Получение аминокислот
СОДЕРЖАНИЕ
- ВВЕДЕНИЕ……..………………………………………………
…………..3 - ПОНЯТИЕ ОБ АМИНОКИСЛОТАХ …………………………………....5
- Определение и характеристика аминокислот..……………………….5
- Классификация аминокислот………………………………………….7
2.3 Свойства аминокислот……………………………………………….
- МЕТОДЫ ПОЛУЧЕНИЯ АМИНОКИСЛОТ…....……………….……...12
3.1 Микробиологический синтез..………………………………………..12
3.2 Химический синтез……………………………………………..……..
3.3 Получение гидролизом белковосодержащего сырья……………......20
3.4 Ферментативный метод выделения ………………………………….22
3.5 Ферментативное разделение оптических изомеров………………....23
- ИСПОЛЬЗОВАНИЕ В ПРОМЫШЛЕННОСТИ………………………...24
- ЗАКЛЮЧЕНИЕ……….…………………………………………
……...…28 - СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ ИСТОЧНИКОВ…...…………………….29
ВВЕДЕНИЕ
Любой живой
организм состоит из белков. Разнообразные формы белков принимают
участие во всех процессах, происходящих
в живых организмах. В теле человека из
белков формируются мышцы, связки, сухожилия,
все органы и железы, волосы, ногти; белки
входят в состав жидкостей и костей. Ферменты
и гормоны, катализирующие и регулирующие
все процессы в организме, также являются
белками.
Дефицит белков в организме может привести
к нарушению водного баланса, что вызывает
отеки. Каждый белок в организме уникален
и существует для специальных целей. Белки
не являются взаимозаменяемыми. Они синтезируются
в организме из аминокислот, которые образуются
в результате расщепления белков, находящихся
в пищевых продуктах. Таким образом, именно
аминокислоты, а не сами белки являются
наиболее ценными элементами питания.
[1]
Разработка оптимальных технологических схем получения незаменимых аминокислот, которые не могут синтезироваться в организме человека, может успешно решить проблему повышения полноценности белкового питания человека. Еще в конце XIX века было установлено, что аминокислоты представляют собой основные структурные элементы белка, являются составной части всех живых организмов.
Для лучшего усвоения белка пищи содержание незаменимых аминокислот в ней должно быть сбалансированным. Использование отдельных аминокислот и их комплексов для обогащения продуктов питания и пищевых рационов позволит повысить общий и белковый уровень полноценного питания населения. Несмотря на то, что в настоящее время в отечественной и зарубежной промышленности выпускается много десятков аминокислотных препаратов, существенным становится вопрос о повышении их биологической эффективности за счет увеличения содержания и улучшения сбалансированности аминокислот; для этого существует много способов выделения аминокислот, которые рассматриваются в данной работе. [2]
2. ПОНЯТИЕ ОБ АМИНОКИСЛОТАХ
2.1. ОПРЕДЕЛЕНИЕ И ХАРАКТЕРИСТИКА
Аминокислоты – класс органических соединений, содержащих карбоксильные (-COOH) и аминогруппы (-NH2). Они являются основным «строительным материалом» для синтеза специфических тканевых белков, ферментов, пептидных гормонов и других физиологически активных соединений. Помимо того, что аминокислоты образуют белки, некоторые из них:
- Выполняют задачу нейромедиаторов или являются их предшественниками. Нейромедиаторы – это химические вещества, передающие нервный импульс с одной нервной клетки на другую. Таким образом, некоторые аминокислоты необходимы для нормальной работы головного мозга.
- Способствуют тому, что витамины, алколоиды, пигменты, антибиотики, токсины и минералы адекватно выполняют свои функции.
- Некоторые непосредственно снабжают энергией мышечную ткань.
- Участвуют в обмене белков и углеводов, в образовании важных для организмов соединений (например, пуриновых и пиримидиновых оснований, являющихся неотъемлемой частью нуклеиновых кислот). [3]
Кроме аминокислот, входящих в состав белков, живые организмы
обладают постоянным резервом свободных аминокислот, содержащихся
в тканях и в клеточном соке. Они находятся в динамическом равновесии
при многочисленных обменных реакциях. Аминокислоты используются для
биосинтеза полипептидов и белков, а также в синтезе фосфатидов, порфиринов и нуклеотидов. [4]
Свободные аминокислоты нужны в живом организме и для выполнения специфических задач. Так, глутаминовая кислота выполняет особую функцию переноса при переаминировании, метионин — при переметилировании.
Главными продуктами разложения аминокислот являются аммиак, мочевина и мочевая кислота. Восполнение потерь аминокислот происходит в основном в результате расщепления белков, а также переаминирования
α-кетокислот и взаимных превращений аминокислот. [5]
2.2. КЛАССИФИКАЦИЯ АМИНОКИСЛОТ
1. Классификация аминокислот по химическому строению радикалов.
По химическому строению аминокислоты делят на алифатические, ароматические и гетероциклические.
В составе алифатических радикалов могут находиться функциональные группы, придающие им специфические свойства: карбоксильная (СООН), амино (NH2), тиольная (SH), амидная (CO-NH2), гидроксильная (ОН) и гуанидиновая группы.
2. Классификация аминокислот по растворимости их радикалов в воде.
Все 20 аминокислот в белках организма человека можно сгруппировать по способности их радикалов растворяться в воде. Радикалы можно выстроить в непрерывный ряд. Он начинается полностью с гидрофобных радикалов и заканчивается сильно гидрофильными радикалами. Растворимость радикалов аминокислот определяется полярностью функциональных групп, входящих в состав молекулы (полярные группы притягивают воду, неполярные её отталкивают).
2.1 Аминокислоты с неполярными радикалами.
К неполярным радикалам (гидрофобным) относят радикалы, имеющие алифатические углеводородные цепи и ароматические кольца.
2.2 Аминокислоты с полярными отрицательно заряженными радикалами
К этой группе относят аспарагиновую и глутаминовую аминокислоты, имеющие в радикале дополнительную карбоксильную группу.
2.3 Аминокислоты с полярными положительно заряженными радикалами
Дополнительную положительно заряженную группу в радикале имеют лизин и аргинин.
Наибольшей растворимостью в воде обладают полярные заряженные радикалы аминокислот.
Также существуют три основные группы аминокислот:
1. Заменимые аминокислоты такие как, аланин, аргинин, аспарагин, глицин (гликокол), глутамин, глутаминовая кислота, пролин, серин, тирозин, цистеин (цистин), цитруллин, орнитин, таурин.
2. Частично заменимые аминокислоты такие как, аргинин и гистидин. Отличаются они от остальных тем, что организм может использовать их вместо, соответственно, метионина и фенилаланина для производства белка.
3. Незаменимые аминокислоты такие как, валин, лейцин, изолейцин, треонин, метионин, фенилаланин, триптофан, лизин. Они должны поступать в организм с пищей. Процесс синтеза белков постоянно идет в организме. В случае, когда хоть одна незаменимая аминокислота отсутствует, образование белков приостанавливается. Отсутствие или недостаток незаменимых аминокислот приводит к остановке роста, падению массы, нарушениям обмена веществ, при острой недостаточности – к гибели организма. Оптимальное содержание незаменимых аминокислот в пищевом белке зависит от возраста, пола и профессии человека, а также от других причин. Примерная суточная потребность взрослого человека в каждой из незаменимых аминокислот составляет в среднем около 1 г. Поступление в организм незаменимых аминокислот определяется количеством и аминокислотным составом пищевых белков. Это следует учитывать для организации правильного общественного питания и составления рационов для разных возрастных и профессиональных групп населения. Потребность в пищевом белке может быть полностью покрыта за счёт смеси аминокислот. Этим пользуются в лечебном питании.
Говоря о том, что одни аминокислоты «незаменимые», а другие – «заменимые», не следует упускать из виду общую биологическую значимость и незаменимость всех 20 аминокислот. Более того, можно даже заключить, что как раз «заменимые» аминокислоты более важны для клетки, чем «незаменимые», поскольку утрата способности организма (например, организма человека) синтезировать определенные аминокислоты представляется в эволюционном отношении более естественной в отношении менее важных аминокислот. Пищевые потребности в тех или иных соединениях свидетельствуют о том, что зависимость от внешнего источника метаболитов может оказаться более благоприятной для выживания организма, чем способность организма синтезировать эти соединения. [6]
2.3. СВОЙСТВА АМИНОКИСЛОТ
Важнейшим свойством аминокислот, освобождающихся в процессе гидролиза природных белков в условиях, исключающих рацемизацию, является их оптическая активность. Будучи растворенными в воде (или в НСl), они способны вращать плоскость поляризованного луча (исключение составляет глицин). Это свойство связано с наличием в молекуле всех природных аминокислот (за ислючением глицина) в α-положении асимметрического атома углерода (т. е. атома углерода, все четыре валентные связи которого заняты различными заместителями). Величины удельного вращения (вправо или влево) являются количественной характеристикой оптической активности. Для большинства аминокислот угол вращения составляет от 10 до 30°. Примерно половина аминокислот белков оказалась правовращающей, их обозначают знаком плюс. Остальные – левовращающие, их обозначают знаком минус. Все эти аминокислоты принадлежат к L-ряду, а величина и знак оптического вращения зависят от природы радикалов аминокислот и значения рН раствора, в котором измеряют оптическое вращение.
Стереохимию аминокислот принято оценивать не по оптическому вращению, а исходя из абсолютной конфигурации всех четырех замещающих групп, расположенных вокруг асимметрического атома углерода в вершинах модели тетраэдра. Абсолютную конфигурацию аминокислот принято соотносить стереохимически с соединением, произвольно взятым для сравнения, а именно с глицериновым альдегидом, также содержащим асимметрический атом углерода. Ниже представлены L- и D-стереоизомеры глицеринового альдегида. Рядом показаны пространственные конфигурации L-и D-аланина:
Все аминокислоты, образующиеся при гидролизе природных белков в условиях, исключающих рацемизацию, принадлежит к L-ряду. Таким образом, природные аминокислоты имеют пространственное расположение, аналогичное конфигурации L-глицеринового альдегида. Следует еще раз подчеркнуть, что символы L и D означают принадлежность данной аминокислоты по своей стереохимической конфигурации к L- или D-ряду, в то время как знак плюс или минус указывает на направление изменения плоскости поляризации светового луча. [7]
3. МЕТОДЫ ПОЛУЧЕНИЯ АМИНОКИСЛОТ
3.1. МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЙ СИНТЕЗ
Основным сырьем
для микробиологического
Почти все протеиногенные аминокислоты можно получать с помощью
специфических микроорганизмов. Принцип микробиологического метода
(ферментации)
заключается в аэробном
разбавленных питательных растворах. Они содержат усвояемые источники углерода и азота, как, например, углеводы, углеводороды, органические и неорганические соединения азота, минеральные соли и ростовые вещества.
Можно использовать также полупродукты биосинтеза аминокислот. Например, глутаминовая кислота получается из а-кетоглутаровой кислоты,
изолейцин и серии можно получать ферментацией культуры, содержащей
треонин или глицин. В качестве микроорганизмов применяются культуры
дикого типа, например Cornynebacterium glutamicum и Brevibacterium
flavum, а также мутанты, которые производят большое количество специфических аминокислот.
В случае ауксотрофных мутантов микроорганизмы не располагают некоторыми ферментами, необходимыми для биосинтеза определенных аминокислот. Синтез поэтому может остановиться на одной из первых ступеней или пойти по другому пути. Если продуктом первой ступени или продуктом такого побочного пути являются аминокислоты, то они производятся и аккумулируются в большом количестве, например применение мутанта, дефицитного по гомосерину из Eschrichia coli, обусловливает накопление лизина. Отсутствие гомосериндегидрогеназы блокирует гомосерин-треонин-метиониновый путь синтеза в пользу побочного синтеза, приводящего к образованию лизина. В случае
регуляторных мутантов, применяемых для получения аргинина, метионина, изолейцина и триптофана, наработка аминокислот осуществляется
путем нарушения механизма обратной связи.
[9]
Особое техническое значение приобрела ферментация глутаминовой кислоты так называемыми микроорганизмами дикого типа. Культивируют
бактерии в стерилизованных ферментерах при 35°С, используя в качестве
источника углерода глюкозу или патоку и вводя в систему воздух и аммиак. Через 40 ч из культуры можно изолировать глутаминовую кислоту.
Выход составляет 50 кг аминокислоты на 100 кг введенной глюкозы. Глутаминовая кислота в форме моноглутамата натрия применяется в значительных количествах как вкусовое вещество и приправа в пищевой промышленности. При незначительной добавке глутамата заметно усиливается и улучшается естественный вкус мясных блюд.
Путем микробиологической ферментации получают основное количество глутаминовой кислоты и весь лизин. У этого процесса свои преимущества и свои недостатки. С одной стороны, в нем мало стадий и требуется относительно простая и универсальная аппаратура. С другой стороны, живые микроорганизмы, с которыми приходится работать, очень чувствительны к малейшему изменению условий, а концентрация целевого продукта получается низкой, что ведет к увеличению размеров аппаратуры. [10]
Аминокислоты, полученные микробиологической ферментацией.
Таблица 1
Микроорганизмы |
Источники С, N |
Полученные аминокислоты |
|
Corynebacterium glutamicum |
Глюкоза или гидролизат крахмала, патока тростникового и свекловичного сахара, аммиак, мочевина |
Glu |
|
Мутанты Brevibacterium flavum |
Патока тростникового сахара и свекловичного сахара, гидролизат крахмала, м-алканы, уксусная кислота |
Lys, Val, Orn, Met, Trp, Glu |
Мутанты Preudomonas Irifoli и Е. coli |
Этанол, неорганические соединения азота |
Lys, Arg, He |
|
Serratia marcescens Род Corynebacterium Род Brevibacterium |
Фумаровая кислота, аммиак Фенилмолочная кислота Нефть, нитрат аммония Фосфаты, сульфат магния, хлорид марганца(11) |
Asp
Phe Glu, Ala, Asp Lys, Arg, Туг |
|
Candida lipopytica, E. coli и др. |
Хлорид кальция и сульфат железа(11) в следовых количествах |
Gly, Trp, Pro, Ser |
[1]
Известны два способа получения аминокислот: одноступенчатый и двухступенчатый. Согласно первому способу, например, мутантный полиауксотрофный штамм - продуцент аминокислоты культивируют на оптимальной для биосинтеза среде. Целевой продукт накапливается в культуральной жидкости, из которой его выделяют согласно схеме.
Технологическая схема получения аминокислот.
1 - ферментатор,
2 - охладитель, 3,9 - рефрижераторы,
4 - емкость для предварительной обработки,
5 - центрифуга,
6 - вакуум - упариватель,
7 - аппарат прямой
8 - барабанный фильтр, А,Б - пути (при необходимости смыкающиеся),
10 - аппарат для ультрофилырации,
11 - емкость для консервации раствора фермента,
12 - мембранный фильтр,
13 - накопитель жидкого консерванта, 14-емкость для осаждения фермента,
15 - фильтр - пресс,
16 - распылительная сушилка,
17 - накопитель сухого концентрата.
В двухступенчатом способе микроб - продуцент культивируют в среде, где он получается и синтезирует все необходимые ингредиенты для последующего синтеза (в идиофазу) целевого продукта.
Если ферменты биосинтеза аминокислоты накапливаются внутриклеточно, но после 1 - ой ступени клетки сепарируют, дезинтегрируют и применяют клеточный сок. В других случаях для целей биосинтеза целевых продуктов применяют непосредственно клетки. [8]
3.2. ХИМИЧЕСКИЙ СИНТЕЗ
Химический синтез позволяет получать соединения любой возможной структуры и обеспечивает получение природных аминокислот необходимой степени химической и оптической чистоты. Здесь используется непищевое минеральное сырье, достигается высокая концентрация продукта. Его недостатком является то, что в процессе синтеза образуется смесь из биологически активной L-формы и D-изомера аминокислоты. D- форма является балластом, так как она не усваивается животными и человеком. Некоторые D-формы аминокислот обладают токсическими свойствами. Разделение изомеров – дорогая и трудоемкая процедура.
Существует
много методов химического
1. Аминолиз галогенкарбоновых кислот.
Старейший метод синтеза аминокислот — нуклеофильное замещение галогена в легкодоступных галогенкарбоновых кислотах:
R - CHCl(Br) - СООН + NH3 - R - CHNH2 - СООН + NH4Cl(Br)
Впервые таким путем в 1858 г. был получен глицин из монохлоруксусной кислоты. Выходы составляют 60 — 70%, если применять 10-кратный
избыток аммиака и работать в присутствии карбоната аммония. При этом
аминогруппа образующейся кислоты дает карбамат аммония R = CH(NH-СОО NH4), и это предохраняет ее от дальнейшего превращения во вторичные и третичные аминосоединения.
[11]
2. Синтез Штрекера.
Синтез аминокислот,
предложенный в 1850 г. Штрекером, основан
на присоединении синильной
кислоты омыляется далее в DL-аминокислоту:
В качестве побочных продуктов могут получаться иминодинитрилы
NH(CHR-CN)2, тринитрилы и карбоновые кислоты; общий выход при этом синтезе - 7 5 % .
Бухерер внес изменения в синтез Штрекера: альдегид реагирует со смесью цианида натрия и карбоната аммония (или мочевины) и дает легко изолируемый гидантоин, который затем расщепляется щелочным гидролизом:
Синтез Штрекера имеет большое значение для получения в промышленности глутаминовой кислоты, метионина и лизина. Исходные альдегиды получают из продуктов нефтехимического производства, и синтезы обычно ведут через гидантоины. По методу Дюпона исходят из ацетилена:
По методу Аджиномото получают DL-глутаминовую кислоту, исходя из акрилонитрила:
Расщепление рацемата по этому методу происходит самопроизвольной кристаллизацией при затравливании оптически чистыми кристаллами, причем выпавшая в осадок D-глутаминовая кислота после рацемизации снова вводится в процесс. В настоящее время в мире ежегодно производится -250000 т глутамата натрия, причем большую часть составляет продукт, полученный синтетически.
При техническом синтезе лизина исходят из цианмасляного альдегида, который получают присоединением ацетальдегида к акрилонитрилу:
Промышленное производство DL-метионина (в 1977 г. произведено 100 000 т), который применяется главным образом как добавка в корм скоту, ведется по методу Штрекера из /3-метилмеркаптопропионового альдегида, который получают из акролеина и метилмеркаптана. В этом случае не требуется разделения энантиомеров, так как L- и D-метионин одинаково хорошо усваиваются животными.
[1]
3.3. ПОЛУЧЕНИЕ АМИНОКИСЛОТ ГИДРОЛИЗОМ БЕЛКОВОСОДЕРЖАЩЕГО СЫРЬЯ
При получении аминокислот белки, прежде всего, расщепляют с помощью
основного, кислотного или ферментативного гидролиза. В классическом методе кислотного гидролиза используют 6 н. НCL или 8 н. H2SO4. Время реакции от 12 до 72 ч в зависимости от строения белка. Очень устойчивы к гидролизу пептидные связи, образованные лейцином, изолейцином и валином. При этом триптофан разрушается полностью, серии и треонин до 10%,
Потери аминокислот, которые обусловливаются присутствием углеводов, могут быть снижены, если работу проводят в вакууме и применяют большой избыток кислоты.
В других методах кислотного гидролиза используют смесь пропионовой
кислоты с 12 н. НСL (время реакции при 160 °С 15 мин, при 130 °С 2 ч),
3 н. 4-толуолсульфокислоту или 3 н. меркаптоэтансульфоновую кислоту (время реакции при 110 °С 24 ч). Последний метод используется
специально для аналитических целей. Триптофан при этом сохраняется на 95%.
При щелочном гидролизе с 6 н. раствором гидроксида бария в автоклаве (давление ~ 700 кПа) разрушаются гидроксиаминокислоты и цистеин, в то время как триптофан сохраняется.[12]
Очень легко протекает ферментативный гидролиз белков. Для осуществления полного гидролиза необходимо применение комбинации нескольких ферментов, что связано с высокой специфичностью протеаз. На практике применяют протеиназы животного и бактериального происхождения (эндопептидазы), такие, как трипсин, пепсин и папайи в комбинации со специфическими амино- и карбоксипептидазами. Нередко хорошие результаты получают, используя неочищенный фермент (сырой препарат), например панкреатин, который содержит все пищеварительные ферменты поджелудочной железы (используют при получении аспарагина и глутамина).
Выделение отдельных аминокислот из белкового гидролизата не сопровождается никакими затруднениями в тех случаях, когда они содержатся в достаточно высоких концентрациях и заметно отличаются друг от друга по свойствам.
Глутаминовая кислота, например, кристаллизуется прямо из концентрированного гидролизата, насыщенного хлористым водородом, цистин и тирозин отделяют благодаря их плохой растворимости в воде. Селективное отделение ароматических аминокислот удается выполнить с помощью адсорбции на активированном угле. Полученную при гидролизе смесь аминокислот лучше всего разделить хроматографически. Выделению отдельных компонентов предшествует обычно разделение на кислые, основные и нейтральные группы аминокислот, при этом большое значение имеют электрофорез и специфические ионообменники. Раннее распространенные методы разделения, такие, как фракционная перегонка эфиров (по Фишеру), экстракция моноаминокарбоновых кислот н-бутиловым или амиловым спиртом, осаждение гексоновых оснований лизина, аргинина и гистидина фосфорновольфрамовой кислотой или флавиановой кислотой, теперь имеют только второстепенное значение. [13]
3.4. ФЕРМЕНТАТИВНЫЙ МЕТОД ВЫДЕЛЕНИЯ АМИНОКИСЛОТ
В то время как при ферментации аминокислот присутствуют все ферменты микроорганизмов, при ферментативных синтезах используются изолированные или фиксированные на носителе ферменты для катализа заданного пути реакции. Так, при получении аспарагиновой кислоты путем присоединения аммиака к фумаровой кислоте используют L-аспартазу, при получении L-аланина из L-аспарагиновой кислоты — L-аспартат-β-декарбоксилазу.
Особенно большое значение имеет синтез L-лизина из D, L-а-аминокапролактама с помощью L-аминокапролактамгидролазы, получаемой микробиологическим путем. В этом синтезе, проводимом как одностадийный процесс, остающийся D-a-аминокапролактам рацемизуется а-аминокапролактамрацемазой и таким образом, в конце полностью переводится в L-лизин.
[14]
3.5. ФЕРМЕНТАТИВНОЕ РАЗДЕЛЕНИЕ ОПТИЧЕСКИХ ИЗОМЕРОВ АМИНОКИСЛОТ
Перспективным
методом получения L-
Ферментативное разделение рацематов аминокислот с L-ацилазами основано на избирательном гидролизе ацилированных производных L-аминокислот. При отщеплении ацильной группы L-аминокислоты становятся растворимыми и легко отделяются от малорастворимых ацилированных D-аминокислот. [8]
Некоторые протеолитические ферменты, например химотрипсин, проявляют высокую L-эстеразную активность. Амидазы гидролизуют амиды аминокислот с образованием L-аминокислот. Не прореагировавшие производные D-аминокислот могут быть подвергнуты рацемизации и вновь использованы для ферментативного разделения.
При культивировании
микроорганизмов с ацилазной, амидазной
и эстеразной активностью для
повышения выхода целевого продукта
необходимо вводить в среду
У многих микроорганизмов, прежде всего грибных и дрожжевых культур, ацилазы являются внутриклеточными ферментами. Поэтому для их использования клетки необходимо предварительно подвергать дезинтеграции. [15]
4. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ В ПРОМЫШЛЕННОСТИ
