Создания систем контролируемой доставки лекарственных средств в виде микрочастиц на основе ПГА

Федеральное государственное образовательное учреждение 
высшего профессионального образования

«СИБИРСКИЙ  ФЕДЕРАЛЬНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ» 

Институт  фундаментальной биологии и биотехнологии 

Кафедра медецинской  биологии 
 
 
 
 

Курсовая  работа

Институт  биофизики СО РАН 

Создания  систем контролируемой доставки лекарственных  средств в виде микрочастиц на основе ПГА 
 
 

Преподаватель                      __________                  Е.И. Шишацкая 

Студент          ББ09 – 02Б      __________                  Д.А. Шуклина

Красноярск 2012

Содержание

Список сокращений                                                                      3

Введение                                                                                        4                                                               

Глава 1. Обзор литературы                                                        6

1.1 Амфифильные  полимеры                                         6

1.2 Полимерные наночастицы                                       6

1.3 PCL – биодеградируемый полимер                       11

1.4 Трансдермальные  системы доставки                   11 

Глава 2. Объект исследования                                                   13

2.1 Материалы и оборудование                                                13

2.1.1 Материалы                                                                            13

2.1.2 Оборудование                                                                      13

2.2 Методы исследования                                                          13

Глава 3. Результаты исследования и их обсуждение          14

3.1 для ПГБ                                                                                      14

3.2 для ПГВ                                                                                      15

Выводы                                                                                            17

Список литературы                                                                       18 
 
 
 
 
 
 
 

Список  сокращений

ТТС – трансдермальные  терапевтические системы

ПГА – полигидроксиалканоат

ПАВ – поверхностно – активные вещества

БАВ – биологически активные вещества

ПН – полимерные наночастицы

PCL -  Поликапролактон

ПГБ – поли-3-гидроксибутират

ПГВ – 3-гидроксивалерат

ПВС – поливиниловый  спирт 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

   Введение

   Из истории  фармакологии известно, что на первых этапах ее развития, вплоть до XX века, лекарственным  формам придавалось отнюдь не первостепенное значение при поиске новых препаратов. Главным было лекарственное вещество – действующее начало, от которого и зависела активность препарата. Постепенно выяснялось, что это не так. Некоторые лекарственные вещества, активные в форме ингаляций, не действуют при пероральном приеме. Другие лекарственные вещества, активные парэнтерально, в значительной мере разрушаются в кислой среде желудка. Лекарственные формы должны использоваться в первую очередь для создания оптимальных условий действия лекарственных веществ. Принципиальные изменения произошли в последней трети XX века, когда А. Дзаффарони была разработана концепция технологии контролируемого высвобождения действующего начала из лекарственной формы. Наиболее удачными и популярными лекарственными формами с ТКВ оказались трансдермальные терапевтические системы.

   Трансдермальные терапевтические системы (TTC) предназначены  для введения с постоянной скоростью  лекарственной субстанции в системное  кровообращение через неповрежденную кожу в течение определенного  времени (от нескольких часов до нескольких суток). Дозы, используемые в трансдермальных  системах, значительно ниже, чем  при пероральном приеме этого  же лекарственного вещества (J1B), за счет высокой биодоступности трансдермалыюй доставки JIB, обусловленной тем, что JIB поступает в кровоток, минуя  желудочно-кишечный тракт (отсутствие эффекта первого прохождения  через печень). Кроме того, преимуществами TTC являются: простота и удобство применения, возможность амбулаторного использования, уменьшение кратности приема, исключение ряда побочных реакций.

   Конструирование систем для депонирования и конролируемой  доставки лекарственных препаратов является перспективным и востребованным направлением в современной фармакологии.  Такие системы применяются для  лечения онкологических заболеваний  и воспалительных процессов.  Антибиотики,  депонированные в полимерный матрикс, высвобождаются в нужных дозах и в течение требуемого промежутка времени.  Полигидроксиалканоат–  наиболее перспективный материал для создания систем контролируемой доставки лекарственных средств в виде микрочастиц. Этот материал совершенно безвреден для организма,  имеет необходимые физико-химические и биологические свойства, биодеградирует, и при этом не образует токсичных продуктов. 

   Целью настоящей работы было получение микрочастиц на основе ПГА.

   Для этого  нужно было выполнить следующие  задачи:

1. Изучение литературы по получению микрочастиц.
2. Создание микрочастиц на основе ПГБ и ПГБВ.
3. Исследование размера и z – потенциала микрочастиц.

   Глава 1. Обзор литературы

1. Амфифильные полимеры

      Амфифильные  полимеры актуальны в современной  фармокологии, так как они способны  формировать самоорганизующиеся  наноструктуры за счет наличия  в их цепи гидрофобных и  гидрофильных фрагментов. Строение  амфифильных полимеров дифильное.  Примеры – это различные блок  сополимеры (полиэтиленгликоль, полилактид, полипропиленоксид и т.д).

   В растворах  амфифильные полимеры  имеют различное  поведение, которое зависит от строения их блоков и термодинамических качеств  растворителя по отношению к составляющим сополимер блокам.

         Для того,  чтобы образовывались  комплексы полимер – поверхностно  – активные вещества нужны  такие факторы, как  уменьшение  площади контакта с водной  фазой гидрофобных фрагментов  полимерных цепей, и первых 3-4 углеродных атомов алифатических  радикалов ПАВ, 

   примыкающих к ионогенной группе. Также, образующиеся

   комплексы могут быть дополнительно стабилизированы  ион – дипольными взаимодействиями ионогенных групп ПАВ и гидрофильных фрагментов полимерных цепей, и, что немало важно, полимер должен обладать достаточной гибкостью.

   Взаимодействие  амфифильного полимера с белком может  произойти в результате электростатического  взаимодействия между глобулами  белка и макроионами синтетического амфифила, образования водородных связей и при гидрофобных взаимодействиях.

   Благодаря своим физико-химическим свойствам,  амфифильные сополимеры привлекают внимание многих ученых, вследствие чего, идет возрастание их применения в  пищевой, косметической и фармакологической  промышленности. 

4. Полимерные наночастицы

    В обществе  росло беспокойство по поводу  опасности нанотехнологий, а именно  вреда наночастиц. Предполагается, что они могут проникать в  тело, благодаря своим маленьким  размерам, что и позволяет им  проходить через многие биологические  барьеры. Это и стало следствием  подозрения всех типов наночастиц  во влиянии их на здоровье. Сбор данных с целью оценки риска наночастиц становится обязательным для установления правил, которые опираются  на научную основу.(7).

   Наноматериалы присутствуют в  некоторых солнцезащитных кремах, зубных пастах,  покрытиях  посуды и даже продуктов  питания. Кожа человека, желудочно-кишечный тракт и легкие, всегда находятся в прямом

   контакте  с окружающей средой.

   Частицы в  диапазоне нано – размеров могут  войти в организм человека через  легкие и кишечник, через кожу это  проникновение более затруднено (8).

    Косметическая  продукция также должна проходить  исследования для того, чтобы  убедиться в том, что частицы  не проникают в кожу глубже.

   Частицы разделяются  на:

   • наночастиц: от 1 до 100 нм

   • субмикронных частиц: от 100 нм до 1 мкм

   • микрочастиц: от 1 мкм до 1 мм

         Микросферы и микрокапсулы являются  перспективными системами доставки. Микрочастицы могут использоваться  в качестве систем доставки  лекарственных средств; профилем  высвобождения можно управлять  довольно легко; они могут быть  введены в кровоток, подкожно,

   и внутримышечно  и адаптированы для приема внутрь или

   ингаляции. ПГА может быть использован для  изготовления

   различных изделий для медицины: хирургии, трансплантологии, тканевой

   техники и  фармакологии. Одной из основных

   задач, являлось  доказать, что они абсолютно биосовместимы  и

   безвредны для организма-хозяина.(10) 

   От размера  наночастиц зависит их проникновение  через кожу.  Частицы до 3 мкм  в диаметре могут

   проникать через роговой слой; частицы от 3 ​​до 10 мкм

   накапливаются преимущественно в сальных фолликулах;

   и частиц более 10 мкм не проникают через кожу (они, возможно, остаются присоединенными  к кожной поверхности в случае пленкообразующей способности). 

    (ПН) – это коллоидные образования, размером от 10 до 1000 нм. В зависимости от агрегатного состояния, особенностей и способов образования их разделяют на группы ( нанокапсулы, наносферы, нанокристаллы, липосомы и полимерные мицеллы).

   Из амфифильных  полимеров полимерные наночастицы  получаются тремя способами:

• Метод прямого растворения ( диспергирование ).
• Диализ
• Эмульсионный метод ( нанопреципитация ).

   Существует два подхода при включении биологически активных веществ в наночастицы – получение наночастиц в присутствии лекарственного препарата и включение БАВ в уже приготовленные заранее частицы. Все типы ПН доставки БАВ имеют хорошие показатели по проникновению внутрь тела и длительный срок годности.

   На поведение  полимера – носителя БАВ влияют три фактора: биодеградируемость, физико – химические свойства и биосовместимость.

   Существует  ряд требований к полимерным системам доставки БАВ : состав полимерных систем доставки (гидрофильность, заряд частиц), размер полимерных систем доставки ( с  уменьшением появляется ряд преимуществ), скорость выхода БАВ (зависит от концентрации

   полимера  в исходной смеси и массового  соотношения между активным веществом  и полимером).

   Наиболее  распространенным компонентом диблок и триблок амфифильных сополимеров  является полиэтилен оксид. Анализ литературы позволяет говорить об успешном включении  лекарственных препаратов в ПН на основе диблок сополимеров.

   Основные  способы введения – это внутривенное и пероральное. При внутривенном введении: проницаемость сосудов  уменьшается с

   увеличением размера наночастиц до тех пор, пока ПН не достигнут критического размера 20 нм.

   (3) . Из внутренних органов основной мишенью являются печень, селезенка, почки.

   В современной  фармакологии разработка систем доставки лекарственных средств быстро развивается  и является перспективным направлением. Полигидроксиалканоаты перспективны в медицине и для конструирования лекарственных систем длительного действия. Разработаны в институте биофизики формы в виде пленок, таблетированных форм и микрочастиц; изучена реакция тканей на внутримышечное введение микрочатиц из ПГА; показана пригодность матриксов для депонирования противоопухолевых препаратов на примере рубомицина гидрохлорида.          

   Рубомицин является эффективным противоопухолевым  препаратом, который широко используется в химиотерапии. При взаимодействии с тканями вызывают некрозы, поэтому  используется при внутривенном введении. Создание долговременных систем пролонгированной доставки препаратов рубомицина, их разработки, в настоящее время является развивающимся  направлением в фармакологии. (11)

    Исследования показали возможность использования разработанных полимерных микрочастиц из полигидроксибутирата для внутривенного введения. И вообще, полигидроксибутират состоятелен для долговременной доставки лекарственных препаратов в ткани внутренних органов через внутривенное введение.

   Пероральное введение используется в основном при  заболеваниях пищеварительного тракта. До 80 % лекарств употребляется именно этим способом, но некоторые вещества плохо адсорбируются или же растворяются в желудочно – кишечном тракте, поэтому и используются ПН.

   Полимерные  наночастицы  в качестве систем доставки БАВ применяются в различных  областях. Например в противораковой химиотерапии наблюдаются положительные  результаты. (Внутривенное введение полибутилцианоакрилатных наночастиц в концентрации 100-400 мг/кг не приводит к гибели экспериментальных  животных, а введение наночастиц с  включенным доксорубицином (1,5-3 мг/мл) приводит к уменьшению раковой опухоли мозга у крыс (с)). Доставка белковых молекул используется в основном для увеличения терапевтической эффективности и устойчивости белковых молекул, а также для их доставки по пути, который необходим организму в период лечения. При лечении грибковых и бактериальных инфекций также наблюдались положительные результаты (проводились эксперименты на мышах, лекарство ПН вводилось внутривенно при кандидозе). ПН применяется также в биомедицинской диагностике в качестве контрастирующих реагентов для электронной, радио-

   и магнитно-резонансной  томографии и других видов диагностических  исследований.

   Были разработаны  ПН доставки БАВ пригодные для транспорта в

   организм  на основе двух новых амфифильных  полимеров: декстран-поли-в-

   капролактона (Dex-PCL) и стеароил-поли-М-винилпирролидона (ПВП-стеар),

   изучены их  свойства и возможность практического применения. В качестве модельных БАВ для включения в ПН использовали  тамоксифен

   (плохорастворимое  противоопухолевое лекарственное  средство) и соевый

   ингибитор протеиназ (препарат белковой природы, обладающий

   противовоспалительным и антиканцерогенным действием).

   Поли-N-винилпирролидон применяется благодаря его таким свойствам, как безвредность, растворимость, склонность к комплексообразованию.

   Такие носители, как декстран являются полностью  биосовместимыми и биодеградируемыми, и из организма удаляются легко  после выполнения своей функции.  

   Тамоксифен  был применен в качестве плохорастворимого  средства для включения в наночастицы.

   Тамоксифен  тормозит развитие опухолевого заболевания, утилизируется в печени.

   Соевый  ингибитор протеиназ используется в качестве модельного белка для  включения в наночастицы. Применяется  благодаря своей стабильности и  широкому спектру своей ингибирующей деятельности.

1. Используется применение метода для оценки среднего размера частиц, так как благодаря электронной микроскопии было доказано, что наночастицы имеют сферическую форму.

   Наиболее  большой практический интерес представляет эмульсионный метод получения наночастиц ( используемый органический растворитель удается полностью удалить из системы).

   Метод ядерного магнитного резонса – новый подход в изучении организации наночастиц из амфифильных полимеров. Позволяет  легко получить данные, благодаря  которым можно получить информацию о структуре наночастиц в водном окружении, а также, отличается наглядностью и удобством оформления экспериментальных  данных.

   Метод получения наночастиц не влияет на структуру наночастиц, а определяет распределение частиц по размерам.

   Наночастицы обладают различными свойствами. Например устойчивость дисперсии наночастиц ,агрегативная устойчивость (способность  частиц не слипаться и сохранять  свой первоначальный размер), устойчивость к нагреванию (образование наночастиц происходит выше точки Крафта Т_к). амфифильные полимеры Dex-PCL и ПВП-стеар пригодны для создания полимерных частиц нанометровых размеров.

   Метод ферментативной деградации полимерных наночастиц является новым и мало изученным.

4. PCL – биодеградируемый полимер

   Поликапролактон (PCL) является биодеградируемым полимером. Гидролиз липазами, в основном осуществляется на границе раздела фаз масло – вода. Расщепление поликапролактона  зависит от таких факторов, как температура,  рh, наличие в системе двухвалентных ионов металлов.

   Белок, включенный в полимерные наночастицы, защищен  от факторов окружающей среды, протеолиза, а это значит, и от выведения  из организма.

   Исследования  показали, что такие амфифильные  полимеры как поли N – винилпирролидон, содержащий концевую стеароильную группу (ПВП – стеар) и декстран – поли – Ɛ – капролактон, n – процентное содержание цепей декстрана в сополимере (n = 10, 23, 33) (Dex – PCL) открывают перспективы для создания частиц нанометровых размеров, которые могут быть использованы как системы доставки БАВ.

   1.4 Трансдермальные  системы доставки

   (5)Трансдермальные  системы доставки включают в  себя широкий спектр неинвазивных  и малоинвазивных технологий  для доставки лекарственных препаратов  и вакцин через кожу без  иглы. Кожа является барьером  вокруг человеческого тела. Это  создает сложность для доставки  большого молекулярного веса  гидрофильных препаратов, таких  как белки и пептиды. Верхний  слой кожи роговой, состоящий  в основном из мертвых корнеоцитов,  встроенных в липидный слой. Молекулы, которые успешно пересекают роговой  слой, могут попадать в кровь  путем диффузии.

   Технологии, которые используют трансдермальные  устройства, могут быть разделены  на активные и пассивные методы, в зависимости от внешнего источника  энергии, использованного для улучшения  проникновения кожи.

   Существуют активные методы, такие как:

• жидкие форсинки струи
• порошок инжекторов
• микроиглы

     Существую работы по разработке наночастиц с помощью двух различных пропил-крахмал производных - называют ПС-1 и ПС-1.45 - с высокой степенью замещения: 1,05 и 1,45 соответственно. (4)

   В таких  работах не используются такие опасные  растворители, как дихлорметан или  диметилсульфоксид. Проводится оценка наночастиц на стабильность и применимость для лиофилизации. Была показана эффективность  трех препаратов – флуфенамовая кислота, кофеин и тестостерон. Ну и конечно  была протестирована возможность использования  этих наночастиц в качестве трансдермальных  систем доставки лекарственных средств.

   Вообще, ипользование полисахаридов в подготовке наночастиц, в последние годы возросло. Крахмал имеет интересные возможности, которые до сих пор относительно не исследованы. Он биосовместимый, биоразлагаемый и не токсичный полимер, и очень  часто встречается в природе (полисахарид  в высших растениях). Но только препятствием в создании наночастиц на основе крахмала является его гидрофильность. 

   Роговой слой кожи длительно время был сдерживающим фактором доставки лекарственных форм.  Индометацин, диаметром 100 нм и отрицательно заряженной поверхностью, используется для загрузки в наночастицы PLGA. Его проницаемость намного выше, чем простая диффузия  наночастиц через кожу. Эффективность использования ионофореза (введение лекарства через кожу и слизистые оболочки с помощью постоянного гальванического тока, вызывающего перемещение ионов.) на проницаемость наночастиц через кожу, оценивается на основе анализа концентрации IM в коже, мышцах и плазме крови, в естественных условиях. Совместное применение наночастиц и ионофореза дает дополнительные преимущества. Заряженные носители могут быть доставлены в кровь, что означает, что этот метод может быть использован для доставки лекарств через кожу. (6)

   Используются  различные лекарственные формы  для трансдермального пути введения. Ими являются препараты депо-нитроглицерина для приема внутрь, буккальные формы тринитролонгов (TRINITROLONG), ТТС с 5% лидокаином, пластырь (трансдермальная система с контактной поверхностью 5,10 или 20 кв.см и номинальным количеством высвобождаемого эстрадиола 25, 50 или 100 мкг в сутки, соответственно). (12) 

   Глава 2. Объект исследования

1. Материалы и оборудование
1. Материалы

   Полигидроксибутират (С₄Н₆О₂) – наиболее изученный и распространенный вид ПГА ; полигидроксивалерат (Включение гидроксивалерата в полигидроксибутират существенно влияет на кинетику кристаллизации материала, включая скорость процесса и размер образующихся сферолитов); поливиниловый спирт (ПВА); дихлорметан (хлористый метилен, ДХМ, CH₂Cl₂ ).

2. Оборудование

   Центрифуга (Centrifuge 5810 R); Центрифуга (Centrifuge 5417 R);

   Ультразвуковая  мешалка ( Sonicator 3000. Misonix); весы (Adventurer OHAUS); водяная баня (SkyLine TW – 2); анализатор частиц (Zetasizer Nano. Malvern) 

2. Методы  исследования

       Метод растворения: Брали навеску  ПГБ и ПГБВ (0,05 грамм) и добавляли 10 мл  растворителя (дихлорметана). Далее на водяной бани перемешивали до полного растворения полимеров. 

   Также брали 0,5 грамм поливинилового спирта (для  каждого полимера) и разбавляли в 100 мл воды. После этого растворяли его в микроволновой печи.

   Затем добавляли  полученный раствор в бюксы (в  раствор ПГБ и ПГБВ).

   После добавления, для того, чтобы смешать двухкомпонентную эмульсию, использовали ультразвук. Когда была получена однородная масса, оба бюкса были поставлены на сутки на магнитную мешалку до полного испарения растворителя.

   Метод осаждения: Через сутки, сняв бюксы с мешалки, начался процесс центрифугирования. Изначально осаждаем  на большой центрифуге оба полимера со скоростью 9000 оборотов, 10 минут. Далее, уже в эпиндорфках, начинаем осаждать на маленькой и промывать водой четыре раза со скоростью 110000 оборотов, 5 минут. После того, как мы промыли водой последний раз, оставляем сушиться.

   Метод динамического  рассеивания света: Итогом моей работы было измерение размера наночастиц и z – потенциала анализатором  частиц (Zetasizer Nano. Malvern). Динамическое рассеяние света используется в лазерной корреляционной спектроскопии для определения размеров частиц в суспензии. Размеры измеряемых частиц должны быть такого же порядка, что и длина волны рассеиваемого света. При прохождении пучка света через суспензию происходит его упругое (рэлеевское) рассеяние.

   Глава 3. Результаты исследования и их обсуждение

   3.1 результаты  для ПГБ

   Нас интересовали только средние значения z – потенциала. В случае ПГБ среднее значение равнялось -17 ± 0,473.

    Средний  размер частиц составил 674,2±34,17 нанометров. (н/м)

   Также шло  распределение в процентах в  зависимости от размера частиц. Эти  результаты показаны в таблице, и  также, их можно пронаблюдать на гистограмме.

   Таблица 1. Размер частиц и их процентное содержание для ПГБ.