Процессы брожения и созревания пивного сусла
МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
ГОСУДАРСТВЕННОЕ
КЕМЕРОВСКИЙ ТЕХНОЛОГИЧЕСКИЙ ИНСТИТУТ
ПИЩЕВОЙ ПРОМЫШЛЕННОСТИ
Кафедра технология бродильных производств и консервирования
Курсовая работа
Тема: Процессы брожения и созревания пивного сусла.
Метаболизм дрожжей.
Выполнила студентка: Афанасьева Е.Б
Факультет технологический
Спец.140500, 4 курс
Принял преподаватель:
Доц. Тихомирова Е.А.
Кемерово 2010 г.
1.Введение
Пиво- слабоалькогольный, жаждоутоляющий, игристый напиток с характерным хмелевым ароматом и приятным горьковатом привкусом. В пиве кроме воды, этилового спирта и диоксида углевода содержится значительное количество питательных и биологически активных веществ: белков, углеводов, микроэлементов и витаминов.
По цвету пиво делится на светлое и темное, а в зависимости то вида применяемых дрожжей – на пиво низкого и верхового брожения.
Около 90 % производимого пива низового брожения приходится на светлые сорта, для которых характерны тонкий, слабо выраженный солодовый вкус, хмелевой аромат и ярко выраженная хмелевая горечь. Их готовят из светлого пивоваренного солода с добавкой несоложеных материалов (ячменя, рисовой сечки, обезжиренной кукурузы, сахара), воды, хмеля или хмелевых препаратов. Первые эксперименты по низовому брожению начали проводится в Германии .После изучения и воспроизводства различных видов дрожжей популярность приготовления пива эти м способом резко возросла. Появилось пиво, способное сохраняться несколько месяцев.
Брожение- это сложный биохимический процесс превращения веществ питательной среды в новые вещества под действием микроорганизмов и ферментов, вырабатываемыми микроорганизмами.
Получение пива ,кваса, вина и спирта основано на брожении.
1.1.Вода
Соли, содержащиеся в ней, влияют на вкус, аромат, цвет, органолептические показатели пива. Для приготовления светлых сортов пива используют в основном мягкую воду. Для темного пива жесткость воды может быть выше. В жесткой воде хмель дает более грубую горечь, цвет сусла получается более темным. К тому же вода, употребляемая для пивоварения, должна иметь слабокислую или нейтральную реакцию. Регулировать это можно за счёт способов водоподготовки: реагентного, ионообменного, электродиализного и мембранного. Для удаления неприятного запаха воду дезодорируют путем пропускания через колонку, заполненную активированным углем. Щелочная вода для пивоварения непригодна.
1.2.Дрожжи
Это одноклеточные микроорганизмы, грибы, растительного происхождения, которые являются возбудителями брожения, используемые для приготовления хлеба, вина, пива, кваса, виски и др. путем брожения. Для пивоварения используются пивные дрожжи, годные для многократного производства. На эти микpооpганизмы могут быть установлены авторские права. Многие пивные компании используют свои особые дрожжи, штаммы которых содержится в секрете.
1.3.Несоложёное сырье.
Ферментативный потенциал
солода достаточен, чтобы расщеплять добавочное
количество крахмала. Поэтому во всем
мире часть солода в среднем порядка 15-20% -
заменяют несоложеными зернопродуктами.
Это сырье, более дешевое, чем сравнительно
дорогой солод, принято называть несоложеным
сырьем. Особенно популярны такие виды
зерновых, которые возделываются в данном
регионе в сравнительно большом объеме,
например: в Америке - кукуруза и рис; в Азии -
рис; в Африке - сорго.
1.3.1.Кукуруза
Кукурузу (зерно) убирают
с влажностью 25-30% и высушивают до влажности
10-14%. Сухое вещество кукурузного зерна
состоит на 76-78% из углеводов, на 9-12% из
белка и 45% из масла, а также из небольшого
количества сырой клетчатки и минеральных
веществ. Масло содержится в зародыше
зерна. Поскольку следует помнить о вредном
влиянии масла на пену, у кукурузы перед
переработкой удаляют зародыши, практически
исключая тем самым масло. Такая кукуруза
содержит еще около 1% масла (при допустимом
его количестве в 1,5%). Содержание белка
при переработке на крупу и хлопья понижают
до 7-9%. Этот белок в основном остается
в процессе затирания нерастворенным,
так что с содержанием белка, несколько
меньшим в кукурузе, следует считаться,
и это может особенно сказаться на снабжении
дрожжей низкомолекулярными соединениями
азота.
Кукурузный крахмал по внешнему виду примерно соответствует крахмалу ячменя. Температура клейстеризации кукурузного крахмала составляет 60-70 °С, и поэтому особых проблем при его переработке ожидать не следует. Содержание экстракта в кукурузе без зародышей составляет 88-90% на АСВ (= 7778% на ВСЕ), то есть приблизительно такое же, как у солода.
Перед переработкой кукурузу в сухом
состоянии освобождают от зародышей,
причем зародыши вместе с шелухой
удаляются с помощью плоского
вибросита, подключенного к системе
аспирации. Кукурузу можно перерабатывать
в следующие продукты:
- кукурузную крупку;
- кукурузные хлопья;
- рафинированную крупу;
- кукурузньй сироп.
1.3.2.Кукурузная крупка
Эта крупка характеризуется
относительно крупным размером частиц
(0,3-1,5 мм). Размельчение может проводиться
на мельнице для несоложеного сырья непосредственно
на пивоваренном предприятии. Кукурузную
крупку предварительно обрабатывают в
заторном котле для разваривания несоложеного
сырья приблизительно с одной четвертой
частью солодового затора.
1.3.3.Кукурузные хлопья
Легко увлажняемую крупку
раскатывают на вальцах в плоские хлопья
и при этом клейстеризуют. В таком виде
хлопья можно затирать без предварительного
растворения.
1.3.4.Рафинированная крупка
Крупка замачивается в течение
30-40 часов в теплой воде при 50 °С; при этом
вода обрабатывается SO2, чтобы подавить
развитие микроорганизмов. Зерна дробятся
в мельнице, а зародыши удаляются в разделительном
устройстве. После этого крахмал отделяют
от мягких оболочек и белка путем сепарации,
а сырой крахмал перед сушкой многократно
промывают. Этот процесс осуществляют
на специальных установках вне пивоваренного
предприятия. Частицы полученного кукурузного
крахмала очень мелкие (средняя величина
частиц примерно 0,2 мм). Эта рафинированная
крупка доставляется на пивоваренное
предприятие в специальных автомашинах.
Из-за малых размеров частиц возникает
опасность взрыва пыли. Рафинированная
крупка состоит из чистого кукурузного
крахмала, очень легко клейстеризуется
и может хорошо разжижаться.
1.3.5.Кукурузный сироп
Изготовляется из невысушенной
рафинированной крупки. Крахмал с помощью
гидролиза расщепляется до Сахаров. Состав
кукурузного сиропа может меняться в довольно
широких пределах. Его определяют по декстрозному
эквиваленту (ДЭ) - содержанию редуцирующих
Сахаров. Поэтому осахаренный сироп с
95 ДЭ содержит практически только глюкозу.
1.3.6.Рис
Для производства пива
применяют рисовую сечку, то есть раздробленные
зерна, получаемые при обмолоте и полировке
риса, но потерявшие при этом только внешний
вид. Зерно риса имеет влажность около
12-13%. Сухое вещество риса состоит на 85-90%
из крахмала, на 5-8% из белка, на 0,2-0,4% из
масла и небольшого количества минеральных
веществ. Рис обладает высокой крахмалистостью.
Крахмал риса состоит из отдельных ассоциированных
зерен своеобразной формат. Рисовый крахмал
очень сильно набухает и клейстеризуется
при температуре 70-85 °С. При этом определенные
сорта и виды риса из районов с жарким
климатом склонны к повышенным температурам
клейстеризации (80-85 °С), что следует обязательно
учитывать при переработке риса.
Небольшое количество белка, имеющееся в рисе, при последующем затирании плохо растворяется, так что необходимый для дрожжей свободный аминный азот (FAN) должен добавляться из солодового затора. Таким образом, рис - либо размалывают непосредственно на пивоваренном заводе в крупку, либо используют готовую рисовую крупку и вместе с частью солодового затора предварительно разваривают в заторном котле для несоложенного сырья, или перерабатывают в рисовые хлопья; при этом он клейстеризуется и без дальнейшей предварительной подготовки добавляется в заторный чан.
1.3.7.Ячмень
Ферменты солода могут
без проблем осахаривать 15-20% ячменя в
виде несоложеного сырья. Ячмень может
дополнительно перерабатываться в форме:
дробленого ячменя; хлопьев ячменя, очищенного
или не очищенного от мякинной оболочки.
Более низкая по сравнению с солодом стоимость
ячменя входит в противоречие с более
низким выходом экстракта. При его переработке
проблемы могут возникнуть из-за того,
что Р-глюкан в связи с отсутствием стадии
солодоращения еще недостаточно растворился
и, соответственно, при затирании будет
недостаточно расщепляться. В связи с
этим можно ожидать проблем при фильтровании
пива.
1.3.8.Ячменный сироп
Ячменный сироп можно производить
непосредственно на пивоваренном предприятии,
где ячмень измельчается и расщепляется
добавленными ферментами при обычной
температуре затирания. При этом образуются
не только мальтоза и декстрины, но происходят
и другие процессы распада (расщепление
белков, Р-глюкана и т. д.), как при затирании,
так что в результате получают похожий
на затор сироп, который нужно сгустить
и применять как добавку.
1.3.9.Сорго
Крупное зерно сорго — это
вид зерновых продуктов, получаемых при
выращивании этих растений в сравнительно
жарких и засушливых регионах Африки.
В противоположность крупному мелкозерновое
просо (Millet-nirsen) возделывают и в Европе
(птичий корм). Для производства пива используют
обычно только крупнозерновое сорго, которое
имеет различные сорта с типами сопретий
«початок» и «метелка», возделываемые
главным образом в качестве продукта питания.
Естественно, что во многих африканских странах все больше стремятся использовать в качестве источника экстракта для пивоварения местное сырье (сорго) и, кроме того, стараются произвести из него солод, чтобы таким образом сэкономить на дорогом импорте. Помимо этого, его климатические условия во многих странах Африки не позволяют выращивать пивоваренный ячмень. Так как сорго прорастает, то у него, естественно, развивается и ферментный потенциал, с помощью которого можно расщеплять компоненты зерна. Этот потенциал у сорго, однако, все же меньше, чем у ячменя. Возделывание сорго, а также его уборку осуществляют в сезон дождей, поэтому приходится считаться с сильным заражением его микроорганизмами, особенно плесневыми грибами. Чтобы исключить порчу, убранный урожай необходимо специально обрабатывать.
1.3.10.Пшеница
Пшеница редко перерабатывается
как несоложеное сырьё, но часто применяется
в виде солода, например, для производства
пива верхового брожения типа Hefeweizen, Weibier
и др. Благодаря высокой экстрактивности
доля пшеничного солода при производстве
пшеничного пива находится в пределах
50-60%. В качестве пивоваренных используются
только некоторые сорта пшеницы, причем
большим спросом пользуются озимые сорта
из-за более низкого содержания белка
и повышенного содержания экстракта, а
также как дающие более светлое пиво.
Для пшеничного белка характерна клейковина. Под этим названием понимают смесь различных белковых субстанций, составляющих около 80% общего белка. В клейковине содержатся прежде всего глютелин и глиадин (вместо гордеина ячменя). Глютеном называют клейкую, тянущуюся массу, поставленную и вымешанную из пшеничной муки с водой, которая при высушивании становится роговидной. Для пивоваренных целей нежелательно подвергать солодоращению высокобелковистую пшеницу, так как она плохо поддается переработке.
1.3.11Сахарный колер
Сахарный колер применяют
для окрашивания темного пива верхового
брожения. Колер получают путем сильного
нагревания глюкозного сиропа с низким
содержанием декстринов в щелочной среде;
при этом образуются тёмные, водорастворимые
продукты перегруппировки, обладающие
сильной красящей способностью (18 000 единиц
по ЕВС). Путем их разведения и получают
сахарный колер. Колер можно добавлять
в сусло или в пиво в том случае, если он
биологически безупречен и не приводит
к помутнению пива. С его помощью, так же
как с помощью красящего пива (Farbebier) можно
без проблем регулировать цветность пива.
Согласно немецкому Закону о чистоте пивоварения
применять сахарный колер для производства
пива запрещено, и вместо него применяют
специальный продукт — красящее пиво.
1.3.12.Сахар
Если пиво выпускается не
в соответствии с немецким законом о чистоте
пивоварения, то для подслащения напитка
возможно применение сахара (сахарозы)
в форме неотбеленого кристаллического
сахара. Из всех свойств сахара прежде
всего интерес представляет его растворимость,
которая в воде очень велика. При 20 °С в
100 частях воды растворяется 204 части сахара.
Концентрированный раствор сахара в воде
называют сиропом, и для его получения
сахар растворяют в воде. При температуре
15-20 °С в раствор переходит от 66,3 до 67,1%
сахара. Сахарный сироп изготовляется
как минимум 65%-ным - тогда он хорошо хранится
и не подвержен воздействию микроорганизмов,
так как последние в высококонцентрированном
растворе плазмолизируются. Чаще сахар
растворяют в холодной воде, но иногда -
и в горячей.
Для производства пива, приготавливаемого без соблюдения немецкого Закона о чистоте пивоварения, сахар можно добавлять в готовое сусло в целях повышения содержания сбраживаемого экстракта. В небольших количествах добавка сахара не влияет неблагоприятно на вкус пива; однако следует учитывать, что в сахаре не содержится продуктов распада белков, и поэтому содержание аминного азота в сусле может оказаться недостаточным, что может привести к затруднениям при брожении. Использование сахара как «поставщика» экстракта имеет смысл лишь в тех редких случаях, когда имеется источник дешевого сахара - ведь экстракт из зерна, как правило, намного дешевле.
1.3.14.Карамелизированный пивоваренный
сахар
Путем плавления сахара
или нагрева сахарного сиропа получают
коричневато окрашенный продукт с типичным
карамельным вкусом. Этот процесс можно
в зависимости от рН направлять либо преимущественно
в сторону образования красящих веществ
(например, колер), либо больше в сторону
образования ароматических веществ. Если
сахарозный сироп нагревается в буферном
растворе, то получается особенно много
ароматических веществ (дигидрофураионов,
циклонентенолонов и др.), что представляется
особо желательным для карамелизованного
пивоваренного сахара. Карамелизованный
пивоваренный сахар поступает в продажу
в виде сахарного сиропа или в виде твердого
сахара, имеющего коричневый цвет.[5]
1.4.1.Ферментные препараты
Используют при применении более 20 % несоложеного сырья в количестве от 0,001 до 0,075 % к массе перерабатываемого сырья.
Применяют амилолитические (Амилосубтилин Г10х, Амилоризин Пх и др.), протеолитические (Протосубтилин Г10х), цитолитические (Цитороземин П10х, Целлоконингин П10х и др.) ферментные препараты, а также их смеси в виде мультиэнзимных композиций.
Амилолитические препараты применяют при затирании при повышенном количестве несоложеного сырья и низком качестве исходного сусла. Они существенно повышают выход экстракта и улучшают качество сусла.
Протосубтилин Г10х используют при повышенных количествах несоложеного сырья и для улучшения качества сусла из некачественных солодов, а также для ликвидации коллоидных помутнений в пиве. Цитолитические препараты повышают выход экстракта за счет гидролиза некрахмальных полисахаридов, в основном гемицеллюлозы. Одновременно повышаются качество сусла и стойкость пива.
1.4.2.Источники получения амилаз.
Амилазы очень широко распространены в природе. Они синтезируются многими микроорганизмами (бактерии, грибы, актиномицеты, дрожжи), животными и растениями. До развития ферментной промышленности главным промышленным источником получения амилаз в европейских странах было проросшее зерно (солод). Для медицинских целей амилазы получали из животного сырья. В настоящее время главным источником амилаз являются микроорганизмы, особенно бактерии, грибы и реже дрожжи.[3]
1.4.3.Механизм действия и состав амилаз.
Субстратами для действия амилаз являются крахмал, состоящий из амилозы и амилопектина, продукты частичного гидролиза крахмала и гликоген.
Крахмал - растительный полисахарид с очень сложным строением. Это двухкомпонентное соединение, состоящее из 13-30% амилозы и 70-85% амилопектина. Оба компонента неоднородны, их молекулярная масса (М. м.) колеблется в широких пределах и зависит от природы крахмала. Амилоза - это неветвящийся полимер, в котором остатки глюкозы соединены a-1, 4-гликозидной связью; степень полимеризации около 2000. В «аномальных» амилозах с одной-двумя a-1, 6-связями полимеризация может возрасти до 6000 (рис.1). Амилоза практически не обладает восстанавливающей способностью, так как в каждой молекуле амилозы имеется только одна свободная альдегидная группа.
Молекула амилозы представляет собой растянутую спираль, шаг которой составляет 10,6 А и в каждый виток входит 3 остатка глюкозы.[3]
Рис 1. Строение амилозы:
а — амилоза без аномальных отклонений; б - схема возможных ветвлений амилозы; в — спираль амилозы в растворе с заключенными в ее полость молекулами йода.
Концевые звенья с альдегидными группами 1 разветвление, - 2 разветвления, 4 разветвления, 8 разветвлений
16 концевых звеньев 64 концевых звена
Рис. 2.2. Амилопектин, схема дихотомического деления амилопектина (по К. Мейеру):
а - в плоскости; б - в пространстве.
Максимальная длина молекулы амилозы достигает 7000 А. В растворе спираль сжимается за счет увеличения витка, в котором уже участвует 6 остатков глюкозы. При вхождении молекул йода в спираль амилозы возникает характерный синий цвет. Строго говорить о величине молекулы амилозы нельзя, т. е. даже из одного образца крахмала извлекается амилоза, с величиной молекулы от 500 до 2000 остатков глюкозы. Амилопектин имеет большую молекулярную массу, чем амилоза, и более сложное строение. Это ветвящийся полисахарид. Предполагается, амилопектин ветвится дихотомически, т. е. число концевых звеньев всегда на единицу больше числа звеньев, дающих ветвление, а сумма этих чисел дает общее число звеньев по всей цепи (см. рис. 2.2).
Механизм действия. К группе амилотических ферментов относятся a- и b-амилазы, глюкоамилаза, пуллуланаза, изоамилаза и некоторые другие ферменты. Амилазы бывают двух типов: эндо- и экзоамилазы. Четко выраженной эндоамилазой является а-амилаза, способная к разрыву внутримолекулярных связей в высокополимерных цепях субстрата.
Глюкоамилаза и b-амилаза являются экзоамилазами, т. е. ферментами, атакующими субстрат с нередуцирующего конца.
При изучении механизма действия амилаз имеются определенные сложности, и прежде всего они заключаются в том, что субстрат - крахмал неоднороден и имеет различные характеристики по степени полимеризации гликозидной цепи и количеству ветвлений.
Реакции, катализируемые амилазами, имеют две стадии: короткую -предстационарную и длительную - стационарную. Во время первой стадии эндоамилаза быстро уменьшает молекулярную массу субстрата, образуя смесь линейных и разветвленных олигосахаридов. Второй этап реакции продолжается, пока продукты гидролиза не перестанут окрашиваться йодом; он протекает значительно медленнее и зависит от индивидуальных свойств фермента и его природы. Поэтому конечные продукты гидролиза а-амилазами могут быть различными. Первая стадия воздействия фермента на субстрат хотя и носит неупорядоченный характер, имеет для всех видов a-амилаз схожий механизм.
Существует две гипотезы о механизме действия экзоамилаз на субстрат. Первая гипотеза предполагает, что, воздействуя на субстрат по одноцепочечному или «молниеобразному» механизму, экзоамилаза образует фермент-субстратный комплекс с захватом нередуцирующего конца цепи.
Дальнейшее продвижение фермента по этой цепи происходит до полного ее гидролиза. По второй гипотезе (b- и глюкоамилаза действуют на субстрат путем механизма множественной атаки, т. е. фермент образует комплекс с молекулой субстрата, затем через несколько этапов этот комплекс распадается и фермент связывается с новой молекулой субстрата. Иными словами, при множественной атаке происходит нечто среднее между неупорядоченным механизмом и одноцепочечной, «молниеобразной» атакой. Для полного гидролиза по этому механизму одна молекула субстрата должна образовывать много раз фермент-субстратные комплексы. При этом возможен гидролиз нескольких связей в одном каталитическом акте.
Механизм воздействия амилаз на субстрат может быть рассмотрен с нескольких позиций:
- вид разрываемой связи (a-1,4 или a-1,6);
- тип воздействия на субстрат (эндо- или экзо-);
- влияние на скорость гидролиза степени полимеризации субстрата;
4) возможность гидролиза
- способность фермента к множественной атаке субстрата.
Наличие признаков амилаз, отраженных в 3 и 4 позициях, при действии на линейные субстраты может свидетельствовать о существовании у этих ферментов подцентровой структуры. Вероятно, активный центр амилазы может состоять из нескольких подцентров, каждый из которых может вступать в контакты с глюкозным остатком. Энергия взаимодействия (А), выраженная в единицах свободной энергии (кДж/моль), определяет подцентровое сродство фермента к субстрату. Это сродство индивидуально и может быть как положительным, так и отрицательным. Вероятность существования подцентровых структур амилаз помогает установить строение активного центра амилаз, дает более четкое объяснение субстратной специфичности, но не дает объяснений механизма гидролиза разветвленных субстратов.
a-Амилаза. а-Амилаза (а-1,4-глюкан-4-
а-Амилаза - водорастворимый белок, обладающий свойствами глобулина и имеющий М. м. 45 000-60 000. Своего рода исключением является a-амилаза В. macerans, которая имеет М. м. 130 000. Есть указания, что некоторые термостабильные a-амилазы имеют М. м. 14 000-15 000, но в их молекулах содержится в 2-3 раза больше атомов кальция.
Все а-амилазы относятся к металлоэнзимам, содержание в них Са колеблется от 1 до 30 г атом на 1 гмоль фермента. Полное удаление кальция приводит к инактивации фермента. Повторное введение кальция в среду может частично восстановить его активность. a-Амилаза В. subtilis с помощью иона цинка способна образовывать димерную форму, чего лишены другие a-амилазы. Все a-амилазы устойчивы к воздействию протеаз. Они богаты тирозином и триптофаном. Глютаминовая и аспарагиновая кислоты составляют 25% массы белка. Наличие этих кислот в а-амилазе связывают с их оса-харивающей способностью. Так, разжижающие a-амилазы не имеют сульфгидрильных групп, а осахаривающие содержат один остаток цистеина. Сравнительно мало или совсем отсутствуют в а-амилазах содержащие серу аминокислоты. Некоторые a-амилазы грибного происхождения имеют углеводный фрагмент, в состав которого могут входить манноза, ксилоза, гексозоамин, но функции его не установлены.
В зависимости от вида микроорганизма свойства ос-амилаз могут сильно отличаться не только по механизму воздействия на субстрат и конечным продуктам, но и по оптимальным условиям для проявления максимальной активности.
Действуя на целое крахмальное зерно, a-амилаза атакует его, разрыхляя поверхность и образуя каналы и бороздки, т.е. как бы раскалывает зерно на части. Клейстеризованный крахмал гидролизуется ею с образованием на окрашиваемые йодом продукты - в основном состоящие из низкомолекулярных декстринов. Процесс гидролиза крахмала многостадийный. В результате воздействия a-амилазы на первых стадиях процесса в гидролизате накапливаются декстрины, затем появляются неокрашивающиеся йодом тетра- и тримальтоза, которые очень медленно гидролизуются a-амилазой до ди- и моносахаридов.
Все a-амилазы проявляют наименьшее сродство к гидролизу концевых связей в субстрате. Некоторые же а-амилазы, особенно грибного происхождения, на второй стадии процесса гидролизуют субстрат более глубоко с образованием небольшого количества мальтозы и глюкозы.
b-Амилаза. b-Амилаза (a-1,4-глюкан мальтогидролаза, КФ 3.2.1.2) - активный белок, обладающий свойствами альбумина. Каталитический центр фермента содержит сульфгидрильные и карбоксильные группы и имидозольный цикл остатков гистидина. b-Амилаза -экзофермент концевого действия, проявляющий сродство к предпоследней b-1,4-связи с нередуцирующего конца линейного участка амилозы и амилопектина.
В отличие от a-амилазы b-амилаза практически не гидролизует нативный крахмал, тогда как клейстеризованный крахмал гидролизуется ею с образованием мальтозы b-конфигурации, поэтому данная амилаза по аналогии с a-амилазой называется b-амилазой. Если гидролизу подвергается амилоза, то гидролиз идет полностью до мальтозы. Незначительное количество декстринов может образовываться при гидролизе «аномальных»амилоз, так как гидролиз b-амилазой идет только по линейной цепи до a-1,6-связей. Если субстратом для b-амилазы служит амилопектин, то гидролиз идет в значительно меньшей степени. b-Амилаза отщепляет фрагмент с нередуцирующего конца участка от внешних линейных ветвей, имеющих по 20-26 глюкозных остатков, с образованием 10—12 молекул мальтозы. Гидролиз приостанавливается на предпоследней a-1,4-связи, граничащей с a-1,6-связью. В гидролизате накапливается 54-58% мальтозы, остальное составляют высокомолекулярные декстрины, содержащие значительное количество а-1,6-связей - так называемые b-декстрины. Действие b-амилазы на крахмал можно записать в виде следующей схемы:
b-Амилаза
Крахмал,----------------> Мальтоза + р-Декстрин
гликоген (54-58%) (42-46%)
b-Амилазы проявляют большую стабильность в отсутствие ионов Са2+. Молекулярная масса b-амилазы растений достаточно высока, она составляет от 50 000 до 200 000. Фермент может состоять из одной или четырех субъединиц до 50 000 каждая. Фермент содержит SH-группы и чувствителен к действию тяжелых металлов. Считается, что b-амилаза обладает высокой способностью к множественной атаке субстрата. Для амилозы средней молекулярной массы в одном присоединении фермента к субстрату возможно отщепление до четырех остатков мальтозы. При увеличении молекулярной массы субстрата возможно и большее количество мест атаки.
Глюкоамилаза. Глюкоамилаза (а-1,4-глюкан глюкогидролаза, КФ 3.2.1.3.) широко распространена в природе. Она синтезируется многими микроорганизмами и образуется в животных тканях, особенно в печени, почках, плаценте кишечника и т. д. Фермент в литературе известен под различными названиями: амилоглюкозидаза, g-амилаза, лизосомальная a-глюкозидаза, кислая мальтаза, матулаза и экзо-1,4-a-глюкозидаза. Глюкоамилаза катализирует последовательное отщепление концевых остатков a-D-глюкозы с нередуцирующих концов субстрата. Это фермент с экзогенным механизмом воздействия на субстрат. Многие глюкоамилазы обладают способностью так же быстро, как и a-1,4-связь, гидролизовать a-1,6-глюкозидные связи. Но это происходит только в том случае, когда за a-1,6-связью следует a-1,4-связь, поэтому декстран ими не гидролизуется. Отличительной особенностью глюкоамилаз является способность в десятки раз быстрее гидролизовать высокополимеризованный субстрат, чем олиго-и дисахариды.
В литературе высказывается мнение, что механизм атаки субстрата глюкоамилазой может быть двух типов: либо одно-цепочечный, либо множественной атаки, и что активный центр имеет под-центровую структуру.
Почти все глюкоамилазы являются гликопротеидами, содержащими от 5 до 35% углеводов, которые состоят из олиго-, ди- и моносахаридов. Углеводный компонент может быть целостным фрагментом или же разбитым на индивидуальные соединения, которые прикрепляются к белку через треонин и серин. Например, у глюкоамилазы A. niger их 20. Большинство известных глюкоамилаз имеет оптимум рН при 4,5-5,2, реже - при 5,7-6,0, в основном для дрожжевых глюкоамилаз.
РН-стабильность микробных глюкоамилаз лежит в широком диапазоне -от 2,5 до 9. Термостабильность глюкоамилаз лежит в интервале от 30 до 45°С и редко повышается до 55-60°С. Глюкоамилазы различного происхождения заметно отличаются по молекулярной массе, которая, по данным различных авторов, имеет значения от 48 000 до 210 000. Следует заметить, что далеко не все микробные глюкоамилазы способы полностью гидролизовать крахмал до глюкозы. Еще в 60-х годах И.Фукумото предложил все микробные глюкоамилазы разделить на два типа:
