Применение молекулярных маркеров в селекции пшеницы

Кафедра генетики и биотехнологии

Курсовая работа по прикладной биотехнологии

«Применение молекулярных маркеров в селекции пшеницы»

Выполнил: студент 505 группы

агрономического факультета

Злобин И.Е.

                                       Проверил:

Москва, 2011

Содержание:

1. Общая характеристика молекулярных маркеров и особенности их использования в селекции пшеницы……………………………….3
2. Генетические карты пшеницы………………………………………6
3. Картирование единичных или главных генов………………..…….7
4. Картирование генов количественных признаков………………....10
5. Селекция с использованием молекулярных маркеров…………....12
6. Создание популяций для маркерной селекции на пшенице…..….14
7. Будущее молекулярной генетики пшеницы……………………….18
8. Список литературы ………………………………………………….20

Общая характеристика молекулярных маркеров и особенности  их использования в селекции пшеницы

Молекулярная генетика, или  использование молекулярных техник для обнаружения различий в ДНК  разных растений, имеет множество  возможностей для применения в улучшении злаковых культур. Нередко удается установить различия в ДНК разных генотипов растений, которые ассоциированы со специфическими генами и являются «метками» этих генов. Такие различия называются молекулярными маркерами. Такие маркеры, когда они очень прочно связаны с генами интереса, могут быть использованы для отбора желаемого аллеля с целью ускорить беккроссирование данного аллеля или сосредоточить несколько аллелей в 1 генотипе. Маркеры также могут быть использованы для расчленения полигенных признаков на менделирующие компоненты или локусы количественных признаков, таким образом усиливая понимание наследования и действия генов данных признаков и позволяя использовать маркерную селекцию как дополнение к обычным селекционным методам.(1) Молекулярные маркеры также используются для оценки уровня генетической разнородности среди различных сортов, между популяциями, среди родственных видов и т.д. Применений для таких оценок множество, например фингерпринтинг сортов  для их идентификации и защиты, понимание взаимоотношений между различными изучаемыми объектами, эффективное управление генетическими ресурсами, облегчение интрогрессии хромосомных сегментов из других видов, и даже идентификация специфических генов. В дополнение, маркеры и сравнительное картирование различных видов являются очень ценными для улучшения понимания геномной структуры и функционирования и позволяют использовать изоляцию генов интереса с помощью генетических карт.(4)

Имеется несколько типов  молекулярных маркеров, каждый тип  имеет преимущества и недостатки. В таблице 1 приведены характеристики и использование наиболее распространенных маркерных систем. Первыми маркерами были RFLP-маркеры, которые широко и успешно использовались для создания карт сцепления у различных культур, в т.ч. у пшеницы. С развитием полимеразной цепной реакции был разработан ряд новых типов маркеров. Первыми из них были RAPD-маркеры, которые быстро превзошли RFLP по популярности благодаря большей простоте и меньшей стоимости анализа. Микросателлитные маркеры, или маркеры на основе простых повторов (SSR), соединяют преимущества RFLP (кодоминантность, надежность, специфическая геномная локализация) с простотой RAPD-маркеров и имеют преимущества в обнаружении высокого уровня полиморфизма. Маркеры на основе полиморфизма длин амплифицированных последовательностей (AFLP) имеют преимущество над маркерами, основанными на ПЦР, при работе с селективно амплифицированными фрагментами ДНК, предварительно расщепленной 1 или 2 рестриктазами. AFLP-маркеры способны выявить наибольший уровень полиморфизма за 1 реакцию.(1)

Таблица 1.  
Характеристика и использование различных типов молекулярных маркеров в молекулярной генетике и селекции пшеницы

Пшеница представляет собой  достаточно сложный объект для молекулярно-генетических исследований. Она является аллополиплоидом, содержащим 3 разных, но в целом родственных генома – А, В и D. Гаплоидный геном пшеницы содержит примерно 1,7*10¹⁰ н.п.; в среднем 1 хромосома содержит 810 млн.н.п. Средняя хромосома пшеницы в 25 раз длиннее, чем хромосома риса; таким образом, 3 хромосомы пшеницы по размеру эквивалентны гаплоидному геному кукурузы, а гаплоидный геном риса соответствует по размеру всего ½ хромосомы пшеницы. Такие большие размеры генома пшеницы являются результатом полиплоидии и обширных дупликаций, в результате чего ок.80% генома состоит из повторяющихся последовательностей ДНК, а уровень полиморфизма на пшенице значительно ниже, чем, например, на кукурузе. (7)

Таблица 2.

Характеристики генома мягкой пшеницы, обусловливающие трудности  в картировании по сравнению с  диплоидной кукурузой.

С другой стороны, пшеница  имеет и некоторые преимущества для использования молекулярных методов. Большая часть генов  пшеницы находится в геноме в  виде кластеров, а хромосомные регионы, окружающие данные кластеры, имеют  высокую частоту рекомбинации. Эти  регионы являются удобными для молекулярных манипуляций по сравнению с другими  злаковыми с небольшим геномом, такими как рис или сорго. Кроме  того, гексаплоидная природа пшеницы и удобство проведения с ней различных цитогенетических манипуляций предоставляют уникальные инструменты для молекулярно-генетических исследований. В их число входят использование различных анеуплоидов, таких как нуллитетрасомные и дителосомные линии, для определения молекулярных маркеров к специфическим плечам хромосом, линий с делециями хромосом для физического картирования маркеров и линий с единичными хромосомными замещениями для картирования генов с известной хромосомной локализацией.(7)

Генетические карты пшеницы

Определение карт сцепления  генов пшеницы обеспечивает базу для картирования генов, ответственных  за экспрессию интересующих нас признаков. На пшенице такие карты также обеспечивают цитологические свидетельства основных хромосомных перестроек и делают возможным составление сравнительных карт близких видов.

Первые RFLP-карты были составлены для гомеологичных хромосом группы 7. После этого были составлены карты хромосом групп 3, 2, 5, 4, 7 и 6. В общей сложности составленная объединенная генетическая карта сейчас содержит более 500 локусов. (6)

Другая важная популяция  для картирования была получена в  CIMMYT путем скрещивания синтетической (амфигексаплоидной) пшеницы (Aegilops tauschii [syn. Triticum tauschii] x Altar 84 durum) с сортом яровой мягкой пшеницы Opata 85 и была генотипирована в Корнельском университете в США. Использование такого скрещивания привело к созданию популяции с очень высоким уровнем полиморфизма, благодаря чему была создана очень подробная карта (около 1000 RFLP-локусов). Недавно с использованием SSR-маркеров была составлена т.н. ITMI-карта, на которой расположено 279 SSR-локусов. (2)

На основе RFLP были сконструированы ряд физических карт с использованием делеционных линий сорта Chinese Spring. Эти делеционные линии также были использованы для конструирования на основе SSR физической карты хромосом группы 2. В общем, генетические карты выявили более низкий уровень полиморфизма в геноме D .

Более того, большое число  RFLP-локусов и достаточное количество микросателлитных локусов используются для локализации хромосомных плеч с использованием линий нуллисомиков-тетрасомиков и дителосомиков.

На сегодняшний день известно более 850 тысяч EST для пшеницы; с использованием SNP-маркеров создана карта, включающая более 16000 EST-локусов.(7)

Картирование  единичных или главных генов

В последние 5 лет было картировано в специфических хромосомных регионах большое число генов с различными функциями. Таблица 3 включает большую часть этих генов, контролирующих устойчивость к болезням и вредителям, устойчивость к стрессу, качество и другие признаки. К данным результатам привели несколько стратегий картирования/маркирования с использованием в основном RFLP и RAPD-маркеров. Как видно из таблицы 3, несколько RFLP- и RAPD-связанных маркеров были затем переведены в маркеры на основе ПЦР, которые являются более надежными, такие как STS, SCAR и ASA.

Существование многочисленных наборов практически изогенных  линий (NIL), различающихся присутствием или отсутствием одного аллеля устойчивости облегчило картирование генов, для которых такие линии существуют; например, такие линии существуют для генов Pm1, Pm2 и Pm3, кодирующих устойчивость к ложной мучнистой росе, Lr9 и Lr24 – к бурой ржавчине, Bt-10 – к твердой головне, Yr15 – к желтой ржавчине.(2) Серии NIL сорта Newton были обследованы на аллели устойчивости к гессенской мухе с использованием 1600 рандомных 10-нуклеотидных праймеров. Для каждого из 11 маркируемых генов было идентифицировано от 1 до 3 RAPD-маркеров, а также определено сцепление данных генов путем скрининга F2-популяций отдельно для каждого гена. NIL сорта Thatcher были обследованы по гену устойчивости к бурой ржавчине Lr, расположенному на длинном плече хромосомы 5D, с использованием 37 RFLP-зондов к хромосомам 5-й группы, и после тестирования популяции F2 между Thatcher и Lr1/Thatcher обнаружили, что 3 из них связаны с геном Lr1. Схожий подход был использован для гена Cre1, который определяет устойчивость к овсяной цистообразующей нематоде, для которого обнаружили 2 RFLP-маркера, фланкирующих данный ген на длинном плече хромосомы 2В. (5)

Когда хромосомная локализация  определенного гена известна из предыдущих генетических исследований, но нет  доступных NIL, можно использовать  маркеры, картированные для данной хромосомы, чтобы оценить родительские линии на полиморфизм, сконструировать карту единичной хромосомы и определить, какой маркер является наиболее близким к гену интереса. Эта стратегия использовалась при маркировании локус Kna1 в пшенице, ответственного за большее накопление калия по отношению к натрию (К+/Na+) в листьях – признак, коррелирующий с более высокой солеустойчивостью.(9) Популяции для картирования были получены путем скрещивания линий, схожих генетически, но отличающихся 1 хромосомой, беккроссирования с моносомными линиями по изучаемой хромосоме, идентифицирования моносомных растений с гемизиготной рекомбинантной хромосомой, самоопыления данных растений и обнаружения рекомбинантов-дисомиков. Несмотря на трудности в создании таких популяций для картирования, основным преимуществом, которое они предоставляют, является оценка фенотипического эффекта гена интереса без эффекта смешивания других генов (или других хромосом), вовлеченных в экспрессию того же признака.

Метод BSA (bulk segregant analysis), разработанный для маркирования генов устойчивости к болезням у салата-латука, были успешно применены на пшенице. Данный подход в основном используется с RAPD-маркерами (для генов устойчивости к мучнистой росе Pm1 и Pm2) хотя сейчас он используется и с AFLP-маркерами.(2) И та, и другая маркерная технология используются для скрининга 2 объемов образцов ДНК из индивидуальных растений, идентифицированных из популяции, расщепляющейся по интересующему нас признаку. В 2 образцах все локусы должны быть одинаковы, кроме региона генома, связанного с целевым геном, по которому расщепляется популяция. Для преодоления проблем ограниченной воспроизводимости RAPD-маркеров, и учитывая, что повторяющиеся последовательности часто амплифицируются, BSA и RAPD используют на ДНК, обогащенной низкоповторяющимися (низкокопийными) последовательностями. В результате наблюдалось значительное улучшение воспроизводимости и повышение выявленного уровня полиморфизма по сравнению с необогащенной ДНК. Технология AFLP имеет преимущество перед RAPD – большое число фрагментов ДНК, амплифицируемых с 1 комбинацией праймеров, а проблема высокоповторяющейся ДНК преодолевается путем использования чувствительных к метилированию нуклеаз, таких как Pst1 и Sse1.(1)

Тот факт, что ряд генов  устойчивости, картированных на пшенице, был интрогрессирован из других видов, объясняет успех их маркирования, т.к. обнаруживается более высокий уровень полиморфизма по сравнению с сегментами, в которых нет перенесенной ДНК других видов.

Таблица 3. Опубликованные маркеры к хозяйственно важным генам  пшеницы 

Картирование  генов количественных признаков

Малое число количественных признаков, распределенных в соответствующие  им ЛКП на пшенице, является отражением ориентации на просто наследуемые признаки и сложности построения исчерпывающих  генетических карт.

Найден ЛКП прорастания зерна на корню в результате исследования с использованием около 40 RFLP-маркеров на 2 расщепляющихся популяциях рекомбинантных инбредных линий (RIL), которые оценивались по признаку прорастания на корню в 7 различных средах.(8) Используя комбинацию RFLP-маркеров на большей части популяции RIL и селективное генотипирование с AFLP части популяции, идентифицированы 5 предполагаемых ЛКП устойчивости к фузариозу колоса (табл.3)/

В CIMMYT усилия в выведении устойчивости к болезням в целом и к листовой ржавчине в частности сосредоточились на использовании жесткой устойчивости. Такая устойчивость контролируется рядом минорных генов, которые также называются APR (adult plant resistance). Чтобы определить локализацию и число этих генов и найти тесно сцепленные с ними маркеры, в CIMMYT вовлекли в картирование APR-локусы в устойчивых к листовой ржавчине сортах Parula и Frontana. Используя BSA  на наборе RIL от скрещивания между сортами Parula и Siete Cerros, идентифицированы 3 RAPD-маркера, связанных с 2 локусами устойчивости к листовой ржавчине. Нулли-тетрасомный анализ показал, что они локализованы на длинном плече хромосомы 7B и коротком плече хромосомы 1B или 1D. В СIMMYT также составили генетическую карту сцепления с использованием RFLP, SSR и AFLP-маркеров в расщепляющейся популяции, полученной от скрещивания Frontana x INIA66, чтобы картировать прежде всего жесткую устойчивость к листовой ржавчине, но также и другие важные признаки, которые расщеплялись в данной популяции. Хотя карта сейчас включает ок.450 маркерных локусов, некоторые пробелы до сих пор существуют, и усилия сосредотачиваются на их заполнении с использованием SSR-маркеров. С использованием данной карты и метода комбинированного интервального картирования, CIMMYT идентифицировал 5 и 7 ЛКП устойчивости к листовой ржавчине и вирусу желтой карликовости ячменя, соответственно.(7)

Селекция с  использованием молекулярных маркеров

Для эффективного применения молекулярных маркеров в селекции требуется 3 фактора:

1. доступность дешевых,  простых в использовании и  надежных маркеров

2. подтверждение маркеров  на различном генетическом фоне

3. возможность их использования  в селекционной программе 

RFLP, RAPD и AFLP не удовлетворяют 1-му требованию. Однако имеются техники, чтобы конвертировать их в более «дружественные» маркеры. Клоны RFLP могут быть секвенированы, и созданы праймеры для амплификации ДНК-фрагментов, для которых с помощью гибридизации показана их полиморфность. Однако получаемые таким образом STS или SCAR-маркеры не всегда являются полиморфными, и в этом случае требуются дальнейшие манипуляции. Амплифицированный фрагмент обычно расщепляется 1 или 2 рестриктазами для того, чтобы выявить небольшие различия по длине, или фрагмент из 2 или более сортов клонируется и секвенируется снова для создания ASA-маркеров, с помощью которых можно обнаружить различия всего по 1 нуклеотиду. RAPD- и AFLP-фрагменты могут быть выделены из геля, клонированы и секвенированы для создания STS или SCAR, и, если нужно, ASA. Подходы для создания таких маркеров для пшеницы не всегда являются успешными и легко достижимыми. Однако, если они есть, они представляют собой очень надежные маркеры. С другой стороны, если SSR тесно связаны с генами интереса, то они, вероятно, являются наиболее привлекательными маркерами, т.к. для их применения не требуется дальнейших манипуляций.

Несмотря на то, что в таблице 3 представлено большое количество маркеров для генов пшеницы, лишь некоторые из этих маркеров являются достаточно тесно связанными с генами интереса, чтобы быть полезными в селекции. Некоторые из этих были протестированы на с использованием ряда сортов пшеницы, напр., Lr1, Pm1 и Pm2, Bt-10, гены устойчивости к гессенской мухе, Cre1 и Cre3. Хотя, в общем, исследовано недостаточное число сортов, некоторые маркеры, по всей видимости, являются надежными, например маркеры к генам Lr9,Lr10 и Lr19.(4)

Другим фактором, хотя и  влияющим в меньшей степени на успешность использования ДНК-маркеров в селекции, является недостаток маркеров, используемых непосредственно в селекционных программах. Часто ученые, подбирающие маркеры, не связаны напрямую с селекционными программами и/или их лаборатории не в состоянии поддерживать достаточно значительные объемы растительного материала, требуемые для осуществления селекционных программ.

На сегодняшний день ДНК-маркеры  в селекции пшеницы используются довольно ограниченно. Примерами их использования могут служить ASA или SCAR-маркеры к признакам поглощения кадмия, высокого содержания белка и транслокации 1В/1R. Сообщается об очень надежных маркерах для генов Cre1 и Cre3 и о возможности использовать их для внедрения 2 аллелей устойчивости в австралийские сорта пшеницы.

CIMMYT в настоящее время занимается проверкой ряда маркеров к генам интереса (напр., Ph1, Sr2, Lr1, 9, 10, 24 и HP) на имеющейся зародышевой плазме и созданием оборудования для простого и надежного использования маркеров в селекционных программах. При этом оборудование создается только для использования маркеров, основанных на ПЦР, и будет включать ДНК-секвенаторы и автоматические пипетирующие станции, чтобы иметь возможность обрабатывать большое число образцов в селекционных программах.(7)

Создание популяций  для маркерной селекции на пшенице

На сегодняшний день технология использования молекулярных маркеров усовершенствована настолько, что  основным практическим ограничением для  применения ее в селекции растений является поддержание популяции, достаточно большой для идентификации целевых  рекомбинантов. Сейчас обычным явлением являются селекционные программы пшеницы, в которых селекционная популяция анализируется по 10-12 несвязанным друг с другом локусам. Кроме маркерных локусов, популяции должны быть достаточно большими для сохранения достаточной вариабельности по многим признакам, для которых нет маркеров и селекция на которые должна производиться с использованием традиционных фенотипических оценок.(3)

Независимо от улучшений  в маркерной технологии, требуется  критический минимальный уровень  популяции для обеспечения с  высокой степенью доверия присутствия  целевого генотипа в селекционной популяции. Этот минимальный размер популяции  изменяется в зависимости от следующих  параметров:

- числа объединяемых локусов

- частоты встречаемости  альтернативных аллелей в данных  локусах

- степени генетической  сцепленности маркера с целевым геном

- характера наследования  маркера (доминантный или кодоминантный)

- уровня гомозиготности и сцепления между целевыми аллелями

Знание минимального размера  популяции позволяет осуществить  эффективное распределение ресурсов путем гарантии того, что размеры  популяции достаточно велики для  высокой вероятности успешной работы, но не требуют больше ресурсов, чем  необходимо. Понимание эффектов инбридинга, типа популяции (бипарентальная популяция, популяция беккроссов), частоты аллелей и точность определения минимального размера популяции очень важны для осуществления экономически эффективных стратегий скрещивания и селекции.

Стратегии, которые увеличивают  частоту целевых генотипов, должны увеличивать эффективность маркерной  селекции, позволяя использовать популяции  меньшего размера или селекцию по большему числу локусов. Одним из наиболее употребимых путей увеличения частоты целевых генотипов является «обогащение» целевыми аллелями популяции F2 (F2-обогащение) путем отбора носителей (или негативного отбора гомозигот, которые не несут целевых аллелей), беккроссирования для увеличения частоты рекуррентных родительских аллелей, и инбридинга (или получения дигаплоидных популяций) для увеличения частоты гомозигот в популяции, являются эффективными стратегиями достижения этих целей. Характер наследования маркера (доминантный или кодоминантный) не изменяет размер популяции, требуемой для обеспечения присутствия целевого генотипа, но влияет на количество тестов, требуемых для идентификации экземпляра растения, несущего этот генотип.

Наиболее эффективной  стратегией уменьшения размера популяции, требуемой для получения гомозиготы по целевым локусам, является F2-обогащение с последующим отбором гомозигот в более поздних поколениях или в популяциях дигаплоидов. F2-обогащение производится в 2 этапа. На 1-м этапе происходит собственно обогащение, когда из популяции F2 отбираются  особи, несущие целевые аллели как в гомо-, так и в гетерозиготном состоянии. После этого на 2-м этапе происходит создание более или менее гомозиготных линий на основании отобранных в F2 растений. F2-обогащение эффективно потому, что оно существенно увеличивает частоту встречаемости аллелей, но требует для скрининга относительно небольшую популяцию F2. Например, в бипарентальной F2-популяции, где каждый полиморфный аллель имеет ожидаемую частоту 0,5, ожидаемая частота носителей данного целевого аллеля составляет 0,75, а для n локусов – 0,75ⁿ. Частота встречаемости гомозигот намного ниже – 0,25ⁿ. После обогащения частоты отбираемых аллелей возрастают в среднем до уровня 0,67, что ведет к существенному увеличению частоты целевых гомозигот в поздних поколениях или популяциях дигаплоидов, полученных из F2. Если отбор планируется производить по 6 локусам, для обогащения требуется только 16 индивидуальных образцов F2, в то время как для идентификации индивидуальных гомозигот по 6 целевым аллелям требуется 12270 образцов. После обогащения для получения гомозиготы с 6 целевыми локусами требуется популяция F2:3 всего из 191 растения, по сравнению с 1076 растениями в популяции F2:3, которая не подвергалась обогащению. Сокращение размера популяции в результате обогащения растет пропорционально увеличению числа локусов. В результате F2-обогащения достигается также значительное снижение размера популяций топкроссов и беккроссов. (3)

Инбридинг эффективен для  снижения размера популяции благодаря  снижению уровня гетерозиготности в популяции в 2 раза каждый год. В бипарентальной популяции инбридинг от F2 к F2:3 снижает частоту гетерозигот по каждому полиморфному локусу с 0,5 до 0,25. В популяции, в которой производится отбор по 3 локусам, инбридинг от F2 к F2:3 снижает размер популяции, требуемой для создания гомозиготы по этим 3 аллелям, со 191 до 56 растений. В дальнейших циклах инбридинга достигается все менее значительное уменьшение размера популяции с каждым шагом. Сокращение численности популяции в результате инбридинга дополняет сокращение от F2-обогащения и беккроссирования.(4)

Беккроссирование также снижает размер популяции по сравнению с бипарентальными скрещиваниями. Сокращение объясняется увеличением частоты аллелей рекуррентного родителя с 0,5 до 0,75. Сокращение размера популяции происходит всякий раз, когда один из родителей вносит в скрещивание больше целевых аллелей, чем другой. Преимущества беккроссирования дополняют F2-обогащение и инбридинг, хотя относительное преимущество, получаемое в результате беккроссирования, уменьшается в обогащенных популяциях, которые легче становятся инбредными. (4)

Характер наследования маркера  не влияет на размер популяции, требуемый  для получения целевого генотипа, но часто влияет на объем проверок, требуемых для идентификации  индивидуальных растений, несущих данный генотип. Если маркер доминантный, то требуется  проверка по потомству для идентификации  гомозигот в ранних поколениях, что ведет к увеличению количества проверяемого материала. Вероятность того, что индивидуальный образец, несущий доминантный маркер, гомозиготен по данному локусу, меняется в зависимости от аллельной частоты и уровня инбридинга. Если вероятность гомозиготности равна или выше принятого уровня (обычно 95%), то проверки по потомству не требуется. Если селекция ведется на несколько локусов, то вероятности для всех локусов перемножаются. С увеличением числа используемых доминантных маркеров требуется более высокий уровень инбридинга, чтобы избежать проверки по потомству. Многие недостатки доминантных маркеров преодолеваются, если получение более гомозиготной популяции привлекательно по другим причинам. Преимущества кодоминантных маркеров над доминантными для F2-обогащения состоит в том, что они выявляют действительную частоту аллелей и генотипов, что означает возможность уменьшения размеров последующих популяций, если частоты выше ожидаемых, и увеличения – если ниже. (5)

Селекция по фенотипическим  признакам должна использоваться в  сочетании с маркерной селекцией. Фенотипическая селекция обычно применяется  в поздних поколениях,  когда  наследуемость выше и больше количество семян. Размеры популяции должны быть достаточно большими для гарантии того, что желаемые фенотипически отбираемые аллели не утеряются в результате дрейфа генов раньше, чем можно будет применить оценку по фенотипу. Так как маркерная селекция аллелей применяется раньше, чем фенотипическая, то большее количество индивидуальных растений может быть отобрано с помощью маркеров.