции - это зависимость интенсивности флуоресценции от длин волн (в нанометрах) или волновых чисел (в см^-1). Два типичных спектра испускания флуоресценции приведены. Спектры испускания сильно изменяются и зависят как от химической структуры флуорофора, так и от растворителя, в котором флуорофор рас творен. Спектры некоторых соединений, таких, как перилен, имеют четкую структуры, обусловленную отдельными колебательными уровнями энергии основного и возбужденного состояний. Другие состояния, такие, как хинин, имеют спектры без колебательной структуры. 

  1.1. Диаграмма Яблонского

     Поглощение и испускание света хорошо иллюстрирует диаграмма уровней энергии, предложенная Яблонским. Основное, первое и второе электронные состояния обозначают S₀; S₁; S₂ соответственно (рис. 1.а). Каждый из этих уровней энергии может состоять из множества колебательных энергетических уровней, обозначаемых 0, 1, 2 и т. д. Переходы между различными электронными уровнями обозначены вертикальными линиями. Такое представление используется, чтобы наглядно

    РИС.1.а Диаграмма Яблонского. 

    Рис. 1.б Диаграмма Яблонского. 

    Показать мгновенную природу поглощения света. Этот процесс происхо-дит примерно за 10^-18с, время, слишком короткое для заметного смещения ядер(принцип Франка- Кондона).

   Энергетическая щель между различными колебательными уровнями энергии видна из спектра испускания перилена. Относительное число молекул перилена, находящихся в колебательных состояниях 0 и 1, описывается распределением Больцмана.

     1.2 Характеристики испускания флуоресценции 

    Для явления флуоресценции известно несколько основных характеристик. Существуют и исключения, но они редки. Если какая-либо из нижеперечисленных характеристик отсутствует у данного флуорофора, можно сделать вывод о некоторых особых свойствах этого соединения.

    1.3. Стоксов сдвиг 

   Рис. 2. Источником ультрафиолетового возбуждения служил солнечный свет, пропущенный через пластинку из голубого стекла. Перед приемником в качестве желтого фильтра стоял стакан с вином. Флуоресценция хинина лежит в области 450 нм и поэтому хорошо заметна невооруженным глазом. В настоящее время для определения величины стоксова сдвига используют другие методы.

   Потери энергии между возбуждением и испусканием неизменно наблюдаются для флуоресцирующих молекул в растворах. Одной из основных причин возникновения стоксова сдвига является быстрая релаксация на нижний колебательный уровень состояния S₁. К тому же обычно происходит переход

    РИС. 2. Схема первой установки для обнаружения стоксова сдвига. 

на возбужденные колебательные уровни состояния S₀(см. рис. 1), что приводит к дополнительной потере колебательной энергии. Вдобавок к этому стоксов сдвиг может быть еще более увеличен благодаря влияниям растворителя на флуорофоры к реакциям в возбужденных состояниях. В газовой фазе у атомов и молекул не всегда имеется стоксов сдвиг. Испускание без сдвига наблюдают тогда, когда концентрации газа достаточно малы для того, чтобы возбужденные молекулы не претерпевали столкновений с другими молекулами до процесса испускания. Такие столкновения приводят к релаксации. В жидкой фазе процессы соударения происходят непрерывно. 

1.4. Независимость спектра испускания от длины волны возбуждения 

   Спектр испускания флуоресценции обычно не зависит от длины волны возбуждения. При возбуждении на высшие электронные и колебательные уровни избыток энергии быстро расходуется, переводя флуорофор на самый нижний колебательный уровень состояния S₁. Эта релаксации происходит за время порядка 10^-12с и является, по-видимому, результатом сильного перекрывания множества состояний с примерно равными энергиями. Благодаря такой быстрой релаксации длина волны возбуждения обычно не влияет на спектр испускания. Существуют исключения (например азулен), когда испускание может происходить как из S₂, так и из S₁- состояния. Кроме того, возбуждение на красном крае спектра поглощения часто ведет к сдвигу флуоресценции в длинноволновую область. Этот сдвиг обусловлен тем, что возбуждение на красном краю спектра избирательно возможно для тех флуорофоров, которые наиболее сильно взаимодействуют с растворителем. 

   1.5. Правило зеркальной симметрии 

     Обычно спектр испускания флуоресценции представляет собой зеркальное отражение спектра поглощения, точнее, того поглощения, которое соответствует переходу из S₀ в S₁. Это особенно наглядно в случае перилена. Симметричная природа этих спектров определяется тем, что и поглощение, и испускание обусловлены одними и теми же переходами, а также сходством колебательных энергетических уровней состоянии S₀ и S₁. Для многих молекул различное распределение электронов в состояниях S₀ и S₁, существенно не влияет на эти уровни энергии. Согласно принципу Франка - Кондона, все электронные переходы происходят без изменения межъядерного расстояния. В результате, если данная вероятность перехода (фактор Франка — Кондона) между нулевым и вторым колебательными уровнями максимальна при поглощении, соответствующий переход будет наиболее вероятен также и в испускании (рис 3). 
 
 

РИС. 3 Правило зеркальной симметрии и факторы Франка-Кондона 
 
 

Глава: 2  

Технические составляющие. 

2.1-Фото Электронный Умножитель

Фотоэлектронным умножителем называют электровакуумный прибор, преобразующей энергию оптического излучения в электрические сигналы и содержащий фотокатод , вторично-электронный умножитель и анод. От вакуумного фотоэлемента ФЭУ отличается тем, что кроме фотокатода и анода содержит ещё фокусирующую  электронно-оптическую систему, диафрагму и дополнительные электроды (диноды), являющиеся эмиттерами вторичных электронов. ( рис. 4)

При освещении  фотокатод 1 эмитирует первичные  фотоэлектроны, которые ускоряются электрическим полем и фокусируются электронно-оптической системой 2 на первый динод Э₁, вызывая его увеличенную вторичную электронную эмиссию. Вторичные электроны, вылетевшие из первого динода, ускоряются электрическим полем и направляются на второй динод Э₂ , увеличенный поток электронов со второго динода направляется на третий и т.д.

Электрическое поле, ускоряющее электроны, создаётся  делителем постоянного напряжения, обеспечивающим больший положительный потенциал каждого последующего каскада относительно предыдущего  R1 – R11 .

Пространство  образуемое поверхностями фотокатода 1 и первого динода Э₁ с расположенными между ними электродами, котодной (входной) камерой ФЭУ  Форма и распределение электрического потенциала на поверхности фотокатода фокусирующего электрода 2 и диафрагмы 3 должны обеспечить максимальный сбор фотоэлектронов на первый динод за счёт использования законов движения электронов электрическом поле. Качество электронно-оптической системы катодной камеры определяется коэффициентом сбора электронов Y_k (отношением числа фотоэлектронов, достигших первого динода, к общему числу эмитированных фотокатодом электронов n_k ) . Коэффициент сбора электронов у современных ФЭУ близок к единице.

   Первичные  фотоэлектроны, попадая на первый  динод, взаимодействуют с электронами  его вещества  и возбуждают  их до более высоких энергетических состояний. Часть электронов перемещается к границе динода с вакуумом. Электроды, которые достигают поверхности с энергией, превышающей поверхностный потенциальный барьер, переходя в вакуум и ускоряются электрическим полем в направлении ко второму диноду.

Рис.4 Устройство ФЭУ со схемой его питания 
 
 

2.2-Электронно Оптический Преобразователь 
 

Рис 5

1-входное  окно 

2-Защитная плёнка

3- Микроканальная пластина (МКП)

4-Фосфорный экран

5-выходное  окно

Принцип действия хорошо иллюстрирует рис. 5. Попадая в канал, электрон испытывает соударения со стенкой и выбивает вторичные электроны. В тянущем электрическом поле этот процесс многократно повторяется, позволяя получить коэффициент усиления Nх10⁴ раз. Для получения каналов МКП используется разнородное по химическому составу оптическое волокно. После получения шайбы сердцевины волокон растворяются в химических реактивах.

Рис 6. Конструкция МКП 
 
 
 
 
 

2.3 Приборы с Зарядовой Связью 

2.3.1 – металл - окисел - полупроводник (МОП-ёмкость). 

При всём многообразии ПЗС основой большинства из них является МОП-ёмкость. На рисунке 7 изображена МОП-ёмкость, сформированная на полупроводнике p-типа.

Состоит МОП-ёмкость  из электрода, который может быть изготовлен их металла или сильнолегированного поликремния, диэлектрика и полуроводниковой подложки. Если подложкой служит монокристалличесуий кремний, диэлектриком в большинстве случаев является термически выращенный диоксид кремния SiO₂ . Толщина слоя оксида кремния мала, всего 0,05 … 0,1 мкм, так как при большей толщине диэлектрика проникновение внешнего поля в подложку ослабляется и управление свойствами МОП-ёмкости становится по меньшей мере затруднительным. 

Рис. 7 МОП-ёмкость:

1-полупроводник

2- стоп-канальная  область

3-оксид

4-электрод

5-обеднеинная  область 
 
 
 

2.3.2 Зарядовая связь. 

Изолированную МОП-ёмкость можно, прикладывая смещение соответствующей величины и полярности, привести в нестационарное состояние глубокого обеднения, т.е. создать потенциальную яму  и осуществить процесс накопления и хранения зарядового пакета. Для передачи зарядового пакета из одной потенциальной ямы в другую необходимо сблизить МОП-ёмкости настолько, чтобы их электрические поля влияли друг на друга. В этом случае можно говорить о зарядовой связи между МОП-ёмкостями. Для накопления заряда и формирования зарядового пакета на МОП-ёмкость достаточно подать постоянное обедняющее смещение. Перенос зарядов из одной ёмкости в другую, связанной с нею зарядовой связью требует переключения электродов. На рисунке 8а. показаны две МОП-ёмкости. На электроды подаётся импульсное смещение, характеризуемое периодом Т и двумя уровнями: высоким (или верхнем) уровнем и низким (или нижнем) уровнем (рис 8б).

Пусть в некоторый  начальный момент на левый электрод подан импульс с высоким уровнем (10-20 В ), на правый с низким (0-10 В). Под  левым электродом образовалась глубокая потенциальная яма, дно которой ниже дна правой ямы на ∆f, пропорциональную разности смещений высокого и низкого уровней (рис 8в). Следовательно , в левую яму можно поместить зарядовый пакет. В момент t₁ производится тактирование : левый электрод переключается на низкий уровень смещения, правый на высокий. На рисунке 8г, приведена гипотетическая картина этого момента , когда справа глубокая пустая яма, а носители заряда из поднявшейся левой ямы ещё не начали двигаться. Вслед за этим начинается перенос, который проходит три последовательные стадии  (Рис 8 д, е, ж), связанные с различными механизмами. В конце концов, зарядовый пакет оказывается под правым электродом.

Различают три  физических механизма, определяющих перенос  зарядов: самоиндуцированный дрейф, дрейф под действием краевого поля и тепловую диффузию носителей заряда. В начальной фазе переноса, когда зарядовый пакет велик (сравним с ёмкостью ямы), перенос происходит просто из – за электростатического расталкивания носителей – инверсионных электронов. Как только часть носителей уходит в соседнюю яму появляется градиент плотности заряда (Рис 8 д ) возникает пропорциональное этому градиенту поле, которое вызывает ток носителей или самоиндуцированный дрейф (величина заряда в «отдающей» левой яме уменьшается по гиперболическому закону). По мере уменьшения зарядового пакета силы расталкивания ослабевают и самоиндуцированный дрейф замедляется. Его сменяет дрейф под действием краевого поля, не зависящей от градиента плотности заряда и наличия самого заряда. Краевое поле обусловлено разностью потенциалов под соседними электродами и зависит амплитуды тактовых импульсов, толщины слоя диэлектрика, уровня легирования и длины электродов.

2.3.3 Сдвиговый регистр с зарядовой связью. 

Зная, как происходит накопление заряда в МОП-ёмкости  и перенос зарядового пакета между двумя МОП-ёмкостями, связанными зарядовой связью, нетрудно перейти к сдвиговому ПЗС – регистру. На рисунке 9 изображена структура сдвигового регистра, каждый элемент которого образован тремя электродами. В свою очередь, одноимённые электроды всех элементов электрически соединены шинами, образуя фазовые электродные системы (упрощённо фазы). В данном примере фаз три и сдвиговый регистр называют трёх – фазным.

Пусть в такой  трех – фазной системе высокий  уровень смещения подан на вторую фазу, на первой и третьей фазах низкий уровень (Рис 9а). Когда под электродами второй фазы накопятся зарядовые пакеты, высокий уровень на ней переключают на низкий. Одновременно высокий уровень смещения подаётся на одну из соседних фаз, например на третью расположенную справа. Налево они двигаться не будут, так как на электродах первой фазы смещение оставлено на низком уровне (рис 9б) . На рис. 9в видно, что перенос зарядовых пакетов вправо произойдёт одновременно во всех элементах сдвигового регистра. Далее высокий уровень смещения с третьей фазы переключается на первую фазу, и все заряды одновременно перенесутся ещё на один шаг (рис 9г) ,затем с первой фазы на вторую и т.д. Последовательная смена смещений на фазах, т.е. тактовая диаграмма сдвигового регистра, приведена на рис. 9д. 

2.3.4 Фоточувствительные приборы с зарядовой связью (ФПЗС). 

В фоточувствительных приборах с зарядовой связью неосновные носители в области обеднения создаются при освещении вследствие фотогенерации электронно-дырочных пар. Функционально фоточувствительный прибор с зарядовой связью – это прибор, воспринимающий изображение, осуществляющий его разложение на элементарные фрагменты, поэлементное электронное считывание (сканирование) и формирование на выходе видеосигнала, адекватного изображению. Пространственное распределение интенсивности излучения преобразуется в рельеф электрических зарядов, локализованных в приповерхностной области. Время хранения зарядовых пакетов составляет 1-100 мс, соответствуя длительности одного кадра. Затем зарядовые пакеты перемещаются от элемента к элементу, выводятся наружу и дают последовательность видеоимпульсов, соответствующую распределению излучения, то есть осуществляется стандартный ТВ алгоритм восприятия образа. Для приема цветного изображения используется система фильтров.

Фоточувствительные  приборы с зарядовой связью имеют  некоторые особенности устройства. Функции фоточувствительных приборов с зарядовой связью обычно пространственно разделены: секции накопления, хранения, выходной регистр. Единичный кадр возбуждается в секции накопления (за 1/25 с - ТВ–стандарт), затем быстро (0,1-100 мкс) параллельно двигается в секцию хранения, из которой в течение времени накопления следующего кадра последовательно построчно переносится в выходной регистр.

Существует два  основных способа считывания из секции накопления. Строчно-кадровый – зарядовый пакет пробегает всю строку, адресный (координатный) – пакет от каждого элемента матрицы накопления передается в соседний с ним элемент матрицы хранения, обе матрицы вставлены одна в другую (фото - чувствительный приборы с зарядовой инжекцией) . В матричных фоточувствительных приборах с зарядовой связью весь кадр образуется одновременно, в однострочных - последовательно за счет дополнительной механической развертки на второй координате. 
 

Глава 3 Флуориметры 

3.1 - Проточный лазерный флуориметр. 

Рис. 10 . Схема проточного лазерного флуориметра, установленного на борту судна. 

Флуоресценция морской воды возбуждается в оптической кювете второй гармоникой як лазера 532 нм. Пучок излучения расширяется коллиматором до размеров кюветы. Отраженный от оптики пучок излучения попадает на фото – диод стробирующий запуск модуля АЦП и через фильтр СЗС -21 (сине – зелёное стекло) и световод попадает на фотокатод ФЭУ 2. Излучение флуоресценции из кюветы через объектив и фильтр ОС – 12 (ораньжевое стекло) попадает на входную щель монохроматора и на фотокатод ФЭУ 1. Управление монохроматором осуществляется программно компьютером через модуль управления шаговым двигателем (МУШД).

       Регистрация излучения за один  лазерный импульс производится  ФЭУ 1 на каждый отдельной длине  волны с шагом  2 - 4 нм. Спектр  получается при сканировании  монохроматора в заданном диапазоне  частот. Для учёта нестабильности излучения лазера используется второй канал на ФЭУ 2 . Для учёта фонового сигнала между излучениями лазера проводилось измерение сигнала фона.Это необходимо так как сканирование спектра занимает несколько минут (2-3 минуты и более).  
 

3.2 - Малогабаритный ЛИФ спектрометр. 

    Рис.11 Схема малогабаритного ЛИФ спектрометра:

1 –лазер 532 нм; 2 – блок питания и охлаждения  лазера; 3 – оптическая кювета; 4 – оптический фильтр ; 5 – полихроматор ; 6 – оптический фильтр ; 7 – блок питания ЭОП; 8 – ЭОП Г; 9 – объектив; 10 – ПЗС-камера; 11 – ЭВМ с платой управления ПЗС-камерой 

    Флуоресценция морской воды, возбужденная в оптической кювете, через фильтр проходит во входную  щель полихроматора. Полихроматор раскладывает это излучение в спектр и строит изображение этого спектра на оптоволоконном входе усилителя яркости. Усиленное изображение спектра с выходного экрана усилителя яркости переносится объективом на ПЗС - матрицу приемной камеры, где он запоминается в фотоячейках в виде заряда фотоэлектронов. Затем АЦП камеры заряд ячеек преобразует в цифровой формат, и полученные данные через интерфейсную плату передаются в ЭВМ. 

3.3 Малогабаритный двухчастотный лазерный флуориметр. 

    Рис. 10 Флуориметр

    Флуоресценция морской воды, возбужденная в оптических кюветах, через фильтры по световоду проходит во входную щель полихроматора. На щели полихроматора сигналы от кювет разделяются по вертикали. Полихроматор раскладывает это излучение в спектр и строит изображение этого спектра на входе усилителя яркости. Усиленное изображение спектра с выходного экрана усилителя яркости переносится объективом на ПЗС - матрицу приемной камеры, где оно запоминается в фотоячейках в виде заряда фотоэлектронов. Затем АЦП камеры заряд ячеек преобразует в цифровой формат, и полученные данные через USB канал передаются в ЭВМ. 
 
 

    Заключение.

    Двухчастотный лазерный флуориметр обладает заметными  преимуществами в сравнении с вышерассмотренными примерами флуориметров. Его устройство незначительно сложнее одночастотного лазерного малогабаритного флуориметра. Добавлена ещё одна кювета и оптика заведения излучения. Третья гармоника получается из первой и второй гармоник лазера и требует не большой доработки последнего. При этом флуориметр сохраняет свою малогоборитность и надёжность (нет движующихся частей) , обладает достаточной чувствительностью и кроме того он позволяет проводить измерения флуоресценции веществ одновременно двумя разными длинами волн – в зелёной (видимой) и ультрафиолетовой области. Что позволяет проводить более глубокие исследования сложных органических объектов, например таких как морские фитопланктонные сообщества и условия их обитания в том числе загрязнения. 
 
 
 

    Список  используемой литературы

1. Панков, Андреев. Источники и приемники излучения 1991г\480 с.
2. М.К. Самохвалов - элементы и устройства оптоэлектроники 2003г\125 с.
3. Дж. Лакович – основы флуоресцентной спектроскопии – Мир, 1986. – 496 с.
4. Ф.П.Пресс – фоточувствительные приборы с зарядовой связью М:Радио и связь, 1991. – 296 с.
5. А.Ю. Майор – диссертация на тему «лазерные измерительные системы для мониторинга фитопланктонных сообществ и процессов влияющих на их состояние" глава 2