Техніко-економічне обґрунтування виробництва лимонної кислоти

1. Техніко-економічне обґрунтування виробництва лимонної кислоти 

1.2 Актуальність  виробництва та основні виробники  лимонної  кислоти

Найпопулярнішим підкислювачем на сьогоднішній день є лимонна кислота, яка не тільки дозволяє надати продукту певний приємний кислий смак, але одночасно виступає як антиокислювач і синергист антиокислювачів. Фахівці стверджують, що, вона міститься принаймні в половині всіх харчових продуктів. Не випадково за обсягом виробництва лимонна кислота є одним з головних продуктів мікробного синтезу, і світовий обсяг її виробництва сягає 400 тис. тонн на рік, що в грошовому вираженні складає близько 325 млн євро.       Лимонна кислота (Е330) володіє найбільш м'яким і приємним смаком в порівнянні з іншими харчовими кислотами, завдяки чому знаходить саме широке застосування в харчовій промисловості. Головними її споживачами є виробники напоїв (газованих, негазованих безалкогольних та алкогольних, соків і нектарів; тут вона використовується як регулятор кислотності, а також з метою додання напоям приємного і освіжаючого смаку) і кондитерських виробів. Крім самої лимонної кислоти широкого поширення набули її солі (цитрати - це похідні вищих жирних кислот і лимонної кислоти). Цитрат натрію Е331, або лимоннокислий натрій, наприклад, відноситься до смакових речовинах і задіяний при виробництві плавлених сирів (як сіль-плавитель), згущеного молока і мармеладу, при виробництві дитячих сухих продуктів на молочній основі лимоннокислий натрій використовують як буферну сіль і як біоелемент. Істотною перевагою лимонної кислоти є можливість отримання її у твердому вигляді, а також відсутність подразнюючої дії на слизові оболонки дихального і травного тракту.

Таблиця. Орієнтовні дози внесення моногідрату лимонної кислоти в різні продукти

Таким чином  виробництво лимонної кислоти дуже актуально, так як вона використовується в майже всіх харчових продуктах, а також в парфумерії, в хімічній, текстильній, шкіряній, металургійній та інших галузях промисловості.

Про виробників лимонної кислоти

В Україні  найбільш великими виробниками лимонної кислоти є  ВАТ «Смілянський цукровий завод» .        Але основними учасниками виробництва лимонної кислоти є виробники з Китаю, які контролюють майже половину ринку, і ще близько 40% припадає на частку російської компанії ВАТ «Бєлгородський завод лимонної кислоти (Цітробел)», яка після розпаду СРСР залишилася практично єдиним виробником лимонної кислоти в Росії .    На відміну від російського «Цітробела», що забезпечує постачання продукції стабільно хорошої якості, продукція китайських виробників, яку вони готові запропонувати в обсягах практично необмежених, має якість дуже неоднорідну, але і ціни на цю продукцію варіються у великих межах: від дуже низьких до порівнянних з цінами українською лимонною кислотою. Фахівці відзначають, що за високими цінами, порівнянними з цінами на російську лимонну кислоту, пропонується продукція хорошої якості, вироблена на великих китайських підприємствах, аналогах «Цітробела». Але є цілий ряд китайських торгових фірм, які пропонують лимонну кислоту, вироблену на невеликих і дуже маленьких заводах, яких у Китаї існує безліч. Такі маленькі підприємства не можуть гарантувати гарну якість продукції. Торгові фірми скуповують у цих підприємств невеликі обсяги лимонної кислоти за дуже низькими цінами, формують великі партії і поставляють їх на російський ринок. Ціни на цю лимонну кислоту невисокі, але навіть у межах однієї партії якість продукту може бути неоднорідним. Споживачі часто мають претензії і по вологості, по розчинності, за змістом безводної лимонної кислоти в моногідраді, що змушує робити коригування і додавати більшу кількість лимонної кислоти в продукти, що в підсумку підвищує собівартість. При цьому відстежити якість, виявити конкретного виробника, щоб пред'явити претензії, буває практично неможливо - більшість китайських фірм, що працюють на російському ринку, відкритістю і готовністю до діалогу не відрізняються. Проявляється це насамперед у тому, що навіть маркування часто буває на китайській мові. Виникають складнощі і з супровідними документами, посвідченнями якості та пр.   Торік про захист свого внутрішнього ринку лимонної кислоти оголосила Україна. У квітні 2004 року набуло чинності рішення про застосування остаточних антидемпінгових заходів шляхом стягнення різниці між мінімальною ціною та митною вартістю товару. У результаті мито на імпорт лимонної кислоти з Китаю становить 130%.

1.2 Основні способи виробництва  лимонної кислоти

Близько 60 років тому лимонну  кислоту виділяли переважно з  плодів цитрусових рослин. Виробництво  лимонної кислоти хімічними способами  економічно недоцільно: вартість сировини значно вище вартості меляси; технологія багатостадійна, вимагає застосування сильно токсичних реагентів і  дає відносно низький вихід цільового  продукту. Тому незважаючи на великий  прогрес у галузі хімічного синтезу  різних органічних сполук, такі порівняно  прості речовини, як лимонна, молочна  і деякі інші кислоти, виробляють з цукровмісної сировини за допомогою мікроорганізмів. Переваги мікробного способу в послідовному ферментативному здійсненні в клітці навіть значно більшого числа хімічних реакцій в одну виробничу стадію - ферментацію. Це спрощує технологію, збільшує вихід кислот і знижує їх собівартість.           В даний час основну масу виробляють за допомогою певних штамів цвілевих грибів Aspergillus niger. Багато органічних речовини зброджуються мікроміцетами і можуть бути трансформовані в лимонну кислоту, але максимальний вихід виходить при біосинтезі з сахарози або фруктози. В якості сировини для ферментативного отримання лимонної кислоти в більшості країн використовують мелясу - побічний продукт виробництва цукру з цукрового буряка або цукрової тростини. Провідними виробниками лимонної кислоти є КНР, США, Франція, Росія та деякі інші країни. Раніше, починаючи з 1917 р., виробництво лимонної кислоти було засновано на поверхневому культивуванні мікроба-продуцента; в 1938-1942 рр.. освоєно також глибинне культивування в герметичних ферментаторах. Завдяки цьому вдалося механізувати й автоматизувати процес, ефективніше використовувати виробничі площі і знизити собівартість цільового продукту, скоротити загальну тривалість технологічного циклу, полегшити підтримання асептичності у виробничих умовах.

Рис. . Економічна ефективність використання різних джерел вуглецю  в біосинтезі лимонної кислоти (за 100% прийнята вартість цукру на одиницю  готового продукту).

1 - цукор (пісок), 2 - гідролізати  деревини; 3 - меляса; 4 - рідкі парафіни.

Також в якості сировини використовуються н-парафіни, а в якості продуцента - дріжджі роду Candida. У розрахунку на дешеву арабську нафту в ряді країн велика надія покладалася на н-парафіни - один з продуктів її переробки. Проте зважаючи виснаження запасів і підвищення цін на нафту, відносно невеликого вихід парафінів і необхідності їх використання в інших напрямках вони незабаром перестали бути перспективною сировиною. Синтетичні спирти, оцтову кислоту отримують на основі переробки попутних газів нафти і власне природних газів; джерела їх не безмежні, до того ж ці види сировини, як н-парафіни, широко використовуються в галузях народного господарства. При ферментації парафінів, спиртів і оцтової кислоти дріжджами одночасно з лимонною кислотою в значних кількостях утворюється ізолимонна, що знижує вихід цільового продукту і виникає додаткова проблема їх поділу. Економічне порівняння використання деяких джерел вуглецю в біосинтезі лимонної кислоти представлено на рис. 3.   Як джерело сировини набагато надійніше і дешевше побічні продукти переробки рослинної сировини, щорічно поновлюваного у великих кількостях. Це перш за все відноситься до цукрововмісних (цукровий буряк і цукровий очерет), що дає цукровий сік, або, при переробки його на кристалічний цукор, мелясу, і в деякій мірі - до крахмалоноси (кукурудза, картопля), до рослинних відходів сільського господарства та механічної переробки деревини.

• Біотехнологічний спосіб виробництва лимонної кислоти

Цей спосіб полятає в тому, що лимонна кислота виробляється з цукромісної сировини (меляси) за допомогою штамів грибів Aspergillus niger у процесі ферментації. Існує 2 види такої ферментації: поверхневий і глибинний.

Поверхневий спосіб ферментації

Приготування поживного  середовища при поверхневому способі  культивування здійснюють в варочном котлі. Мелясу розбавляють окропом у співвідношенні 1:1 і, додаючи сірчану кислоту, доводять рН розчину до значення 6,7 - 7,2. Для осадження солей заліза і важких металів вводять при кип'ятінні певну кількість розчину жовтої кров'яної солі. У розчин меляси при температурі 60 - 70 С послідовно додають джерела азоту, фосфору, макро-і мікроелементів. Вміст цукрів у середовищі має становити 12 - 16%. Основна ферментація здійснюється в спеціальних камерах, що представляють собою закриті приміщення, в яких на стелажах розташовані кювети. Кювети прямокутної форми виготовляють з алюмінію або нержавіючої сталі. Заповнення кювету живильним середовищем і злив з них культуральної рідини здійснюється через штуцери на дні кювет. Камери обладнані системою для подачі нагрітого стерильного повітря.   Перед початком нового циклу ферментації камери та кювети ретельно миють і стерилізують параформаліновою сумішшю з наступною дегазацією пароамміачною сумішшю. Після стерилізації та охолодження камер у кювети наливають живильне середовище шаром від 12 до 18 см. за допомогою спеціального пристрою для розпилення в живильне середовище вносять посівний матеріал - конідії гриба A.niger.       Через добу після засіву утворюється тонка сірувато-біла плівка міцелію, яка після закінчення трьох діб сильно потовщується і набуває складчасту структуру. Температуру в період активного росту міцелію гриба підтримують у межі 34 - 36 С при помірній аерації. У період активного кислотоутворення температуру знижують до 32 - 34 С, а подачу повітря збільшують в 3 - 4 рази. У міру зниження інтенсивності кислотоутворення і зменшення кількості виділеної теплоти подачу повітря в камеру поступово зменшують. Процес ферментації припиняють, коли в розчині залишається 1 - 2% цукрів, а вміст кислот в культуральній рідині досягає 12 - 20%. Культуральну рідину зливають з кювет до збірки, звідки її подають у хімічний цех для виділення лимонної кислоти. Зміст лимонної кислоти в культуральній рідині становить 12 - 20%      Міцелій відмивають від кислоти гарячою водою і використовують як корм для худоби.           Спосіб називається беззмінним. По змінному способу після зливання культуральної рідини під плівку A.niger вводять трохи води температурою 30 - 32 0С, витримують 0,5 годин, промивну рідину зливають, вводять свіже мелассне середовище і ферментують. За доливним способом ферментації на 4-5 добу під плівку A.niger доливають свіже живильне середовище в кількості, компенсуючому зменшення обсягу внаслідок випаровування вологи. При роботі цими способами економиться витрата конідій, рідше перезаряджаються камери і з'являється можливість ферментувати низькоякісні меляси, не придатні для вирощування грибний плівки. Періодичні способи мають ряд недоліків: ферментація відбувається з невеликою швидкістю; міцелій по закінченні циклу викидають, хоча він ще активний, а отримання нового міцелію пов'язано з витратою конідію, меляси і часу на його вирощування; в усіх кюветах важко підтримувати задану температуру, тому ферментація відбувається нерівномірно. Запропоновані безперервні способи передбачають протікання мелассного середовища по каскаду кювету під попередньо вирощеної плівкою міцелію A.niger або під секціями його, рухомими на транспортері в одному напрямку з середовищем в плоскому ферментаторі тунельного типу.  Поряд з поверхневим способом ферментації на рідких середовищах за кордоном відомі способи ферментації на твердих середовищах. Твердофазна ферментація передбачає використання імпрегнірованого середовища пористого твердого матеріалу, як багасса, картопля, пульпа цукрового буряка ін в певних пропорціях. Матеріал стерилізують і інокуліруют суспензією спор. Інкубують в лотках при 25 - 30 0С протягом 6 - 7 днів. Після інкубування вміст екстрагують водою, концентрують, цитрат осаджують і очищають.            У Японії в процесі Коджи отримують п'яту частину випускається в країні лимонної кислоти. Це твердофазне культивування спеціальних штамів A.niger на пшеничних висівках. Перед стерилізацією значення рН висівок доводять до 5,5, зволожують висівки гарячою парою так, щоб їх вологість становила 70 - 80%. Далі субстрат охолоджують до 30 - 36 С і інокуліруют спорами штаму, малочутливих до присутності Fe3 +. Температура не повинна бути вище 28 С. Крохмаль висівок осахарівается ферментами гриба, але додавання готових амілаз до субстрату збільшує вихід продукту. Інокульоване висівки розміщують в лотках на глибину 3 - 5 см. через 5 - 8 днів Коджи збирають і переносять у інокулятор для екстракції лимонної кислоти водою. Забруднення субстрату слідовими металами є проблемою в процесі Коджи, так як їх важче видаляти, ніж в інших варіантах процесу. Тому проводять селекцію і використовують штами, стійкі до слідові металам. До субстрату також додають HCF або Сu +2.

Рис. 8. Технологічна схема отримання лимонної кислоти з меляси поверхневим способом (жидкофазная ферментація): 1 - цистерна для меляси, 2 - відцентрові насоси, 3 - реактор для розбавлення меляси, 4 - стерилізатор, 5 - бродильна камера, 6 - збірка зброджуваний розчинів, 7 - нейтралізатор , 8, 10 - нутч-філь-вки, 9 - расщепитель, 11 - збір-ник-монтежю, 12 - вакуум-апарат, 13-дисольвер, 14 - фільтр-прес, 15 - кристалізатор, 16 - приймач, 17 - сушарка , 18 - готова продукція, 19 - збірник фільтрату.

Глибинний спосіб ферментації

На сучасних заводах прийнято глибинне культивування гриба, що характеризує більш високою продуктивністю, ніж  перший процес. При цьому інокульована середа наливається добре аеріруемі ферментери з перемішуванням і контролем аерації. Глибинна ферментація можлива в різних варіантах: періодичному з підживленням і безперервному. Процес отримання лимонної кислоти при глибинному культивуванні гриба A.niger проводять у ферментаторах об'ємом 100 м3. В якості посівного матеріалу використовують міцелій, отриманий у посівних апаратах об'ємом 10 м3.            Розчин меляси і для посівного, і для виробничого ферментаторів готують також, як і при поверхневому культивуванні, тільки вихідний розчин меляси для глибиною ферментації повинен містити не більше 4% цукрів. По ходу ферментації, коли концентрація цукру різко знижується, проводять дробове додавання стерильного мелассного розчину, що містить 25 - 28% цукрів. Додають цей розчин в такій кількості, щоб концентрація цукрів у ферментаторі становила 12 - 15%.        У посівної апарат, заповнений живильним середовищем, засівають суспензію конідію, яку попередньо витримують 5 - 6 годин в термостаті при 32 С. Культуру вирощують при 34 - 35 С при постійному перемішуванні і аерації. У процесі культивування суворо контролюють режим подачі повітря в ферментатор, витрата якого збільшують до кінця ферментації майже в 10 разів. О₂ повинен знаходитися як мінімум в концентрації 20 - 25% від насичення. У період інтенсивного спінювання середовища невеликими порціями вводять хімічний піногасник (олеїнову кислоту). Процес підрощування міцелію закінчують через 30-36 год, коли вміст кислот в культуральній рідині досягає 1-2%. Підрослий міцелій передають для засіву живильного середовища у виробничий ферментатор.     Процес кислотоутворення в ферментаторі триває 5-7 діб при безперервній аерації і температурі 31-32 0С. Витрата повітря поступово збільшують з 400 м3 / ч на початку процесу до 2200 м3 / ч до кінця ферментації. Дробову добавку подлівного розчину проводять 2-3 рази, підтримуючи концентрацію цукров, в розчині в межах 12-15%. Кінець процесу визначають за загальної кислотності і концентрації цукрів.  Після закінчення процесу ферментації культуральну рідину нагрівають гострою парою до 60-65 0С і зливають в збірку, а звідти подають на вакуум-фільтр для відділення і промивання біомаси міцелію. Промитий міцелій використовується як корм для худоби. Основний розчин лимонної кислоти разом з промивними водами передається в хімічний цех для виділення лимонної кислоти.         Від'ємний-долевной спосіб ферментації полягає в тому, що при активно протікаємому процесі продовжують підливати меласснуе середовище з відповідними попередніми відбираннями рідини. На початку ферментацію ведуть по режиму, зазвичай для періодичного способу, потім в 3 - 4 прийоми або безперервно підливають додаткову кількість середовища. Підлив припиняють за 36 годин до кінця процесу ферментації, що триває 12 діб. Сумарна кількість цукру за цикл становить близько 30% у перерахунку на вихідний обсяг (при початковій 3%-ної концентрації). У період додаткових підливань підтримують 1,2 - 1,5%-ву концентрацію цукру. Перед кожним підливою додають стільки води, скільки її захоплено відпрацьованим стисненим повітрям, і невеликої кількості азоту.     При ферментації від'ємно-долевним способом збільшується середньодобовий з'їм лимонної кислоти з 1 м3 ферментатора за рахунок зменшення частоти його зарядок при тому ж виході кислоти за масою цукру. В процесі безперервної ферментації A.niger змінює морфологію і виявляє велику кислотоутворюючу здатність, ніж в періодичному. Недоліком безперервної ферментації в одному апараті є проскакування неферментованого цукру і неможливість здійснення профілактичної стерилізації без переривання процесу. Проведення ферментації в декількох послідовно з'єднаних апаратах не має цих недоліків і більш перспективно, про що свідчить досвід безперервного спиртового бродіння.

Рис. 9. Технологічна схема  отримання лимонної кислоти при  глибинної ферментації продуцента: 1 - ємність з меласою, 2 - приймач меляси, 3 - ваги, 4 - варильний котел, 5 - відцентровий насос, 6 - проміжна ємність, 7 - стерилізуюча колонка, 8 - видержива-тель ,9 - холодильник, 10 - посівної апарат, 11 - головний ферментатор, 12 - стерилизующие фільтри, 13 - ємність для зберігання меляси, 14 - проміжний збірник, 15 - барабанний вакуум-фільтр, 16 - приймач для міцелію, 17 - вакуум- збірник для міцелію, 18 - вакуум-збірник фільтрату культуральної рідини.

Порівняння глибинного та поверхневого способу ферментації

При однаковій потужності заводів капітальні витрати на будівництво  будівель ферментаційних цехів приблизно  в два рази більше при поверхневому способі ферментації головним чином  через спорудження камер. Вартість же обладнання для нього, навпаки, в 1,3-1,5 рази менше і велика частина його виготовляється на місці. Загальні одноразові витрати на будівлі та обладнання для глибинного способу на 20-30% менше при більшій величині швидко зношувального обладнання.     Витрати на електроенергію при глибинному способі ферментації в кілька разів вище. Енергія витрачається в основному на отримання стисненого повітря. При поверхневому способі ферментації повітря подається під дуже невеликим тиском і витрата його менше. Витрати на обслуговуючий персонал дещо більше при поверхневому способі, так як підготовка камер і зняття міцелію з кювет вимагають великих затрат ручної праці.            Собівартість лимонної кислоти дещо нижче при поверхневому способі ферментації. Цей спосіб має й інші переваги: ​​вища концентрація лимонної кислоти в культуральній рідині, значно менше утворюється побічних кислот, внаслідок чого витрачається менше меляси при ферментації і менше втрати при хімічній переробці культуральних рідин. При поверхневому способі гриб менш чутливий до перерв в аерації. Обслуговування та контроль процесу ферментації прості, проблеми виникають тільки при необхідності підтримки вимагається температури повітря в камері при високій температурі зовнішнього повітря (в районах з жарким літом).    Глибинний спосіб дозволяє переробляти широкий набір цукровмісної сировини, він не так вимогливий до якості меляси, що на загальному тлі його погіршення є важливим гідністю. Швидкість ферментації за цим способом вище, в одному апараті відразу виходить велика кількість культуральної рідини і вона не збирається по численних кюветам, що спрощує технологію. Ферментація ведеться в стерильних умовах, що є необхідною передумовою для переходу на безперервний, повністю механізований процес, що усуває ручну працю.            Якщо поверхневий спосіб вичерпав свої потенційні можливості, застарів, то глибинний відповідає всім вимогам сучасної біотехнології знаходиться в стадії розвитку. Освоєння безперервної ферментації підвищить продуктивність і економічність процесу. У вітчизняній промисловості, що виробляє лимонну кислоту, нові заводи будуються тільки для роботи з глибинного способу ферментації, а існуючі заводи з поверхневим способом ферментації поступово переводяться на глибинний. 

2. Характеристика біологічного  об’єкту та біологічна схема виробництва лимонної кислоти

2.1 Біохімія процесу утворення лимонної кислоти

Біосинтез лимонної кислоти  здійснюється за допомогою культури А. niger, спеціально селекціонованої для отримання високих виходів продукту. Як субстрат використовують мелясу, яка крім вуглеводів, містить великий ряд органічних кислот. Застосування певного живильного середовища з сахарозою призводить до меншого якісного розмаїття кислот (лимонна, щавлева і глюконова кислота).       Біохімічний механізм утворення лимонної кислоти заснований на функціонуванні циклу трикарбонових кислот. Дегідріровання оцтової кислоти призводить до утворення двох молекул СО₂ і чотирьох пар іонів водню. У циклі відбувається також утворення НАДН і АТФ. Хоча більшість реакцій циклу оборотні, основним напрямком течії ензиматичних реакцій є утворення щавелевоуксусной кислоти через α-кетоглутаровую, янтарну і фумарову кислоти.          Реакцією, лімітуючої швидкість обороту циклу, є синтез лимонної кислоти, що каталізується аллостеріческім ферментом цітратсінтетази. Джерелом ацетил-КоА, який йде на синтез метаболітів циклу, є продукт циклу - лимонна кислота - легко переходить в цитоплазму через мембрану. Як правило, з ЦТК на потреби біосинтезу йде значна кількість метаболітів, і поповнення їх фонду та функціонування повного циклу в клітинах існують додаткові компенсуючі ферментативні механізми, наприклад гліоксилатний шунт. В останньому, на відміну від ЦТК, оцтова кислота витрачається на синтез. Отже, першою реакцією ЦТК є конденсація ацетил-КоА з щавелевоуксусной кислотою, каталізуюча цитратсинтетази. Саме активність цього ферменту є контролюючим параметром, що визначає швидкість метаболічного потоку в циклі. Інгібуючий ефект на цитратсинтетазу надає НАДН і сукциніл-КоА. Але основний вплив на швидкість синтезу лимонної кислоти справляє надходження субстрату (щавелевоуксусної кислоти). Так як безперервна «робота» ЦТК вимагає реокиснення відновлених еквівалентів (використовуються 4 пари дегідрогеназ), максимальна швидкість циклу спостерігається в умовах достатнього доступу кисню в клітинну систему (тобто при гарній аерації).        Аерація має критичне значення для глибинної ферментації. Пропущення чистого О₂ збільшує утворення лимонної кислоти, але це дорого; газова фаза може циркулювати, якщо при цьому поглинається СО₂. Переривання аерації на короткий час може мати згубну дію на продукцію лимонної кислоти, але якщо при цьому підвищити рН з 3,0 до 4,0, то ферментація може розпочатися знову.       У грибів розрізняють трофофазу, яка характеризується зростанням міцелію і активним диханням з виділенням СО₂, та ідіофазу (продукційну фазу), коли зростання завершене, дихання придушене, а залишена глюкоза переробляється у вторинні метаболіти; в даному випадку в лимонну або інші кислоти.           Утворення лимонної кислоти може бути умовно поділено на три процеси: 1 - розкладання гексоз до пірувату і ацетил-КоА при гліколізі, 2 – анаплеротічне утворення оксалоацетата з пірувату і СО₂ і 3 - акумуляція цитрату в ЦТК. А. niger розкладає глюкозу по гексозодіфосфатному (80%) і гексозомонофосфатного шляху.        При роботі першого шляху СО₂, утворена в результаті декарбоксилювання пірувату, фіксується при анаплеротичному утворенні оксалоацетату. (При роботі гексозомонофосфатного шляху СО2 не фіксуються). Поряд з гліколізом у A. niger частково реалізується і інший шлях окислення вуглеводів - пентозофосфатний, званий також пентозним, гексозомонофосфатного, або фосфоглюконатним. Загальним з гліколізом вихідним продуктом є глюкозо-6-фосфат, але надалі їх шляхи розходяться: фермент фосфофруктокіназа визначає дихотомічний шлях, глюкозо-6-фосфатдегідрогеназа - апотомічний. Кінцевими продуктами процесу є 3-фосфогліцериновий альдегід і рибоза-5-фосфат. Перший з них по реакціях гліколізу перетворюється на піровиноградну кислоту, тому пентозофосфатний цикл розглядається як шунт гліколітичного шляху. Основне призначення циклу - постачання клітини НАДН2, необхідної для відновних реакцій синтезу ліпідів і стероїдів, і пентози, в основному рибозой, яка використовується в синтезі нуклеотидів і нуклеїнових кислот.  Гексозомонофосфатний шлях і гліколіз мають багато спільних ферментів. Таким чином, обидва шляхи можуть реалізовуватися в клітці одночасно. При перетворенні 6 молекул глюкозо-6-фосфату по гексозомонофосфатному шляху сумарний ефект буде той же, що і при окисленні 1 молекули гексози в СО₂ по шляху гліколізу і ЦТК.   У процесі розкладання глюкози утворюються проміжні сполуки: маніт, арабіт, єрітріт, гліцерин.        Утворення лимонної кислоти тісно пов'язане зі швидкістю фіксації СО₂. Фіксацію СО₂ у А. niger здійснює конститутивний фермент піруваткарбоксілази. Існують майже стехиометрическое відношення між фіксацією СО₂ і продукцією цитрату.         Фермент аконітаза, що бере участь у розщепленні цитрату в ЦТК, знижує його продукцію. Вважали, що при дефіциті Fe або при додаванні Cu відбувається інгібування аконітази і відповідно збільшення виходу цитрату. Однак аконітаза каталізує реакцію, сильно зрушену в бік утворення цитрату, і необхідності в її інгібуванні немає. Інший фермент - НАДФН-залежна ізоцитратдегідрогеназа, яка теоретично повинна сприяти зниженню акумуляції лимонної кислоти, інгібується цитратом. Правда, у А. niger є ще один аллостерічно НАД-зв'язаний фермент - ізоцитратдегідрогеназа, яка активується цитратом.           Вихід лимонної кислоти залежить від активності α-кетоглутаратдегидрогенази. Утворення сукцініл-КоА з α-кетоглутарата під дією α-кетоглутаратдегидрогенази називають вузьким місцем ЦТК. Фермент інгібується фізіологічною концентрацією щавелевоуксусної кислоти і НАДН. Збільшення клітинного оксалоацетата знижує катаболізм цитрату на рівні α-кетоглутарата і одночасно посилює швидкість його синтезу за участю цітратсінтази. Акумуляція α-кетоглутарата і НАДН знижує активність НАД (НАДФ)-ізоцітратдегідогенази, що сприяє збільшенню накопичення цитрату до рівня, при якому сам інгібує вищевказаний фермент.    Цитрат сильно пригнічує транспорт глюкози в клітці шляхом придушення активності фосфофруктокенази. Останньому протидіє збільшення концентрації NH4 +, а накопиченню NH4 + сприяє дефіцит Mn в середовищі. Вважають, що при дефіциті Mn посилюється розкладання білків і внутрішньоклітинний вміст NH4 + зростає. Підвищення концентрації амонійних іонів всередині клітин пом'якшує інгібуючий вплив цитрату на фосфофруктокінази.         Більшість дослідників схиляється до думки, що основну роль грає інгібування ферментів - аконітатгідратази і ізоцитратдегідрогенази. Інгібування аконітатгідратази пояснюють дією самої лимонної кислоти або надлишку гексаціаноферроата калію, вживаного для обробки мелассного середовища перед ферментацією.         При інтенсивному кислотоутворенні активність цитратсинтетази зростає приблизно вдесятеро. Однак за наявними даними ще не можна вирішити питання, що є причиною накопичення лимонної кислоти - інгібування зазначених двох ферментів або активування цитратсинтетази.

Біохімічна схема синтезу  лимонної кислоти     Відомо, що до другої доби ферментації в середовищі, вже покритої тонкою міцеліальної плівкою, у відчутних кількостях містяться янтарна і яблучна кислоти, а також не пов'язані з ЦТК кислоти: глюконова, цукрова і малонова. Перші дві кислоти утворюються безпосереднім окисленням глюкози, малонова як проміжний продукт на шляху синтезу насичених жирних кислот. Зміст цих кислот зростає до третьої-п'ятої доби ферментації. Таким чином, інгібування аконітатгідратази і ізоцитратдегідрогенази починають викликати перераховані вище кислоти, що викликає поступове накопичення лимонної кислоти, яка в свою чергу ще більше інгібує дані ферменти, і підсилює їх синтез.         Слід звернути увагу ще на одного можливого учасника в цьому механізмі - малонову кислоту, що є специфічним інгібітором сукцинатдегідрогенази. Малонова кислота утворюється більше інших кислот і вміст її в середовищі зростає до четвертих-п'ятих діб - часу початку найбільш інтенсивного продуцирування лимонної кислоти.    У період інтенсивного накопичення лимонної кислоти в ЦТК переважає анаплеротичний шлях метаболізму, тобто спочатку відбувається карбоксилювання піровиноградної кислоти з утворенням щавелевоуксусной, а потім конденсація її з ацетил-КоА. Інтенсивність утворення лимонної кислоти в цей період може бути зрозуміла також з того, що в даному випадку різко обмежуються можливості конструктивного і енергетичного обміну речовин клітини і A.niger для підтримки життєздатності змушений переробляти значно більшу кількість субстрату.    Фактором, що стимулює акумуляцію лимонної кислоти, служить аерація. О₂ необхідний і для реокиснення гліколітичного НАДН в процесі лимоннокислої ферментації.

2.2 характеристика біологічного  об’єкту та біологічна схема  виробництва лимонної кислоти