Полимеразные Цепные Реакции

Министерство образования  Республики Беларусь

 

БЕЛОРУССКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ  УНИВЕРСИТЕТ

 

ХИМИЧЕСКИЙ  ФАКУЛЬТЕТ 

 

 

 

 

Курсовая  работа

 

 

На тему: «Полимеразные Цепные Реакции»

 

 

 

 

 

Курсовая  работа студентки 2-ого курса

Плисковской П.О.

 

 

                                                                                 Научный руководитель:

Ассистент кафедры  аналитической химии

                                                             Петров А.Ю.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

МИНСК

2012

 

 

Содержание

  1. Введение………………………………………….………………......................1
  2. Глава I. Полимеразная цепная реакция(ПЦР)………………………..……………..2

1.1 Из истории ПЦР……………………………………...…………………….2

1.2 Суть метода ПЦР. ДНК-полимерза…………………………………….….4

1.3 Проведение ПЦР………………………………………………………..5

1.4 Эффект «плато»……………………………………………………………9

  1. Глава II. Стадии постановки ПЦР……..………………………………………………9

2.1 Подготовка пробы биологического материала…9

2.2 Амплификация…………………………………………………………10

  1. Глава III . Методы, основанные на полимеразной цепной реакции………….10

3.1 Качественный анализ…10

3.2 Способ постановки ПЦР с использованием “горячего старта"…10

3.3 Детекция молекул РНК…11

  1. Глава IV.Основные разновидности и области применения ПЦР …12

4.1 Разновидности ПЦР…12

4.2 Применение полимеразной цепной реакции. …

  1. Заключение …
  2. Литература …

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Введение

Человечество  вошло в третье тысячелетие с  большим запасом знаний в области  наук о жизни и колоссальным потенциалом  их практического использования. Современный  человек может произвольно и  направленно изменять наследственность окружающего его живого мира - бактерий, растений, животных и человека. Появились  беспрецедентные возможности технологического прогресса (биотехнология и биоинженерия), открывшего также новые пути в  медицине (генная терапия) и сельском хозяйстве (трансгенные, или генетически  модифицированные, растения и животные). Все это возникло на базе революционных  прорывов в фундаментальной науке (молекулярная биология), которые затем  и породили биотехнологическую революцию.

Эпохальным  открытием молекулярной биологии нашего века стал предложенный в 1983 г. американским исследователем Кэрри Б. Маллисом, удостоенным за это изобретение Нобелевской премии в 1993 г., альтернативный метод анализа геномной ДНК - метод полимеразной цепной реакции (ПЦР). ПЦР дает возможность в течение дня из одной молекулы ДНК получить 100 млрд. сходных по структуре молекул и однозначно «увидеть» нужные участки, а затем проверить генетический материал, экстрагированный из исследуемого клинического образца, на наличие в его составе участка чужеродной или измененной генетической информации. «Эта реакция проста в исполнении: нужны лишь пробирка, несколько простых реагентов и источник тепла. Препарат ДНК, который необходимо копировать может быть чистым, а может представлять собой сложную смесь различных биологических веществ. В качестве источника ДНК подходит и человеческий волос, и биоптат ткани, и капля засохшей крови, обнаруженная на месте преступления, и мозг мумии, и даже тело мамонта, пролежавшего 40 000 лет в вечной мерзлоте. За годы, прошедшие со времени открытия полимеразной цепной реакции, она нашла применение во всех отраслях биологии: опубликовано более 1000 работ, в которых была использована эта реакция. Идея ее так проста, что, учитывая значение ПЦР для развития биологических исследований, многим теперь кажется невероятным, что никто не додумался до нее раньше, хотя уже много назад все необходимые для проведения этой реакции компоненты были доступны.»

В данной работе я рассматриваю механизм полимеразной цепной реакции (механизм амплификации ДНК в искусственных условиях), физические явления, лежащие в основе ПЦР – анализа (эффект Пельтье), а  также важнейшие области применения полимеразной цепной реакции. 

 

 

 

 

 

Полимеразная цепная реакция (ПЦР)

 

1.1. История открытия ПЦР

 

В начале 1970-х годов норвежскому  ученому Хьеллю Клеппе (Kjell Kleppe) из лаборатории  нобелевского лауреата Хара Гобинды  Хораны (Har Gobind Khorana) пришла в голову мысль, что можно амплифицировать  ДНК с помощью пары коротких одноцепочечных молекул ДНК — синтетических  праймеров. Однако в то время эта  идея осталась невостребованной. Полимеразная цепная реакция была вновь открыта  в 1983 году Кэри Маллисом (Kary Mullis). Его  целью было создание метода, который  бы позволил амплифицировать ДНК  в ходе многократных последовательных удвоений исходной молекулы ДНК с  помощью фермента ДНК-полимеразы. Через 7 лет после опубликования этой идеи, в 1993 г., Маллис получил за неё Нобелевскую премию.

                    Рисунок 1. Строение ДНК

В начале использования метода после  каждого цикла нагревания — охлаждения приходилось добавлять в реакционную  смесь ДНК-полимеразу, так как  она быстро инактивировалась при  высокой температуре, необходимой  для разделения цепей спирали  ДНК. Процедура была очень неэффективной, требовала много времени и  фермента. В 1986 г. она была существенно улучшена. Было предложено использовать ДНК-полимеразы из термофильных бактерий. Эти ферменты оказались термостабильными и были способны выдерживать множество циклов реакции. Их использование позволило упростить и автоматизировать проведение ПЦР. Одна из первых термостабильных ДНК-полимераз была выделена из бактерий Thermus aquaticus и названа Taq-полимеразой. Недостаток этой полимеразы заключается в том, что вероятность внесения ошибочного нуклеотида у неё достаточно высока, так как у этого фермента отсутствуют механизмы исправления ошибок (3'→5' экзонуклеазная активность). Полимеразы Pfu и Pwo, выделенные из архей, обладают таким механизмом что, их использование значительно уменьшает число мутаций в ДНК, но скорость их работы (процессивность) ниже, чем у Taq. Сейчас применяют смеси Taq и Pfu, чтобы добиться одновременно высокой скорости полимеризации и высокой точности копирования.

 

 

 

1.2. Суть метода ПЦР. ДНК-полимераза.

Полимеразная цепная реакция –  экспериментальный метод молекулярной биологии, позволяющий добиться значительного  увеличения малых концентраций определенных фрагментов нуклеиновой кислоты  в биологическом материале. Такой  процесс увеличения числа копий  ДНК называется амплификацией. Копирование ДНК при ПЦР осуществляется специальным ферментом – полимеразой. ДНК-полимераза( Рис. 3) – фермент, участвующий в репликации (амплификации ДНК в живых организмах) ДНК. Ферменты этого класса катализируют полимеризацию дезоксирибонуклеотидов вдоль цепочки нуклеотидов ДНК, которую фермент «читает» и использует в качестве шаблона. Тип нового нуклеотида определяется по принципу комплементарности с шаблоном, с которого ведется считывание.

Рисунок 3. ДНК-полимераза.

ДНК-полимераза добавляет свободные нуклеотиды к 3'-концу собираемой цепочки. Это  приводит к удлинению цепочки в направлении 5'-3'. Ни одна из известных ДНК-полимераз не способна создать цепочку «с нуля»: они в состоянии лишь добавлять нуклеотиды к уже существующей 3'-гидроксильной группе. По этой причине ДНК-полимераза нуждается в праймере – короткой последовательности нуклеотидов (чаще 20-25), комплементарной концевым участкам изучаемого гена – к которому она могла бы добавить первый нуклеотид. Праймеры состоят всегда из оснований ДНК и РНК, при этом первые два основания всегда РНК-основания. Праймеры синтезируются другим ферментом – праймазой. Еще один фермент – геликаза – необходим для раскручивания двойной спирали ДНК с формированием одноцепочечной структуры, которая обеспечивает репликацию обеих цепочек в соответствии с полуконсервативной моделью репликации ДНК.

Некоторые ДНК-полимеразы обладают также способностью исправлять ошибки во вновь собираемой цепочке ДНК. Если происходит обнаружение  неправильной пары нуклеотидов, ДНК-полимераза откатывается на один шаг назад, исключает  из неправильный нуклеотид из цепочки, затем вставляет на его место  правильный, после чего репликация продолжается в обычном режиме.

 

 

1.3. Проведение ПЦР.

Полимеразная  цепная реакция (ПЦР) - метод амплификации ДНК, с помощью которого в течение  нескольких часов можно выделить и размножить определённую последовательность ДНК в миллиарды раз. Возможность  получения огромного количества копий одного строго определённого  участка генома значительно упрощает исследование имеющегося образца ДНК.

Для проведения полимеразной цепной реакции необходимо соблюдение ряда условий. Для проведения ПЦР в простейшем случае требуются следующие компоненты:

    • ДНК-матрица, содержащая тот участок ДНК, который требуется амплифицировать.
    • Два праймера, комплементарные концам требуемого фрагмента. ( Пара искусственно синтезированных олигонуклеотидов, имеющих, как правило, размер от 15 до 30 п. н., идентичные соответствующим участкам ДНК-мишени. Они играют ключевую роль в образовании продуктов реакции амплификации. Правильно подобранные праймеры обеспечивают специфичность и чувствительность тест-системы.)
    • Термостабильная ДНК-полимераза. Полимераза, используемая в ПЦР, должна сохранять активность при высокой температуре длительное время, поэтому используют ферменты, выделенные из термофилов -  Thermus aquaticus (Taq-полимераза) и другие.
    • Дезоксинуклеотидтрифосфаты (dATP, dGTP, dCTP, dTTP).
    • Ионы Mg2+, необходимые для работы полимеразы.
    • Буферный раствор, обеспечивающий необходимые условия реакции – pH, ионную силу раствора. Содержит соли, сывороточный альбумин.

Чтобы избежать испарения реакционной смеси, в  пробирку добавляют высококипящее  масло, например, вазелиновое. Если же используется прибор с  подогревающейся  крышкой, этого делать не требуется.

Добавление  пирофосфатазы может увеличить  выход ПЦР-реакции. Этот фермент  катализирует гидролиз пирофосфата, побочного  продукта присоединения нуклеотидтрифосфатов к растущей цепи ДНК, до ортофосфата. Пирофосфат может  ингибировать ПЦР-реакцию.

Для многократного  увеличения количества копий исходной ДНК нужна цикличность реакции. Как правило, каждый из последовательно повторяющихся циклов ПЦР состоит из трех этапов :

1 . Денатурация, или «плавление» ДНК. Двухцепочечную ДНК-матрицу нагревают до 94 – 96ºС (или до 98ºС, если используется особенно термостабильная полимераза) на 0,5 – 2 минуты, чтобы цепи ДНК разошлись. Эта стадия называется денатурацией, так как разрушаются водородные связи между двумя цепями ДНК. Иногда перед первым циклом (до добавления полимеразы) проводят предварительный прогрев реакционной смеси в течение 2 – 5 минут для полной денатурации матрицы и праймеров. Такой прием называется горячим стартом, он позволяет снизить количество неспецифичных продуктов реакции.

2. Отжиг – связывание праймеров с матричной ДНК. Когда цепи разошлись, температуру медленно понижают, чтобы парймеры могли связаться с одноцепочечной матрицей. Температура отжига зависит от состава праймеров и обычно выбирается 50-65ºС. Время стадии – 20 – 60 секунд. Неправильный выбор температуры отжига приводит либо к плохому связыванию праймеров с матрицей (при завышенной температуре), либо к связыванию в неверном месте и появлению неспецифичных продуктов (при заниженной температуре).

3. Синтез (элонгация цепи).  ДНК-полимераза реплицирует матричную цепь, используя праймер в качестве «затравки». Полимераза начинает синтез второй цепи от 3'-конца праймера, который связался с матрицей и движется вдоль матрицы. Температура элонгации зависит от полимеразы. Часто используемые полимеразы Taq и Pfu наиболее активны при 72ºС. Время синтеза зависит от типа ДНК-полимеразы и от длины амплифицируемого фрагмента. Обычно время элонгации принимают равным одной минуте на каждую тысячу пар оснований. После окончания всех циклов часто проводят дополнительную стадию финальной элонгации, чтобы достроить все одноцепочечные фрагменты. Эта стадия длится 7 – 10 минут.

В дальнейшем этапы денатурации, отжига и элонгации  многократно повторяются (30 и более  раз). На каждом цикле количество синтезированных  копий фрагмента ДНК удваивается. 

Рисунок 4. Схематическое изображение первого цикла ПЦР. (1) Денатурация при 94—96 °C. (2) Отжиг при 68 °C (например). (3) Элонгация при 72 °C (P=полимераза). (4) Закончен первый цикл. Две получившиеся ДНК-цепи служат матрицей для следующего цикла, поэтому количество матричной ДНК в ходе каждого цикла удваивается.

Все реакции  проводят в пробирках, погруженных  в термостат. Смена температурного режима и его поддержание осуществляется автоматически.

Чтобы понять, как именно происходит амплификация определенного сегмента ДНК в  ходе ПЦР, нужно четко представить  положение всех праймеров и комплементарных им последовательностей в амплифицируемых цепях в каждом раунде. В первом раунде каждая из новосинтезированных цепей имеет гораздо большую длину, чем расстояние от 3’ –гидроксильной группы ее праймера до концевого нуклеотида последовательности, комплементарной второму праймеру. Такие цепи называют «длинными матрицами», именно на них будет идти дальнейший синтез.

Во втором раунде двухцепочечную ДНК, состоящую  из сходной и новосинтезированной (длинная матрица) цепей, опять подвергают денатурации, а затем отжигают с  праймерами. Во время синтеза в  этом раунде вновь синтезируются  «длинные матрицы», а также некоторое  количество цепей с праймером  на одном конце и с последовательностью, комплементарной второму праймеру, на другом («короткие матрицы»). Во время  третьего раунда все гетеродуплексы, образовавшиеся ранее, одновременно подвергаются денатурации и отжигу с праймерами, а затем реплицируются.  В последующих  раундах «коротких матриц» становится все больше, и к 30-му раунду их число  уже в 106  раз превышает число исходных цепей или «длинных матриц».

Количество  специфического продукта реакции (ограниченного  праймерами) теоретически возрастает пропорционально 2n, где n – число циклов реакции. На самом деле эффективность каждого цикла может быть меньше 100%, поэтому в действительности:

P ~ (1+E)n ,

 

где Р –  количество продукта, Е – средняя  эффективность цикла.

Число «длинных»  копий ДНК тоже растет, но линейно, поэтому в продуктах реакции  доминирует специфический фрагмент. Рост требуемого продукта в геометрической прогрессии ограничен количеством  реагентов, присутствием ингибиторов, образованием побочных продуктов.

ПЦР –  высокочувствительный метод, поэтому  при наличии в исследуемом  образце даже ничтожного количества ДНК, случайно попавшей из одной реакционной смеси в другую, могут быть получены ложноположительные результаты. Это заставляет тщательно контролировать все используемые для ПЦР растворы и посуду. 

Основные  принципы подбора праймеров.

При создании ПЦР-тест-системы одной из основных задач является правильный подбор праймеров, которые должны отвечать ряду критериев:

1. Праймеры  должны быть специфичны. Особое  внимание уделяют 3'-концам праймеров,  т.к именно с них начинает  достраивать комплементарную цепь  ДНК Taq-полимераза. Если их специфичность  недостаточна, то, вероятно, что в  пробирке с реакционной смесью  будут происходить нежелательные  процессы, а именно, синтез неспецифической  ДНК (коротких или длинных фрагментов). Она видна на электрофорезе  в виде тяжелых или легких  дополнительных полос. Это мешает  оценке результатов реакции, т.к  легко перепутать специфический  продукт амплификации с синтезированной  посторонней ДНК. Часть праймеров  и дНТФ расходуется на синтез  неспецифической ДНК, что приводит  к значительной потере чувствительности.

2. Праймеры  не должны образовывать димеры  и петли, т.е. не должно образовываться  устойчивых двойных цепей в  результате отжига праймеров  самих на себя или друг с  другом.

 

1.4 Эффект "плато"

Следует заметить, что процесс накопления специфических продуктов амплификации по геометрической прогрессии идет лишь ограниченное время, а затем его  эффективность критически падает. Это  связано с так называемым эффектом "плато".

Термин  эффект “плато” используют для  описания процесса накопления продуктов  ПЦР на последних циклах амплификации.

В зависимости  от условий и количества циклов реакции  амплификации, на момент достижения эффекта  “плато” влияют утилизация субстратов (дНТФ и праймеров), стабильность реактантов (дНТФ и фермента), количество ингибиторов, включая пирофосфаты и ДНК-дуплексы, конкуренция за реактанты неспецифическими продуктами или праймер-димерами, концентрация специфического продукта и неполная денатурация при высокой концентрации продуктов амплификации.

Чем меньше начальная концентрация ДНК-мишени, тем выше риск выхода реакции на “плато". Этот момент может наступить  до того, как количество специфических  продуктов амплификации будет достаточно, чтобы их можно было проанализировать. Избежать этого позволяют лишь хорошо оптимизированные тест-системы.

 

 

 

 

 

Cтадии постановки ПЦР

 

2.1 Подготовка пробы биологического материала

Для выделения  ДНК используют различные методики в зависимости от поставленных задач. Их суть заключается в экстракции (извлечении) ДНК из биопрепарата и  удалении или нейтрализации посторонних  примесей для получения препарата  ДНК с чистотой, пригодной для  постановки ПЦР.

Стандартной и ставшей уже классической считается  методика получения чистого препарата  ДНК, описанная Мармуром. Она включает в себя ферментативный протеолиз  с последующей депротеинизацией и переосаждением ДНК спиртом. Этот метод позволяет получить чистый препарат ДНК. Однако он довольно трудоемок  и предполагает работу с такими агрессивными и имеющими резкий запах веществами, как фенол и хлороформ.

Одним из популярных в настоящее время  является метод выделения ДНК. Этот метод основан на использовании  для лизиса клеток сильного хаотропного  агента - гуанидина тиоционата (GuSCN), и последующей сорбции ДНК  на носителе (стеклянные бусы, диатомовая земля, стеклянное "молоко" и. т.д.). После отмывок в пробе остается ДНК, сорбированная на носителе, с  которого она легко снимается  с помощью элюирующего буфера. Метод удобен, технологичен и пригоден для подготовки образца к амплификации. Однако возможны потери ДНК вследствие необратимой сорбции на носителе, а также в процессе многочисленных отмывок. Особенно большое значение это имеет при работе с небольшими количествами ДНК в образце. Кроме  того, даже следовые количества GuSCN могут  ингибировать ПЦР. Поэтому при использовании  этого метода очень важен правильный выбор сорбента и тщательное соблюдение технологических нюансов.

Другая  группа методов пробоподготовки  основана на использовании ионообменников типа Chilex, которые, в отличие от стекла, сорбируют не ДНК, а наоборот, примеси, мешающие реакции. Как правило, эта  технология включает две стадии: кипячение  образца и сорбция примесей на ионообменнике. Метод чрезвычайно  привлекателен простотой исполнения. В большинстве случаев он пригоден для работы с клиническим материалом. К сожалению, иногда встречаются  образцы с такими примесями, которые  невозможно удалить с помощью  ионообменников. Кроме того, некоторые  микроорганизмы не поддаются разрушению простым кипячением. В этих случаях  необходимо введение дополнительных стадий обработки образца.

Таким образом, к выбору метода пробоподготовки  следует относиться с пониманием целей проведения предполагаемых анализов.

 

2.2 Амплификация

Для проведения реакции амплификации необходимо приготовить  реакционную смесь и внести в  нее анализируемый образец ДНК. При этом важно учитывать некоторые особенности отжига праймеров. Дело в том, что, как правило, в анализируемом биологическом образце присутствуют разнообразные молекулы ДНК, к которым используемые в реакции праймеры имеют частичную, а в некоторых случаях значительную, гомологию. Кроме того, праймеры могут отжигаться друг с другом, образуя праймер-димеры. И то, и другое приводит к значительному расходу праймеров на синтез побочных (неспецифических) продуктов реакции и, как следствие, значительно уменьшает чувствительность системы. Это затрудняет или делает невозможным чтение результатов реакции при проведении электрофореза.

 

Методы, основанные на полимеразной цепной реакции

 

3.1 Способ постановки ПЦР с использованием “горячего старта"

Чтобы уменьшить  риск образования неспецифических  продуктов реакции амплификации, используют подход, получивший название “горячий старт" (“Hot-start”). Суть его  состоит в предотвращении возможности  начала реакции до момента достижения в пробирке условий, обеспечивающих специфический отжиг праймеров.

Дело  в том, что в зависимости от ГЦ-состава и размера, праймеры имеют  определенную температуру плавления (Tm). Если температура системы превышает  Тm, праймер не в состоянии удерживаться на цепи ДНК и денатурирует. При  соблюдении оптимальных условий, т.е. температуры отжига, близкой к  температуре плавления, праймер  образует двухцепочечную молекулу только при условии его полной комплементарности  и, таким образом, обеспечивает специфичность  реакции.

Существуют  различные варианты реализации "горячего старта":

Внесение  в реакционную смесь Taq-полимеразы во время первого цикла после  прогрева пробирки до температуры денатурации.

Разделение  ингредиентов реакционной смеси  парафиновой прослойкой на слои (в  нижней части - праймеры, в верхней - Taq-полимераза и ДНК-мишени), которые  смешиваются при расплавлении парафина (~65-750С).

Использование моноклональных антител к Taq-полимеразе. Фермент, связанный моноклональными  антителами, становится активным лишь после стадии первой денатурации, когда  моноклональные антитела необратимо денатурируют и освобождают активные центры Taq-полимеразы.

Во всех перечисленных случаях, даже если неспецифический  отжиг произошел до начала температурного циклирования, элонгации не происходит, а при нагревании комплексы праймер-ДНК  денатурируют, поэтому неспецифические  продукты не образуются. В дальнейшем температура в пробирке не опускается ниже температуры плавления, что  обеспечивает образование специфического продукта амплификации.

3.2 Детекция молекул РНК

Возможность использования РНК в качестве мишени для ПЦР существенно расширяет  спектр применения этого метода. Например, геномы многих вирусов (гепатит С, вирус  инфлюэнцы, пикорнавирусы и т.д.) представлены именно РНК. При этом в  их жизненных циклах отсутствует  промежуточная фаза превращения  в ДНК. Для детекции РНК необходимо в первую очередь перевести ее в форму ДНК. Для этого используют обратную транскриптазу, которую выделяют из двух различных вирусов: avian myeloblastosis virus и Moloney murine leukemia virus. Использование  этих ферментов связано с некоторыми трудностями. Прежде всего, они термолабильны  и поэтому могут быть использованы при температуре не выше 42° С. Так как при такой температуре  молекулы РНК легко образуют вторичные  структуры, то эффективность реакции  заметно снижается и по разным оценкам приблизительно равна 5%. Предпринимаются  попытки обойти этот недостаток используя  в качестве обратной транскриптазы  термостабильную полимеразу, полученную из термофильного микроорганизма Thermus Thermophilus, проявляющего транскриптазную активность в присутствии Mn2+. Это единственный известный фермент, способный проявлять как полимеразную так и транскриптазную активность.

Для проведения реакции обратной транскрипции в  реакционной смеси также как  и в ПЦР должны присутствовать праймеры в качестве затравки и смесь 4-х дНТФ, как строительный материал.

После проведения реакции обратной транскрипции полученные молекулы ДНК могут служить мишенью для проведения ПЦР

 

 

 

Основные  разновидности и области применения

 

4.1 Разновидности ПЦР

  1. «Вложенная» ПЦР (Nested PCR(англ.)) — применяется для уменьшения числа побочных продуктов реакции. Используют две пары праймеров и проводят две последовательные реакции. Вторая пара праймеров амплифицирует участок ДНК внутри продукта первой реакции.
  2. «Инвертированная» ПЦР (Inverse PCR(англ.)) — используется в том случае, если известен лишь небольшой участок внутри нужной последовательности. Этот метод особенно полезен, когда нужно определить соседние последовательности после вставки ДНК в геном. Для осуществления инвертированной ПЦР проводят ряд разрезаний ДНК рестриктазами с последующим соединением фрагментов (лигирование). В результате известные фрагменты оказываются на обоих концах неизвестного участка, после чего можно проводить ПЦР как обычно.
  3. ПЦР с обратной транскрипцией (Reverse Transcription PCR, RT-PCR(англ.)) — используется для амплификации, выделения или идентификации известной последовательности из библиотеки РНК. Перед обычной ПЦР проводят на матрице мРНК синтез одноцепочечной молекулы ДНК с помощью ревертазы и получают одноцепочечную кДНК, которая используется в качестве матрицы для ПЦР. Этим методом часто определяют, где и когда экспрессируются данные гены.
  4. Ассиметричная ПЦР (англ. Asymmetric PCR) — проводится тогда, когда нужно амплифицировать преимущественно одну из цепей исходной ДНК. Используется в некоторых методиках секвенирования и гибридизационного анализа. ПЦР проводится как обычно, за исключением того, что один из праймеров берется в большом избытке.
  5. Количественная ПЦР (Quantitative PCR, Q-PCR(англ.)) — используется для быстрого измерения количества определенной ДНК, кДНК или РНК в пробе.
  6. Количественная ПЦР в реальном времени (Quantitative real-time PCR) — в этом методе используют флуоресцентно меченые реагенты для точного измерения количества продукта реакции по мере его накопления.
  7. Touchdown (Stepdown) ПЦР (Touchdown PCR(англ.)) — с помощью этого метода уменьшают влияние неспецифического связывания праймеров на образование продукта. Первые циклы проводят при температуре выше температуры отжига, затем каждые несколько циклов температуру снижают. При определённой температуре система пройдёт через полосу оптимальной специфичности праймеров к ДНК.
  8. Метод молекулярных колоний (ПЦР в геле, англ. Polony - PCR Colony) — акриламидный гель полимеризуют со всеми компонентами ПЦР на поверхности и проводят ПЦР. В точках, содержащих анализируемую ДНК, происходит амплификация с образованием молекулярных колоний.
  9. ПЦР с быстрой амплификацией концов кДНК (англ. Rapid amplification of cDNA ends, RACE-PCR)
  10. ПЦР длинных фрагментов (англ. Long-range PCR) — модификация ПЦР для амплификации протяженных участков ДНК (10 тысяч оснований и больше). Используют две полимеразы, одна из которых — Taq-полимераза с высокой процессивностью (то есть, способная за один проход синтезировать длинную цепь ДНК), а вторая — ДНК полимераза с 3'-5' эндонуклеазной активностью. Вторая полимераза необходима для того, чтобы корректировать ошибки, внесенные первой.
  11. RAPD PCR (англ. Random Amplification of Polymorphic DNA PCR), ПЦР со случайной амплификацией полиморфной ДНК — используется тогда, когда нужно различить близкие по генетической последовательности организмы, например, разные сорта культурных растений, породы собак или близкородственные микроорганизмы. В этом методе обычно используют один праймер небольшого размера (20 — 25 п.н.). Этот праймер будет частично комплементарен случайным участкам ДНК исследуемых организмов. Подбирая условия (длину праймера, его состав, температуру и пр.), удается добиться удовлетворительного отличия картины ПЦР для двух организмов.

 

 

4.2 Применение полимеразной цепной реакции.

Использование метода ПЦР для диагностики инфекционных заболеваний как бактериальной, так и вирусной природы имеет  колоссальное значение для решения  многих проблем микробиологии и  эпидемиологии. Применение этого метода также способствует развитию фундаментальных исследований в области изучения хронических и малоизученных инфекционных заболеваний.

ПЦР-метод  позволил разработать новые диагностические  тесты на генетические и инфекционные заболевания. В частности, его используют для ранней диагностики наличия  в организме вируса иммунодефицита человека (ВИЧ), что не удается осуществить  другими методами. При этом не требуется  работать с радиоактивными изотопами, так как амплифицированный сегмент  вирусной ДНК выявляется напрямую после электрофоретического разделения ДНК и окраски их бромистым этидием.

Наиболее  рационально и эффективно применение ПЦР для обнаружения микроорганизмов  трудно культивируемых в лабораторных условиях, атипичных форм бактерий. К ним также относятся внутриклеточные  паразиты и микроорганизмы, способные  длительно персистировать в организме  хозяина. Высокоспецифичная, чувствительная и быстрая диагностика многих тяжелых заболеваний способствует не только их эффективному лечению, но и предотвращению распространения  инфекции.

Наиболее эффективно и экономически обоснованно использование метода в урогинекологической практике - для выявления хламидиоза, уреаплазмоза, гонореи, герпеса, гарднереллеза, микоплазменной инфекции; в пульмонологии - для дифференциальной диагностики вирусных и бактериальных  пневмоний, туберкулеза; в гастроэнтерологии - для выявления геликобактериоза ; в клинике инфекционных заболеваний - в качестве экспресс-метода диагностики  сальмонеллеза, дифтерии, вирусных гепатитов  В,С и G; в гематологии диагностируются цитомегаловирусная инфекция, вирус Эппштейн-Барра.

Особое практическое значение имеет  определение устойчивости микрофлоры к антибиотикам: тетрациклину и эритромицину с помощью ПЦР-диагностики, что обоснованно применять тогда, когда другие методы недостаточно эффективны или приемлемы .

В криминалистике ПЦР используют для сравнения  так называемых «генетических отпечатков пальцев». Необходим образец генетического  материала с места преступления — кровь, слюна, сперма, волосы и  т. п. Его сравнивают с генетическим материалом подозреваемого. Достаточно совсем малого количества ДНК, теоретически — одной копии. ДНК расщепляют на фрагменты, затем амплифицируют  с помощью ПЦР. Фрагменты разделяют  с помощью гель-электрофореза. Полученную картину расположения полос ДНК и называют генетическим отпечатком пальцев (англ. genetic fingerprint).

Полимеразные Цепные Реакции