Методы анализа глюкозы в субстанции

СОДЕРЖАНИЕ

Введение………………………………………………………….…………..3

Глава 1. Методы анализа глюкозы  в субстанции ……………..…………..4

1.1Описание лекарственного средства……………………………………..4

1.2Глюкоза………………………...…………………………………………5

1.2.1Физические свойства глюкозы…………………..……………………5

1.2.2  Получение субстанции глюкозы…………………………………….6

1.2.3Определение подлинности……………………………………...……..6

1.2.4Количественное определение……………………………..…….……9

1.2.5Хранение и применение………………………………………..…….10

1.3. Валидацияаналитичой методики………………………………….….11

Глава 2 Валидационная оценка методик анализа глюкозы………….….13

2.1. Установление параметров линейной зависимости ……………...….13

2. 2 Анализ параметра правильность………………………………..……15

2.3 Анализ параметра прецизионность…………………………….……..19

Заключение……………………………………………………………...….21

Список литературы…………………………………………………......….22

 

ВВЕДЕНИЕ

Всем специалистам необходимо расширять и углублять свои знания. Выполнение студентами научно-исследовательских  работ позволит им профессионально  овладеть практическими навыками и  умениями.

Выполнение работ на кафедре  фармацевтической химии предусматривает  более детальное и целенаправленное изучение методов качественного  и количественного анализов ингредиентов лекарственных средств (ЛС) индивидуального  изготовления и объективную их оценку с помощью валидационных характеристик. Применительно к анализу ЛС, изготовляемых  в аптеках, преимущества имеют физико-химические методы анализа, в частности фотоколориметрический.

Любая аналитическая методика должна быть утверждена в установленном  порядке, что подтверждает ее метрологическая  аттестация. Для этой цели в фармацевтической практике используют метод валидации, то есть документальное доказательство того, что методика пригодна для  выполнения поставленных задач.

Количественный химический анализ пробы вещества или ингредиента  лекарственного средства – это экспериментальное  определение содержания (массовой доли, концентрации и т.д.) одного или ряда компонентов физическими или  химическими методами. Количественный химический анализ проводят согласно методикам анализа, утвержденным в  установленном порядке, посредством  прямых и косвенных измерений  с использованием объемных методов  анализа или физико-химических приборов.

Целью курсовой работы является изучение валидационной оценки методов идентификации, объемного метода анализа лекарственных веществ, входящих в состав раствора глюкозы 5%, изготовляемого по заводской технологии.

 

 

Глава 1. Методы анализа глюкозы в субстанции

1. ОПИСАНИЕ ЛЕКАРСТВЕННОГО СРЕДСТВА

Раствор глюкозы 5% для инъекций.

Фармакологическое действие

Плазмозамещающее, гидратирующее, метаболическое, дезинтоксикационное. Субстратно обеспечивает энергетический обмен. Поддерживает объем циркулирующей  плазмы. Изотонический раствор восполняет объем потерянной жидкости, повышенная осмотическая активность гипертонических  растворов увеличивает выход  тканевой жидкости в сосудистое русло  и удерживает ее в нем, повышает диурез и выведение токсических веществ. Молекулы декстрозы утилизируются  в процессе энергетического обеспечения.

Показания к применению

Гипогликемия, гипогликемическая  кома, гиповолемия, дегидратация, шок, коллапс, интоксикация (в хирургической, травматологической, реанимационной практике); приготовление растворов лекарств.

Противопоказания

Сахарный диабет, различные  состояния, сопровождающиеся гипергликемией.

Побочное действие

Лихорадка, воспаление тканей в месте введения, тромбоз и/или  тромбофлебит - чаще всего связаны  с нарушениями асептики во время  приготовления раствора или техники  инъецирования, гиперволемия, острая левожелудочковая недостаточность.

 

 

 

 

 

 

 

1.2 ГЛЮКОЗА

К числу углеводов относят  сахара и подобные им по химической структуре и свойствам соединения. Большинство углеводов представляют собой полиоксикарбонильные соединения, т.е. полиоксиальдегиды или полиоксикетоны. 

В медицинской и фармацевтической практике наиболее широко используют глюкозу, сахар молочный,  сахарозу, галактозу.

Glucose — глюкоза

альфа-D-глюкопираноза

1.2.1ФИЗИЧЕСКИЕ  СВОЙСТВА ГЛЮКОЗЫ

Белый мелкокристаллический порошок без запаха, сладкого вкуса. Удельное вращение от +52 до +53 (10%-ный  водный раствор). Легко растворим  в воде, очень мало или трудно растворимы в этаноле, практически  нерастворимы в эфире и хлороформе.

Структура глюкозы обусловливает  особенности физических и химических свойств ее растворов. От наличия  нескольких асимметрических углеродных атомов в молекулах моносахаридов  и дисахаридов зависят оптические свойства растворов. Эти свойства являются характерными константами для углеводов.

При окислении D-глюкозы образуется D-глюконовая кислота, а при восстановлении — сорбит.

Восстановительные свойства глюкозы связаны с наличием в  молекуле полуацетального гидроксила. При нагревании растворов дисахаридов  в присутствии кислот происходит их гидролиз до моносахаридов. Сахароза гидролизуется с образованием глюкозы  и фруктозы, а сахар молочный —  до глюкозы и галактозы.  

 

 

1.2.2ПОЛУЧЕНИЕ СУБСТАНЦИИ ГЛЮКОЗЫ

Углеводы содержатся в  растительном и животном сырье. Глюкоза  находится в виноградном соке, в плодах и других органах различных  растений. Основным источником получения  глюкозы в промышленности является крахмал, который гидролизуют в  присутствии минеральных кислот:

(C₆H₁₀O₅)_n + nH₂O →nC₆H₁₂O₆

 крахмал   глюкоза

 

Глюкозу можно получить гидролизом сахарозы с участием спиртового раствора хлороводорода:

 

 

Глюкоза выкристаллизовывается, а фруктоза остается в растворе.

 

1.2.3. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПОДЛИННОСТИ

Для качественного и количественного  анализа используют главным образом  восстановительные свойства углеводов  и физические свойства их растворов.

Подлинность глюкозы устанавливают, нагревая до кипения ее растворы с  реактивом Фелинга. При этом глюкоза  образует кирпично-красный осадок оксида меди (I). При действии на глюкозу  аммиачным раствором нитрата  серебра выделяется черный осадок серебра.

Растворы глюкозы образуют с фенилгидразином выпадающие в  осадок фенилгидразоны. При последующем  нагревании на водяной бане получаются окрашенные в желтый цвет озазоны. Озазоны  имеют характерную температуру  плавления. Глюкоза взаимодействует  с тремя молекулами фенилгидразина:

 

 

Под воздействием минеральных  кислот или щавелевой кислоты  моно- и дисахариды превращаются при  нагревании в пробирке на пламени  горелки в фурфурол или его  производные (дисахариды вначале гидролизуются  в моносахариды). Из глюкозы образуется оксиметилфурфурол, а из фруктозы —  фурфурол:

 

 

 

 

Фурфурол или оксиметилфурфурол, являясь летучими соединениями, взаимодействуют  с анилином или прокаином, нанесенным на фильтровальную бумагу, которой  накрывают пробирку. Вначале образуются основания Шиффа, имеющие светло-желтую окраску, а затем фурановый цикл раскрывается и получается полиметиновый  краситель — производное оксиглютаконового  альдегида (малиново-фиолетовое окрашивание):

Глюкоза образует со спиртовым  раствором α-нафтола и концентрированной серной кислотой соединения хиноидной структуры, окрашенные в красно-фиолетовый цвет. В основе реакции также лежит процесс образования фурфурола или оксиметилфурфурола, которые конденсируются с α-нафтолом в триарилметановое хиноидное соединение.

К этой же группе следует  отнести цветные реакции, которые  дают моно- и дисахариды с другими  фенолами При смешении кристаллов глюкозы  и тимола после добавления концентрированной  серной кислоты появляется темно-красное  окрашивание.

Окрашенные продукты конденсации  получаются при взаимодействии моносахаридов (или гидролизованных дисахаридов) с раствором антрона в концентрированной  серной кислоте: 

Появляется зеленое окрашивание, постепенно переходящее в сине-зеленое.

Глюкоза дает цветную реакцию  с 0,5%-ным раствором хлорида трифенилтетразолия в присутствии раствора гидроксида натрия при нагревании. Выпадает красный  осадок трифенилформазана:

 

 

При добавлении раствора сульфата меди и подщелачивании глюкоза образует комплексное соединение фиолетово-синего цвета. Этой реакцией одновременно доказывается наличие как гидроксильных, так  и альдегидной групп, восстанавливающих  медь (II) до оксида меди (I) при стоянии. Присутствие гидроксильных групп можно также доказать реакцией ацетилирования (происходит образование пентаацетатов со стабильной температурой плавления).

Показателем качества углеводов  является удельное вращение растворов, характеризующее их оптическую активность. Для установления удельного вращения глюкозу предварительно сушат при 100–105 ̊C до постоянной массы.

Измерение угла вращения глюкозы  производят с помощью поляриметра  после предварительного прибавления  к испытуемому раствору двух капель раствора аммиака. При этом ускоряется процесс мутаротации. Он связан с установлением равновесия в образовании двух эпимеров: 64% β-D(+)-глюкозы и 36% β-D(+)-глюкозы. Это создает усредненное значение удельного вращения раствора глюкозы, равное +52,5% (ФС допускает 51,5–53,0).

В условиях термической стерилизации растворов глюкозы для инъекций, вне зависимости от присутствия  стабилизатора, происходит образование  продуктов деструкции: дезоксигексазонов, органических кислот, формальдегида, 5-оксиметилфурфурола. В ФС включены способы определения  этих веществ, основанные на использовании  фотометрических методов.

 

1.2.4. КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ

Количественное определение  глюкозы, галактозы, лактозы и сахарозы можно выполнить различными методами.

Содержание глюкозы определяют иодометрическим методом, основанном на окислении альдегидной группы щелочными растворами иода до образования  натриевой соли глюконовой кислоты:

 

+ I₂ + 3NaOH ¾>CH₂OH(CHOH)₄COONa + 2NaI + 2H₂O

 

Один из титриметрических методов анализа моносахаридов  и дисахаридов основан на использовании  реактива Фелинга (2-3 кратный избыток). Его добавляют к навеске точно  отмеренное количество, а затем иодометрически устанавливают остаток неизрасходованного на окисление катиона меди (II).

Методика основана на восстановлении углеводами меди (II) до меди (I) из тартратного комплекса:

 

 

Избыток реактива Фелинга, содержащего  ионы меди (II), восстанавливают иодидом в кислой среде и выделившийся иод титруют тиосульфатом натрия:

 

2Cu²⁺ + 5I^–¾® 2CuI¯ + I₃^–

 

Поляриметрический метод  определения сахаров основан  на измерении угла вращения поляризованного  света. Угол вращения  (в градусах), измеряемый на поляриметре, и удельное вращение связаны между собой уравнением: . Зная удельное вращение, длину трубки l и измерив угол вращения, можно вычислить массовую долю с (%) по формуле:

ГЖХ-метод определения  глюкозы используют после превращения  её в летучие соединения (ацетаты  сорбита или нитрил глюконовой кислоты).

1.2.5. ХРАНЕНИЕ И ПРИМЕНЕНИЕ

Хранят лекарственные  препараты глюкозы в хорошо укупоренной  таре при комнатной температуре. Глюкоза в водных растворах при  хранении окисляется. Следует также  учитывать гигроскопичность сахаров.

Применяют глюкозу при  различных заболеваниях сердца, печени, шоке, коллапсе в качестве источника  легко усвояемого организмом питания, улучшающего функции различных  органов. Основные пути метаболизма  D-глюкозы — гликолиз и аэробное окисление до углекислоты, воды и АТФ. Назначают глюкозу внутрь (по 0,5–1,0 г), внутривенно до 20–50 мл 40%-ного раствора

1.3.Валидация аналитичой методики

Валидацияаналитичой методики – экспериментальное доказательство того, что методика пригодна для  решения предполагаемых задач

Валидация проводится для  следующих испытаний:

-на подлинность 

-количественное испытание  для определения примесей

-испытание для количественного  определения действующего вещества  в образцах активной субстанции  или готового лекарственного  препарата, а так же для количественного  определения других компонентов  лекарственных препаратов( консервантов)

Испытание на идентификацию - предназначена для подтверждения  подлинности анализа веществ  в образце. Обычно это достигается  путем сравнения каких либо свойств (спектральных характеристик, реакционная  способность испытаний и стандартных  образцов)

Испытание предназначенное  для контроля примесей- могут быть как количественными так и  предельными. Назначение- характеристика чистоты образца. Для валидации  количественного и предельного  испытания необходимы различные  валидационные характеристики.

Количественное определение  предназначено для определения  количественного определения в  образце.

Валидационные характеристики:

- Правильность

-Прецизионность

-Специфичность

-Предел обнаружения

-Предел количественного  определения

-Линейность

-Диапазон применения

-Робастность

 

Таблица №1 – Валидационные  характеристики основных типов методик

Наименование      характеристики	Типы методик
	Испыта- ние на подлин-ность	Посторонние               примеси		Количественное              определение
		Количест-венные методики	Преде- лысодер-жания	Основного действующ-его  вещества, нормируемых компонентов	Действую-щего веще-ства в  тесте «Растворе-ние»
Специфичность**	Да	Да	Да	Да	Да
Линейность	Нет	Да	Нет	Да	Да
Аналитическая    область	Нет	Да	*	Да	Да
Точность	Нет	Да	*	Да	Да
Прецизионность: -повторяемость (сходимость) -внутрилаборатор- наявоспроиз-водимость	Нет        Нет	Да         Да¹	Нет         Нет	Да            Да¹	Да         Нет
Предел обнару-жения (чувстви-тельность)	Нет	Нет²	Да	Да	Да
Предел количест-венногоопреде-ления	Нет	Да	Нет	Нет	Нет
Робастность (устойчивость)	Нет	*	*	*	*

*может определяться при  необходимости;

** отсутствие специфичности  одной аналитической методики  может быть компенсировано использованием  другой аналитической методики;

¹ необходимо только для  новых методик, не имеющих аналогов

² необходимо в тех случаях, когда предел обнаружения близок к пределу количественного определения 

 

 

 

 

 

 

Глава 2 Валидационная оценка методик анализа глюкозы

 

 

2.1. УСТАНОВЛЕНИЕ ПАРАМЕТРОВ ЛИНЕЙНОЙ ЗАВИСИМОСТИ

 

Линейность - это наличие прямой пропорциональной зависимости аналитического сигнала от концентрации или количества определяемого вещества в анализируемой пробе.

    Линейность выражается  уравнением  y = ax + b. Это уравнение называют линейной регрессией. Параметр bградуировочной функции характеризует отрезок, отсекаемый на оси ординат и соответствующий значению холостого опыта, а коэффициента характеризует наклон градуировочной кривой и является отражением чувствительности методики.

Расчет коэффициентов  градуировочного графика проводят по формулам и данным таблицы

 

 

В химических методах анализа (титриметрия) аналитик не может повлиять на имени коэффициентов а и b.Однако если при проведении контрольного опыта титрант не расходуется, то градуировочный график принимает форму прямой, выходящей из начала координат, и имеющей тангенс угла наклона равный 1.

Значения параметров а и bвычисляются методом регрессионного анализа. В настоящее время пользуются соответствующими компьютерными программами (например.Excel). Для аналитических целей можно использовать только ту методику, для которой зависимость функции от аргумента коррелируется с коэффициентом r, который должен быть >0,99.

Расчет коэффициента корреляции r

 

 Для количественного  определения следует использовать  методики с коэффициентом корреляции не ниже 0,99, пересечение с осью Y - не более 2% от величины коэффициента а.

 

Методика анализа:

Точную навеску глюкозы (0,500 г) поместили в мерную колбу  вместимостью 100 мл, растворили и довели водой очищенной до метки, перемешали (раствор А).

В колбы для титрования последовательно внесли 5,0 мл; 10,0 мл; 15,0 мл; 20,0 мл; 25,0 мл полученного раствора А, прибавили в каждую по 15 мл 0,05 М  раствора йода, 3 мл 10% раствора гидроксида натрия, закрыли склянку пробкой  и реакционную смесь оставили стоять в темном месте 5 минут. Далее  прибавили 6 мл кислоты хлористоводородной разведенной и титровали 0,1 М раствором  натрия тиосульфата до обесцвечивания раствора (индикатор - крахмал).

Параллельно проводили контрольный  опыт.

Данные занесли в таблицу.

Таблица 2. Результаты титрования.

Навеска 0,5% раствора глюкозы (мл)	5,0	10,0	15,0	20,0	25,0
V(I2) – V (Na2S2O3), мл
Концентрация раствораглюкозы, г	0,025	0,05	0,075	0,10	0,125

V_k=16,7мл

Vk – V, мл

15,3

15,6

15,9

16,2

16,4

Градуировочный график

Коэффициент корреляции равен  0,997459

Заключение: Рассчитано уравнение  градуировочного графика. Показана линейность методики.

2. 2 АНАЛИЗ ПАРАМЕТРА  ПРАВИЛЬНОСТЬ

 

Правильностью аналитической методики называется степень близости экспериментальных результатов к истинному значению во всей области измерений. Главным фактором, определяющим правильность, является значение систематической погрешности.

 

Для оценки правильности методик  количественного определения активной субстанции применимы следующие  подходы:

1. применение аналитической методики к образцу с известной степенью чистоты, например к стандартному образцу;
2. сравнение результатов анализа, полученных с использованием валидируемой методики и арбитражного метода, правильность и прецизионность которого известны;
3. заключение о правильности можно сделать после того, как установлены прецизионность, линейность и специфичность.

Для оценки правильности методик  количественного определения готового лекарственного препарата:

1. применение методики к искусственным (модельным) смесям, к которым были добавлены известные количества анализируемого вещества;
2. если невозможно получить образцы всех компонентов лекарственного препарата, возможно применение метода добавок или арбитражной методики, правильность которой доказана
3. заключение о правильности можно сделать после того, как установлены прецизионность, линейность и специфичность.

Далее приведен первый способ определения правильности с использованием модельной смеси.

Для тестирования методики на правильность готовятся модельные  смеси с точным содержанием каждого  из компонентов, включая и вспомогательные  вещества. Согласно рекомендациям ICH необходимо проанализировать не менее 9 образцов на 3 уровнях концентраций. Правильность методики устанавливается в указанном диапазоне ее применения. Для оценки полученных результатов наиболее простым и наглядным критерием служит открываемость (R), которая вычисляется по формуле:

 

При проведении анализа будут  получены 9 значений открываемости.

Для более детальной оценки следует статистически обработать полученные значения R, рассчитав стандартное и относительное стандартное отклонение. Это наиболее простой способ.

Для того чтобы сделать  вывод о полученных результатах, следует иметь ввиду, что для  анализа субстанций с содержанием  действующего вещества не менее 98%, значения правильности должны быть в пределах 99-101%. При анализе субстанций с нормой содержания действующего вещества менее 98%, в пределах 98- 102%. Для лекарственных препаратов с различным содержанием определяемого компонента рекомендуются следующие интервалы правильности

 

Приготовили три модельных  раствора глюкозы А₁, А₂, А₃ по прописям, приведенным в таблице 2.

 

Таблица 2. Приготовление  модельных растворов глюкозы.

 

Модельная смесь	1 (А1)	2 (А2)	3 (А3)
Навеска глюкозы (г)	0,4	0,5	0,6
Воды очищенной	до 10 мл	до 10 мл	до 10 мл

 

Раствор А₁. Точную навеску глюкозы (0,400 г) помещали в мерный цилиндр, растворяли в воде и доводили водой до метки (10 мл).

Раствор А₂. Точную навеску глюкозы (0,500 г) помещали в мерный цилиндр, растворяли в воде и доводили водой до метки (10 мл).

Раствор А₃. Точную навеску глюкозы (0,600 г) помещали в мерный цилиндр, растворяли в воде и доводили водой до метки (10 мл).

Растворы  Б₁, Б₂, Б₃. В три колбы для титрования переносили по 1,0 мл модельной смеси А₁, прибавляли 10 мл воды, 10 мл 0,05 М раствора йода, 2 мл 10% раствора гидроксида натрия, закрывали колбу пробкой и реакционную смесь оставляли стоять в темном месте 5 минут. Далее прибавляли 5 мл кислоты хлористоводородной разведенной и титровали 0,1 М раствором натрия тиосульфата до обесцвечивания раствора (индикатор - крахмал) (V₂).

Растворы  Б₄, Б₅, Б₆. В три колбы для титрования переносили по 1,0 мл модельной смеси А₂, прибавляли 10 мл воды, 10 мл 0,05 М раствора йода, 2 мл 10% раствора гидроксида натрия, закрывали колбу пробкой и реакционную смесь оставляли стоять в темном месте 5 минут. Далее прибавляли 5 мл кислоты хлористоводородной разведенной и титровали 0,1 М раствором натрия тиосульфата до обесцвечивания раствора (индикатор - крахмал) (V₂).

Растворы  Б₇, Б₈, Б₉. В три колбы для титрования переносили по 1,0 мл модельной смеси А₃, прибавляли 10 мл воды, 10 мл 0,05 М раствора йода, 2 мл 10% раствора гидроксида натрия, закрывали колбу пробкой и реакционную смесь оставляли стоять в темном месте 5 минут. Далее прибавляли 5 мл кислоты хлористоводородной разведенной и титровали 0,1 М раствором натрия тиосульфата до обесцвечивания раствора (индикатор - крахмал) (V₂).

Параллельно проводили контрольный  опыт.

1 мл 0,05 М раствора  йода соответствует 9,9 мг водной  глюкозы (или 0,0099 г).

Расчет содержания глюкозы  в процентах (открываемость) проводили  по формуле:

   (1) ,

где: V_к – объем 0,1 М раствора натрия тиосульфата, пошедший на контрольный опыт, мл;

V₂ – объем 0,1 М раствора натрия тиосульфата, пошедший на титрование испытуемого раствора, мл;

T – титр глюкозы;

        а  – навеска, взятая для титрования, мл;

C (A₁, A₂, A₃) – содержание глюкозы в модельных смесях А₁, А₂, А₃ соответственно (0,04 г; 0,05 г; 0,06 г).

Результаты заносили в  таблицу №3 и рассчитывали стандартное  отклонение (SD) и относительное стандартное отклонение (RSD) по формулам:

 

 

R₁ = 100.98

R₂ = 98.46

R₃ = 103.50

R₄ = 100.26

R₅    = 100.98

R₆    = 98.96

R₇  = 97.61

R₈ = 97.01

R₉    = 100.98

 

Таблица 3 – Результаты определения  правильности титриметрическим методом.

 

Взято модельной смеси, мл	Взято лекарственного вещества, г	Объем титранта, мл	R,%	Метрологические характеристики
1,0	0,4	10,0	100,98
1,0	0,4	10,1	98,46
1,0	0,4	9,9	103,50	R=99,86
1,0	0,5	8,9	100,26	SD=2,0102
1,0	0,5	9,0	100,98	RSD=2,0%
1,0	0,5	9,1	98,96
1,0	0,6	8,1	97,01
1,0	0,6	8,2	97,61
1,0	0,6	8,0	100,98