Ирина Эланс

Автор который поможет с любыми образовательными и учебными заданиями

Технология получения ферментов из сырья животного происхождения

ФГОУ ВПО «Саратовский ГАУ им. Вавилова»

кафедра биотехнологии

Задание по подготовке курсовой работы:

Студенту: Шатову А.А. Зав. кафедрой:______________

Тема работы: Технология получения ферментов Руководитель_______________

из сырья животного происхождения

Дача выдачи задания: Задание принял к исполнению

«21» октября 2010г. Студент____________________

Исходные данные к работе:

Перечень вопросов, подлежащих разработке:

1. Брожение, виды, значение. 2. Культивирование клеток и тканей высших растений. 3.1 Гиперурикемические лекарственные средства. 3.2 Техника получения кристаллов мочевой кислоты. 4. Технология получения ферментов из сырья животного происхождения. 5. Вопрос, задача.

Рекомендуемая литература:

1. - Шлегель Г. - Общая микробиология, М., 1987, 567 ст. 2. - Р.Г. Бутенко Биология клеток высших растений in vitro и биотехнологий на их основе. М., 1999 153 ст. 3. - электронная энциклопедия википедия http://ru.wikipedia.org 4. - Иванский В. И., Химия гетероциклических соединений, М., 1978, с. 432-34 5. - ТЕХНОЛОГИЧЕСКАЯ ИНСТРУКЦИЯ ПО ПЕПСИНУ 24 ст. 6. - А. Ленинджер Основы биохимии 1 том М., 1985, 369 ст. 7. – В.А. Блинов Общая биотехнология, часть 1, С., 2003, 163 ст.

СОДЕРЖАНИЕ

1. Введение, задачи и цель.....................................................................4

2. 1.Брожение, виды, значение..............................................................5

3. 2.Культивирование клеток и тканей высших растений.................13

4. 3.1 Гиперурикемические лекарственные средства.........................26

5. 3.2Техника получения кристаллов мочевой кислоты....................28

6. 4 Технология получения ферментов из сырья животного происхождения.................................................................................................30

7. Вопросы и задачи...............................................................................35

8.Список источников литературы........................................................39

9. Приложение........................................................................................40

ВВЕДЕНИЕ, ЗАДАЧИ И ЦЕЛЬ

В данной курсовой работе будут рассмотрены несколько тем по биотехнологии. Биотехнология наука изучающая процессы нашей повседневной жизни. Брожение, очень интересный процесс о котором ранее не знали наши предки, но использовали его для производства хлеба, пива, вина и других продуктов которые до сих пор находятся на наших столах и в холодильниках. В настоящий период биотехнология проникла во множество сфер человеческой деятельности, изучение и культивирование растений, изготовление медицинских препаратов, антибиотиков, а так же использование микроорганизмов для получения тех или иных продуктов. Но в нашей стране её уделяется не достаточное внимание. Цель биотехнологии дать представления о современном состоянии и перспективах развития биотехнологии, имеющей в своей основе использование биологических объектов и биомолекул в промышленном производстве, сельском хозяйстве, здравоохранении и охране окружающей среды. Исходя из этой цели, вытекают следующие задачи:

- Изучить процессы брожения, их сущность, виды и значения.

- Понять процессы культивирования клеток и тканей высших растений.

- Изучить болезнь гиперурикемию и средства борьбы с данным заболеванием.

- Изучить технику получения кристаллов мочевой кислоты

- Изучить технологию получения ферментов из источников сырья животного происхождения

- Решить задачу и ответить на поставленный вопрос.

1. БРОЖЕНИЕ, ВИДЫ, ЗНАЧЕНИЕ

Брожение – окислительно-восстановительный процесс, проходящий в анаэробных условиях и приводящий к образованию АТФ, в котором роль донора и акцептора атомов водорода (или соответствующих электронов) играют органические соединения. Образование молекул АТФ при брожении происходит путем субстратного фосфорилирования.

Чаще всего в процессах брожения микроорганизмы используют углеводы. Существует несколько типов брожения, названия которых даются по конечному продукту: спиртовое, пропионовокислое, молочнокислое, ацетонобутиловое, маслянокислое и т.д.

Первый этап окисления углеводов в процессе брожения (рис. 1) включает гидролиз углеводов до простых сахаров и изомеризацию их до глюкозы.

На втором этапе глюкоза через ряд последовательных реакций окисляется в пировиноградную кислоту. Этот процесс называется гликолизом. Основными стадиями гликолиза являются присоединение фосфатных групп от молекулы АТФ и превращение во фруктозо-1,6-дифосфат. Далее фруктозо-1,6-дифосфат превращается в фосфоглицериновый альдегид, который через ряд последовательных реакций превращается в пировиноградную кислоту. При этом образуется свободная энергия, достаточная для образования 4 молекул АТФ. Но так как 2 АТФ затрачиваются на активацию глюкозы, то энергетическая ценность любого брожения – образование из одной молекулы глюкозы двух молекул АТФ (энергетическая ценность брожения). Следует отметить также, что при гликолизе восстанавливается дегидрогеназа (2 НАДН₂).[1]


2 АТФ	¯ глюкоза ¯
	Фруктозо-1,6-дифосфат
4 АТФ	¯ 2 ФГА (фосфоглицериновый альдегид) ¯ 2 ПВК (пировиноградная кислота)	2 НАДН₂

Рис. 1 - Схема окисления углеводов в процессе брожения

Третий этап. Пировиноградная кислота при серии последовательных реакций претерпевает превращения, характер которых зависит от ферментативных особенностей того или иного возбудителя. Так, в клетках дрожжей имеются специфические ферменты – пируватдекарбоксилаза и алкогольдегидрогеназа, осуществляющие превращение ПВК в этиловый спирт.[1]

Спиртовое брожение – микробиологический процесс превращения углеводов в спирт и углекислый газ. Вызывается аскомицетовыми дрожжами рода Saccharomyces, некоторыми бактериями и отдельными представителями мукоровых грибов.

Суммарное уравнение реакции:

С₆ H₁₂ O₆ → 2 СНзCH₂ ОН + 2 СО₂ + Е

глюкоза этиловый спирт

Как и любое брожение, это сложный многоступенчатый процесс, который протекает при участии комплекса ферментов. Наряду со спиртом, могут образовываться побочные продукты: глицерин, уксусный альдегид, уксусная, яблочная кислоты, сивушные масла (смесь высших кислот).

Основными возбудителями спиртового брожения являются дрожжи – сахаромицеты.

Это факультативно-анаэробные микроорганизмы. В аэробных условиях дрожжи получают энергию путем полного окисления моно- и дисахаридов до углекислого газа и воды, т.е. путем аэробного дыхания. При этом интенсивно накапливается биомасса (эффект Пастера). Поэтому производство хлебопекарных дрожжей ведут в аэробных условиях. Ацидофилы. Мезофилы.

Естественным местообитанием дрожжей является поверхность плодов и ягод, сок и поверхность листьев, нектар, вода, почва, кожные покровы и пищеварительный тракт людей и животных.

Условия проведения спиртового брожения

1. Источники питания. В качестве источника углерода используют глюкозу, фруктозу, сахарозу, мальтозу. Крахмал дрожжи не сбраживают, так как амилолитические ферменты у них отсутствуют. Поэтому крахмалсодержащее сырье подвергают осахариванию при участии амилаз различного происхождения. Концентрация сахара 10–15% наиболее благоприятна для большинства дрожжей. В качестве источника азота используются аммонийные соли органических кислот и аминокислоты.

2. Анаэробные условия.

3. Температура. По отношению к температуре сахаромицеты делятся на низовые и верховые дрожжи. Дрожжи верхового брожения вызывают бурное и быстрое брожение при температуре 20–28 °С. При этом они всплывают на поверхность под действием выделяющегося диоксида углерода. Низовые дрожжи осуществляют более спокойное брожение, которое ведут при 5–10 °С.

4. Концентрация этилового спирта. Этиловый спирт, накапливающийся в среде, оказывает неблагоприятное действие на дрожжи. Угнетающее действие спирт оказывает уже при концентрации в среде 2–5 % об., а при 12–15 % об. брожение прекращается.

5. Активная кислотность среды (рН). Спиртовое брожение протекает в кислой среде (рН 4–4,5). При подщелачивании среды до рН 8 дрожжи в качестве основного продукта брожения накапливают не спирт, а глицерин. Это так называемая глицериновая форма спиртового брожения:

2С₆Н₁₂0₆ → 2CН₂0HCHOHСН₂0Н+СНзСН₂0Н+СНзСООН+2С0₂ + Е

глюкоза глицерин этиловый уксусная

спирт кислота

Практическое использование спиртового брожения

Спиртовое брожение лежит в основе производства этилового спирта, пива, вина, используется в хлебопечении. Совместно с молочнокислым брожением оно используется при производстве кваса, кефира, кумыса. Основными потребителями этилового спирта являются пищевая и химическая промышленность, а также медицина.[1]

Молочнокислое брожение – процесс превращения углеводов молочнокислыми бактериями в молочную кислоту.

Возбудители молочнокислого брожения подразделяются на 2 группы:

гомоферментативные и гетероферментативные, которые, в свою очередь, вызывают гомоферментативное и гетероферментативное молочнокислое брожение. В основу этого деления положены конечные продукты, образуемые при гомо- и гетероферментативном молочнокислом брожении.[1]

Гомоферментативное молочнокислое брожение и его возбудители. При гомоферментативном молочнокислом брожении образуется преимущественно молочная кислота.

Химизм процесса:

С₆H₁₂О₆ → 2 СНзСНОНСООН + Е

глюкоза молочная кислота

К гомоферментативным молочнокислым бактериям относятся молочнокислые стрептококки: Streptococcus lactis, Streptococcus cremoris, Streptococcus thermophilus, а также молочнокислые палочки: Lactobacillus delbrueckii, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus ptantarum.

Гетероферментативное молочнокислое брожение и его возбудители. Конечными продуктами при этом брожении являются не только молочная кислота, но и побочные продукты: уксусная кислота, этиловый спирт, янтарная кислота, диоксид углерода, водород. Суммарное уравнение процесса имеет вид:

С₆H₁₂О₆ → СНзСНОНСООН + СООНСН₂СН₂СООН + СНзСООН +

глюкоза молочная кислота янтарная кислота уксусная кислота

+СНзСН₂ОН + C0₂+Н₂ +Е

этиловый спирт

К гетероферментативным молочнокислым бактериям относятся бактерии рода Streptococcus: Streptococcus diacetilactis, Streptococcus acetoinicus; бактерии рода Lactobacillus: Lactobacillus brevis, Lactobacillus helveticus, а также бактерии рода Leuconostoc: Leuconostoc mesenteroides, Leuconostoc cremoris.[1]

Характеристика молочнокислых бактерий

Все молочнокислые бактерии - грамположительные, факультативные анаэробы. Среди молочнокислых бактерий есть мезофилы (предпочитают температуру около 30 °С) и термофилы (Streptococcus thermophilus, Lactobacillus bulgaricus), оптимальной температурой для которых является температура около 40–50 °С.

Молочнокислые бактерии отличает высокая требовательность к питательной среде: они нуждаются в полном наборе готовых аминокислот, в витаминах группы В₁₂, в компонентах нуклеиновых кислот, что и определяет их распространение в природе.

Молочнокислые бактерии обитают в основном на растениях, плодах, овощах, в желудочно-кишечном тракте, в молоке и молочных продуктах, а также в местах разложения растительных остатков.

В качестве источника углерода используют лактозу, мальтозу.

Оптимальное значение рН для развития молочнокислых бактерий около 4. Молочнокислые бактерии образуют от 1 до 3,5 % молочной кислоты. [1]

Практическое значение молочнокислого брожения

Оно находит широкое применение при изготовлении кисломолочных продуктов, сливочного масла, маргарина, используется в хлебопечении, при квашении овощей, силосовании кормов и производстве молочной кислоты.

Многие мезофильные гетероферментативные молочнокислые бактерии и лейконосток являются вредителями в производстве спирта, пива, вина, безалкогольных напитков, сахара и др.[1]

Пропионовокислое брожение вызывается пропионовокислыми бактериями, относящимися к роду Propionibacterium.

Единственным источником энергии для пропионовокислых бактерий является процесс сбраживания различных веществ: моносахаридов (гексоз, пентоз), молочной, яблочной кислот, глицерина и других в пропионовую и уксусную кислоту, диоксид углерода и воду.

Химизм пропионовокислого брожения:

ЗС₆H₁₂О₆ → 4СНзCH₂СООН + 2СНзСООН + 2CO₂ + 2H₂O +Е

глюкоза пропионовая уксусная

кислота кислота

Пропионовокислые бактерии – небольшие, неподвижные грамположительные палочки, не образующие спор, факультативные анаэробы. Обитают в основном в кишечном тракте жвачных животных и в молоке.

Практическое применение пропионовокислого брожения

Пропионовокислое брожение используется в сыроделии. Летучие кислоты (пропионовая и уксусная) придают сырам кисловато-острый вкус, а выделяющийся в виде пузырьков углекислый газ образует «глазки» в сыре.

У пропионовокислых бактерий обнаружена способность к активному синтезу витамина В₁₂, поэтому они используются в качестве продуцента в микробиологической промышленности для получения этого витамина.[1]

Маслянокислое брожение – анаэробное окисление органических веществ маслянокислыми бактериями в масляную кислоту.

Химизм процесса:

С₆H₁₂О₆ → СНзСН₂СН₂СООН + 2 С0₂ + 2Н₂ +Е

глюкоза масляная кислота

Возбудители маслянокислого брожения

Маслянокислые бактерии относятся к роду Clostridium. Это крупные, подвижные грамположительные палочки, образующие устойчивые споры, при образовании которых клетка приобретает форму веретена или теннисной ракетки, облигатные (строгие) анаэробы.

Маслянокислые бактерии широко распространены в природе. Обитают там, где много органических веществ и нет доступа воздуха – в иловых отложениях водоемов, навозе, почве и т.д.

Эти бактерии могут сбраживать многие углеводы, в т.ч. (крахмал, гликоген, пектиновые вещества, целлюлозу), спирты (этиловый, маннит, глицерин) и аминокислоты. По характеру используемых субстратов маслянокислые бактерии делятся на две группы: сахаролитические клостридии, которые сбраживают в основном углеводы (Ctostridium butyricum), и протеопитические клостридии, которые разлагают белки и пептоны до аминокислот и затем их сбраживают (Clostridium sporogenes, Clostridium subterminalis, Clostridium perfringens, Clostridium botulinum).[1]

Практическое значение маслянокислого брожения. Маслянокислое брожение используется в промышленности для получения масляной кислоты (продуцент Clostridium butyricum). Хотя масляная кислота обладает резким, неприятным запахом прогорклого масла, ее эфиры отличаются приятным ароматом: метиловый эфир имеет яблочный запах, этиловый – грушевый, амиловый – ананасный. Эфиры масляной кислоты используют в кондитерской, безалкогольной, парфюмерной промышленности.

Маслянокислые бактерии участвуют в круговороте веществ в природе. С другой стороны, маслянокислые бактерии могут вызвать массовую гибель картофеля и овощей, вспучивание сыров, порчу консервов, прогоркание масла и маргарина, увлажненной муки и других продуктов, чем наносят большой урон народному хозяйству. Борьба с маслянокислыми бактериями затруднена из-за высокой устойчивости спор.[1]

Уксуснокислое брожение – аэробное окисление углеводов и спирта уксуснокислыми бактериями в уксусную кислоту. Таким образом, это брожение относится к неполным окислениям или окислительным брожениям. Суммарное уравнение процесса имеет вид:

С₆H₁₂O₆ + 2 0₂ → 2СНзСООН + 2CO₂ + 2Н₂0 + Е или

глюкоза уксусная кислота

СНзСН₂ОН + O₂ → СНзСООН + Н₂О + Е

этиловый спирт уксусная кислота

Возбудителями уксуснокислого брожения являются уксуснокислые бактерии, относящиеся к двум родам: Gluconobacter и Acetobacter. Это короткие, подвижные грамотрицательные палочки, не образующие спор. Оптимальная температура развития – 30˚ С. Бактерии кислотоустойчивы, оптимальное значение рН для развития 5,4–6,3. Обитают на цветах, зрелых фруктах, ягодах, овощах, в прокисших соках, пиве, вине, квашенных овощах.

Практическое значение уксуснокислого брожения

Используется в промышленности для получения натурального спиртового уксуса (продуцент Acetobacter aceti). Кроме того, производят также винный уксус (из вина) и яблочный уксус (из яблочного сока). С другой стороны, уксуснокислые бактерии являются вредителями спиртового, пивоваренного, консервного производств, виноделия, производства безалкогольных напитков.[1]

2. КУЛЬТИВИРОВАНИЕ ТКАНЕЙ И КЛЕТОК ВЫСШИХ РАСТЕНИЙ

Как правило, большинство исследований проводятся с эксплантами разных органов, тканей и клеток семенных растений (голо- и по-крытосеменных). Низшие растения (многоклеточные водоросли) и споровые высшие растения (мхи, хвощи, папоротники) привлекаются в культуру реже. Это можно объяснить большой ролью в жизни человечества покрыто- и голосеменных растений начиная с древесных форм, луговых трав и культивируемых в сельском хозяйстве растений, которые кормят человечество. Многоклеточные водоросли трудны для поддержания их в культуре, хотя они, несомненно, перспективны в качестве источников Биопродуктов для медицины, пищевой промышленности и других биотехнологий. В литературе в качестве объектов, используемых для культивирования in vitro, можно встретить мхи, лишайники, папоротники. В этих случаях культуры клеток используют для изучения специфических указанных растений процессов.[2]

Большое внимание биологи отводят выращиванию микроводорослей. Их культивирование в ферментерах при условии обеспечения светом процесса фотосинтеза, с одной стороны, позволяет решать фундаментальные проблемы фотосинтеза и связи его с клеточным циклом и судьбой популяции (Л. Цоглин и Н. Гавель, 1994), а с другой стороны, в ферментерах микроводоросли выращиваются с целью использования их биомассы и фитопродуктов в качестве сырья для промышленности.

Вернемся к эксплантам, полученным от разных таксонов высших растений. Они очень различны, однако в настоящее время нет такого высшего растения, от которого нельзя получить культивируемые ткани и хлетки. Растущие поверхностно на агаре, агарозе, гельрите каллусные ткани и растущие в жидкой питательной среде суспензионные клеточные культуры требуют создания разных условий для разных таксонов.

Наиболее легкими объектами для культивирования являются двудольные травянистые растения, затем следуют однодольные травянистые виды и зерновые культуры. Труднее создать условия для стабильных in vitro культур древесных растений, особенно голосеменных. Древесные растения по мере старения теряют способность к образованию каллуса. Особенно это свойственно хвойным породам в возрасте более 12—15 лет. Для работы с наиболее интересными для практики «сильными» деревьями (а это становится явным в более зрелом их возрасте) применяется метод омоложения. Для этого используется обработка черенков смесью регуляторов роста (цитокинины, ауксины, витамины, стимуляторы роста). В работах Е. Калашниковой (1992) и К. Хмары (1990) манипуляции с черенками хвойных таксонов ели и сосны позволили получить размножение этих древесных пород как путем черенкования побегов, так и путем морфогенеза из каллусных тканей. Подробно используемый ими метод будет описан в главе «Биотехнология клонального микроразмножения».[2]

МЕТОДЫ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ (АСЕПТИКА)

Первичный эксплант должен быть полностью освобожден от всех микроорганизмов (бактерий, грибов, микоплазм и т.д.), и его дальнейшее существование in vitro требует поддержания абсолютной асептики, так как грибная и бактериальная инфекция ингибирует рост клеток и приводит культуру к гибели.

Перед стерилизацией экспланта фрагмент растения тщательно промывается водой с мылом, затем следует процедура поверхностной стерилизации эксплантов в растворах дезинфицирующих средств (сулема, диацид, гипохлориты кальция, натрия, калия). В стерилизующий раствор хорошо добавить эмульгатор, например Твин-20 (одна капля на 100 мл раствора).[2]

В табл. 1 представлены условия стерилизации эксплантов разных объектов (концентрация и время инкубации).

После инкубации эксплантов в стерилизующем растворе их промывают тремя порциями стерильной воды по 10 минут в каждой. Затем полезно острым дезинфицированным ланцетом удалить наружный слой клеток на срезах экспланта, так как наружный слой клеток мог быть поврежден при дезинфицировании.

Таблица 1

Стерилизация исходного растительного материала

Объект	Время стерилизации, мин
	диацид 0,1%	сулема 0,1%	гипохлориты Na, Са 5-9%	перекись водорода 10-12%	Антибиотики
семена сухие	15-20	10-15	15-20	12-15
семена набухшие	6-10	6-8	10-15	6-8
кусочек мясистого корня, стебля	20-30	15-25	15-20	_
покров стебля	20-40	20-25	20-25	—	Ткани
листья	1-3	0,5-3	3-6	3-5	стебля
цветы	1-10	0,5-7	3-15	2-7	чая

Иногда кроме поверхностной стерилизации приходится прибегать к антибиотикам, убивающим микробиальную флору внутри ткани. Выбрать слезно действующий антибиотик трудно, и не всегда оздоровление экспланта при этом удается. В качестве одной из удач можно привести пример освобождения от внутренных микробов эксплантов чая (Ниссанка Мюри 1990)

В литературе отмечены случаи, когда образование каллуса и рост кажутся вполне благополучными, однако после ряда субкультивировании рост клеточной массы начинает снижаться. При этом явного присутствия микробиальной флоры незаметно, однако состояние культур существенно ухудшается. Можно полагать, что в этом случае споры бактерий в течение длительного срока задерживались в развитии выделениями растительных клеток.[2]

В лаборатории автора наблюдали такой процесс для одного из клонов диоскореи дельтовидной — продуцента стероидных гликозидов (анпитрессового фитопродукта этой культуры). В течение длительного времени рост культуры диоскореи был нормальным, но после ряда пересадок рост клеток снижался, среда становилась мутной, в ней обнаруживались бактериальные клетки, и культура постепенно погибала. Можно предположить, что споры некоторое время ингибировались стероидными гликозидами диоскореи дельтовидной. Вряд ли описанный феномен просто результат занесения бактерий, тогда бы гибель культуры произошла быстро, а не была бы растянута на длительный срок. Вопрос о существовании клеток растений и бактериальных спор и бактериальных эндосимбионтов в культуре in vitro еще требует изучения.

Стерильные условия выращивания обязательны для манипуляций с бъектами in vitro. Обычно работы с культурами проводятся в ламинарбоксах, где асептика достигается подачей фильтрованного стерильного воздуха в рабочий объем. В ночное время, чтобы увеличить надежность сохранения асептики, рекомендуется включать УФ-лампы. В последнее время при работе с клетками животных и растений вместо ламинарбоксов предпочитают работу в асептических комнатах. Экспериментатор, работающий в такой комнате, обязан иметь специальную одежду и быть подготовленным к асептической работе.

Посуда, инструменты, бумага стерилизуются, как правило, в сухожарных шкафах при температуре 160 °С либо в автоклаве при избыточном давлении 0,15 мм ртутного столба в течение 60 минут.

Компоненты питательных сред, которые не разрушаются при темпе-ратуре около 120 °C, можно стерилизовать в автоклаве. Фильтрованием через ультрафильтры можно стерилизовать все компоненты сред (кроме агарозных основ) или только те компоненты, которые заведомо не выно-сят нагрева до 120 °С. Фильтрование производят в стерильных условиях (в ламинарбоксах). Агар и агарозу обычно добавляют в питательные среды в твердом виде перед автоклавированием.[2]

ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ И ФИЗИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ,

ОПТИМАЛЬНЫЕ ДЛЯ КУЛЬТУР

Генетически и эпигенетически различные экспланты и каллусные ткани даже в пределах вида часто требуют разных химических и физических условий выращивания in vitro. Начнем с главного — с питательных сред.

В 1932 г. французским ученым Роже Готре были созданы питательные среды, которые позволили ему получить первичные каллусы на срезах ветвей древесных растений и каллусов паренхимы корнеплодов. В то же самое время американский ученый Р. Уайт (1934) модифицировал среду Успенских и применил ее для пересадочной культуры корней растений.

Наиболее часто используемой питательной средой по праву можно назвать среду Мурасиге (правильнее — Мурашиге) и Скуга — среда MS. Она была предложена Тошио Мурашиге и Фольке Скугом в 1962 г. Эта среда, как правило, подвергается разным модификациям, что реже относится к макро- и микроэлементам минеральной среды и чаще касается наборов витаминов, гормональных и других регуляторных факторов.

Основная минеральная среда MS была подобрана авторами для кал- лусной ткани табака сорта <Висконсин>, возникшей на экспланте — паренхиме стебля в средней его части. Именно при этих условиях Ф. Скуг и С. Миллер в 1954—1957 гг. манипулировали соотношением кинетина и ауксина в среде, направляя культуру на разные пути развития. При примерно равных количествах кинетина и ауксина в среде происходило образование быстро растущего каллуса. При увеличении дозы ауксина возникали корни, при преобладании кинетина — стеблевые культуры.

В табл. 2 представлены наиболее различающиеся между собой среды, предложенные разными авторами, и указано, для каких видов растений они более приемлемы.[2]

Таблица 2

Состав разных питательных сред, применяемых при культивировании in vitro

1 литр среды Као и Михайлюка содержит дополнительно: рибозы, ксилозы, ман- нозы, рамнозы, целлобиозы, сорбита — по 125 мг, маннита, никодинамида, аскорбиновой кислоты — по 1 мг; витамина А — 10 мг; витамина Ds — 0,5 мг; Са-пантотената — 0,01 мг, витамина В12 — 0,2 мг; n-аминобензойной кислоты — 0,01 мг; биотина — 0,005 мг; хо- линхлорида — 0,5 мг; рибофлавина — 0,1 мг; 2,4-Д — 0,2 мг; зеатина — 0,5 мг; НУК — 1 мг; гидролизата казеина — 125 мг, кокосового молока — 10 мл; СаСЬ, 30% — 1,5 мл; глюкозы — 68 400 мг; пирувата Na — 5 мг; лимонной кислоты — 10 мг; яблочной кислоты — 10 мг; фумаровой* кислоты — 10 мг.

Продолжение табл. 2

Способ приготовления концентрированной (1 X 10) минеральной основы

среды по прописи Мурасиге и Скуга

MgS0₄ х 7Н₂0 MnS0₄ х Н₂0 ZnS0₄ х 7Н₂0

KNO,

nh₄no₃

СаС1₂ х 2Н₂0

кн₃ро₄ н,во₄ ^KJ

CuS0₄ х 5Н₂0

Na₂Mo0₄ х 2Н_гО

СоС1₂ х 6Н₂0

Ингредиенты частей А, Б, В растворить в 100 мл бидистиллированной воды, смешать А + Б, добавить В, добавить по 1 мл растворов CuS0₄, Na₂Mo0₄ и СоС1₂. Развести в 10 раз при приготовлении среды.

ПРИЛОЖЕНИЕ К ТАБЛИЦЕ 2

Среда Мурасиге и Скуга — наиболее универсальная и многоцелевая среда, пригодная для растительных клеток многих видов.

Среда MS (Мурасиге и Скуга) дает хорошие результаты при каллусообразовании у большинства растений, хорошо поддерживает неорганизованный каллусный рост и вызывает индукцию морфогенеза у большинства двудольных видов.