Технология производства ферментов

Оглавление

Введение.

1. Классификация ферментов.

2. Глубинный метод производства  ферментов.

3. Производство ферментов  при поверхностном культивировании  продуцентов.

4. Иммобилизация ферментов.

5. Классификация носителей  для ферментов.

6. Методы иммобилизации  ферментов.

7. Оборудование для производства  ферментов.

8. Применение иммобилизованных  ферментов.

9. Рынок ферментов и  ферментных препаратов.

10. Литература

Введение

Органические отходы, как  правило, имеют вид макромолекул, размеры которых иногда больше размеров бактериальной клетки. Для использования  бактериями этих веществ, они должны подвергнуться расщеплению, либо гидролизу. Однако если вещество является трудно растворимым, процесс расщепления (гидролиза) может быть длительным. Ускорение  процесса достигается с помощью  ферментов, синтезируемых клетками микроорганизмов, и выделяемых во внешнюю  среду.

Название ферменты происходит от латинского «fermentum» - закваска. Ферменты представляют собой сложные белковые молекулы и являются «биологическими катализаторами». «Биологический» говорит о том, что они являются продуктом или производным какого-либо живого организма. Слово «катализатор» означает, что вещество, обладает способностью увеличивать скорость химической реакции, при этом само оно в результате реакции не изменяется. Следовательно, после завершения реакции фермент способен сразу же вступать в новую.

Ферменты характеризуются  субстратной специфичностью, то есть взаимодействуют только с одним  веществом, и специфичностью действия - катализируют одно из возможных превращений, которым может подвергаться это  вещество. Иными словами, фермент  является своеобразным «ключом», способным  открыть определенный «замок». В  качестве «замка» выступают крупные  органические молекулы, содержащиеся в сточных водах, которые расщепляются до веществ, необходимых микроорганизмам.

Ферменты ускоряют химические реакции, действуя в десятки, а иногда и сотни тысяч раз быстрее, чем неорганические катализаторы.

Многие вещества, используемые живыми организмами в качестве источников энергии, способны окисляться только при  очень высокой температуре. При  нормальных условиях эти реакции  либо не идут, либо протекают с очень  низкой скоростью. Небольшой пример: химическое окисление азота аммиака (содержащегося в больших количествах  в сточных водах и имеющего резкий неприятный запах) до свободного азота протекает при температуре 600-700 °С; ферментативное - при температуре окружающей среды. К другой особенности, отличающей ферменты от химических катализаторов, можно отнести способность регулировать скорость протекания реакции в зависимости от концентрации субстрата в окружающей среде (чем выше содержание вещества, тем быстрее происходит его разложение). Все это делает фементы незаменимым сырьем для практически любого вида производства, от пишивой до текстильной.

1. Классификация ферментов

Ферменты как биокатализаторы  обладают рядом уникальных свойств, например, таких как высокая каталитическая активность и избирательность действия. В ряде случаев ферменты обладают абсолютной специфичностью, катализируя  превращение только одного вещества. Для каждого фермента существует свой оптимум рН, при котором его каталитическое действие максимально. При резком изменении рН ферменты инактивируются из-за необратимой денатурации. Ускорение реакции при повышении температуры также лимитировано определенными пределами, поскольку уже при температуре 40-50оС многие ферменты денатурируют. Эти свойства ферментов приходится учитывать при разработке технологии нового препарата.

Поскольку ферменты - вещества белковой природы, в смеси с другими  белками их количество определить практически  невозможно. Наличие фермента в препарате  может быть установлено лишь по протеканию той реакции, которую катализирует фермент. При этом количественную оценку содержания фермента можно дать, определив  либо количество образовавшихся продуктов  реакции, либо количество израсходовавшегося субстрата. За единицу активности фермента принимают то его количество, которое  катализирует превращение одного микромоля субстрата в 1 минуту при заданных стандартных условиях - стандартная единица активности.

По решению Международного биохимического союза активность решено определять при t = 30оС по начальной скорости реакции, когда концентрация насыщения фермента и временная зависимость близка к кинетике реакции нулевого порядка. Остальные параметры реакции индивидуальны для каждого фермента. Активность ферментного препарата выражается в микромолях субстрата, прореагировавшего под действием 1 мл ферментного раствора или 1 грамма препарата в оптимальных условиях за 1 минуту. Если ферментный препарат не содержит балласта, то его активность выражается в тех же стандартных единицах на 1 мг фермента. Если же есть балласт, то активность считается на 1 мг белка в ферментном препарате. Активность выпускаемого препарата - важнейший нормируемый показатель качества.

Основную часть ферментов, получаемых промышленным способом, составляют гидролазы. К ним относятся, в  первую очередь амилолитические ферменты: б-амилаза, в-амилаза, глюкоамилаза. Их основная функция - гидролиз крахмала и гликогена. Крахмал при гидролизе расщепляется на декстрины, а затем до глюкозы. Эти ферменты применяются в спиртовой промышленности, хлебопечении.

Протеолитические ферменты образуют класс пептидгидролаз. Их действие заключается в ускорении гидролиза пептидных связей в белках и пептидах. Важная их особенность - селективный характер действия на пептидные связи в белковой молекуле. Например, пепсин действует только на связь с ароматическими аминокислотами, трипсин - на связь между аргинином и лизином. В промышленности протеолитические ферменты классифицируют по способности проявлять активность в определенной области рН:

рН 1.5 - 3.7 - кислые протеазы;

рН 6.5 - 7.5 - протеазы;

pH > 8.0 - щелочные протеазы.

Протеазы находят широчайшее применение в разных отраслях промышленности:

мясная - для смягчения  мяса;

кожевенная - смягчение шкур;

кинопроизводство - растворение  желатинового слоя при регенерации  пленок;

парфюмерная - добавки в зубную пасту, кремы, лосьоны;

производство моющих средств - добавки для удаления загрязнений  белковой природы;

медицина - при лечении  воспалительных процессов, тромбозов  и т.д.

Пектолитические ферменты уменьшают молекулярную массу и снижают вязкость пектиновых веществ. Пектиназы делятся на две группы - гидролазы и трансэлиминазы. Гидралазы отщепляют метильные остатки или разрывают гликозидные связи. Трансэлиминазы ускоряют негидролитическое расщепление пектиновых веществ с образованием двойных связей. Применяются в текстильной промышленности (вымачивание льна перед переработкой), в виноделии - осветление вин, а также при консервировании фруктовых соков.

Целлюлолитические ферменты очень специфичны, их действие проявляется в деполимеризации молекул целлюлозы. Обычно используются в виде комплекса, доводящего гидролиз целлюлозы до глюкозы (в гидролизной промышленности). В медицинской промышленности их используют для выделения стероидов из растений, в пищевой - для улучшения качества растительных масел, в сельском хозяйстве - как добавки в комбикорма для жвачных животных.

Существует ряд факторов, влияющих на биосинтез ферментов. В  первую очередь, к ним относится  генетический. Состав и количество синтезируемых ферментов наследственно детерминированы. Применяя мутагены можно изменить генетические свойства микроорганизмов и получить штаммы с ценными для промышленности свойствами. К мутагенным факторам относятся ионизирующее и неионизирующее излучения, изотопы, антибиотики, другие химические соединения, преобразующие наследственные элементы клетки. Несмотря на определяющую роль генетического фактора в биосинтезе ферментов, производительность биотехнологических процессов зависит и от состава питательной среды. При этом важно не только наличие источников основных питательных веществ, но и веществ, играющих роль индукторов или репрессоров биосинтеза данного конкретного фермента или их групп. Механизм этого явления еще не вполне изучен, но сам факт должен учитываться при выборе технологии.

Рассмотрим несколько  примеров. Фермент липаза почти не синтезируется грибом Aspergillus awamori на среде без индуктора, добавление жира кашалота усиливает биосинтез фермента в сотни раз. При добавлении же в среду крахмала и при полном исключении минерального фосфора интенсивно синтезируется фосфатаза. Не только наличие индуктора способно увеличивать выход фермента. Важную роль играет состав питательной среды и условия культивирования. При разработке процесса биосинтеза a-амилазы культурой Aspergillus oryzae замена сахарозы (как источника углерода) на крахмал увеличила активность фермента в 3 раза, добавление солодового экстракта (из проросших семян злаковых) ещё в 10 раз, а повышение концентрации основных элементов питательной среды на 50% - ещё в 2 раза.

Для интенсификации процесса роста и синтеза ферментов  добавляют различные факторы  роста, например, аминокислоты, пуриновые  основания и их производные, РНК  и продукты её гидролиза. В качестве источника углерода используют крахмал, кукурузный экстракт, соевую муку, гидролизаты биомассы дрожжей. Микроорганизмы могут утилизировать и минеральные источники азота. В состав питательных сред входят и ионы MG, Mn, Zn, Fe, Cu и др. металлов. Механизм действия большинства из них неизвестен. Некоторые входят в состав фермента. Ионы Ca повышают устойчивость a-амилазы, ионы Fe и Mg активизируют и стабилизируют протеолитические ферменты.

Оптимальный состав питательной  среды для каждого продуцента может быть определен двумя способами: эмпирический и построение математической модели с использованием компьютера. Последний, естественно, предпочтительнее. По характеру культивирования все  технологические процессы производства ферментных препаратов делятся на две большие группы: глубинный и поверхностный методы.

2. Глубинный метод производства ферментов

В этом случае микроорганизмы выращиваются в жидкой питательной  среде. Технически более совершенен, чем поверхностный, так как легко поддается автоматизации и механизации. Концентрация фермента в среде при глубинном культивировании обычно значительно ниже, чем в водных экстрактах поверхностной культуры. Это вызывает необходимость предварительного концентрирования фильтрата перед его выделением.

При глубинном культивировании  продуцентов ферментов выделяют, как и в любом биотехнологическом процессе, 5 этапов.

1. Приготовление питательных  сред зависит от состава компонентов.

Некоторые предварительно измельчают, отваривают или гидролитически расщепляют. Готовые к растворению компоненты подают при постоянном помешивании в емкость для приготовления среды в определенной последовательности. Стерилизацию среды проводят либо путем микрофильтрации с помощью полупроницаемых мембран, либо при помощи высоких температур. Время обработки в этом случае зависит как от интенсивности фактора, так и от уровня обсемененности объекта. Стерилизуются также все коммуникации и аппараты. Воздух очищается до и после аэрирования. До - потому что содержит частицы пыли органической и неорганической природы, после - так как несет клетки продуцента.

2. Получение засевного материала.

Для засева питательной среды  материал готовят также глубинным  методом. Вид его зависит от продуцента: для грибов это мицелиальная вегетативная масса, для бактерий - молодая растущая культура на начальной стадии спорообразования. Получение посевного материала состоит в увеличении массы продуцента в 3-4 стадии. Объем посевного материала зависит от физиологических особенностей продуцента. Если продуцент размножается только вегетативно, он резко возрастает (до 5-20%). Если же происходит обильное спороношение - сокращается до 1%.

3. Производственное культивирование.

Биосинтез ферментов в  глубинной культуре протекает в  течение 2-4 суток при непрерывной  подаче воздуха и перемешивании. Высокая концентрация питательных веществ на первых этапах могут тормозить рост биомассы продуцента, поэтому часто свежая среда или некоторые её компоненты вводятся в ферментер на стадии активного роста. Температурный оптимум находится в интервале 22-32оС. В современных технологических процессах ведется непрерывное автоматическое определение содержания в среде углеводов, количества образовавшихся метаболитов и концентрации клеток. Данные поступают в компьютер, который определяет стратегию коррекции процесса и автоматически регулирует его. Этим достигается максимальная производительность и наилучшее качество продуктов.

4. Выделение.

В мицелии трёхсуточной культуры обычно остается не более 15% ферментов. Остальные выделяются в окружающую клетки жидкую среду. В этом случае препараты ферментов выделяют из фильтратов после отделения биомассы.

5. Получение товарной  формы.

3. Производство ферментов при поверхностном культивировании продуцентов

При поверхностном методе культура растет на поверхности твердой  увлажненной питательной среды. Мицелий полностью обволакивает и довольно прочно скрепляет твердые  частицы субстрата, из которого получают питательные вещества. Поскольку  для дыхания клетки используют кислород, то среда должна быть рыхлой, а слой культуры-продуцента небольшим.

Выращивание производственной культуры происходит обычно в асептических условиях, но среду и кюветы необходимо простерилизовать. Перед каждой новой загрузкой также необходима стерилизация оборудования. Преимущества поверхностной культуры: значительно более высокая конечная концентрация фермента на единицу массу среды (при осахаривании крахмала 5 кг поверхностной культуры заменяют 100 кг культуральной жидкости), поверхностная культура относительно легко высушивается, легко переводится в товарную форму.

Посевной материал может  быть трёх видов:

- культура, выросшая на  твердой питательной среде;

- споровый материал;

- мицелиальная культура, выращенная глубинным способом.

В три этапа получают и  посевную культуру. Сначала музейную культуру продуцента пересевают на 1 - 1.5 г увлажненных стерильных пшеничных  отрубей в пробирку и выращивают в термостате до обильного спорообразования. Второй этап - аналогично, но в колбах, третий - в сосудах с 500 г среды. Основу питательной среды составляют пшеничные отруби, как источник необходимых  питательных и ростовых веществ. Кроме того, они создают необходимую  структуру среды. Для повышения  активности ферментов к отрубям  можно добавлять свекловичный жом, соевый шрот, крахмал, растительные отходы. Стерилизуют среду острым паром  при помешивании (температура - 105-140 С, время 60-90 минут). После этого среду засевают и раскладывают ровным слоем в стерильных кюветах. Кюветы помещают в растильные камеры. Культивируют в течение 36-48 часов. Рост делится на три периода, примерно равных по времени. Сначала происходит набухание конидий и их прорастание (температура не ниже 28о С), затем рост мицелия в виде пушка серовато-белого цвета (необходимо выводить выделяемое тепло) и образование конидий. Для создания благоприятных условий роста и развития продуцента необходима аэрация и поддержание оптимальной влажности (55-70%).

Выросшая в неподвижном  слое при поверхностном культивировании  культура представляет корж из набухших частиц среды, плотно связанных сросшимся  мицелием. Массу размельчают до гранул 5-5 мм. Культуру высушивают до 10-12% влажности  при температурах не выше 40оС, не долее 30 минут. Иногда препарат применяют  прямо в неочищенном виде - в  кожевенной и спиртовой промышленности. В пищевой и особенно медицинской  промышленности используются ферменты только высокой степени очистки.

Схема очистки сводится к  следующему:

- освобождение от нерастворимых  веществ;

- освобождение от сопутствующих  растворимых веществ;

- фракционирование (как правило,  хроматографическими методами).

Для выделения фермента из поверхностной культуры необходима экстракция. Как правило, экстраген - вода. При этом в раствор переходят сахара, продукты гидролиза пектиновых веществ и целлюлозы. Стадию выделения и очистки завершает сушка. После сушки препарат должен содержать не более 6-8% влаги, тогда он может в герметичной упаковке храниться до года без потери активности. Стандартизация ферментного препарата - доводка активности фермента до стандартной, соответствующей требованиям ГОСТ. Для этого используются различные нейтральные наполнители - крахмал, лактоза и др. Учитывая огромные перспективы применения ферментных препаратов в различных отраслях промышленности и сельского хозяйства, медицине, можно сделать заключение о необходимости расширения исследований в этой области для оптимизации технологии и гарантийного получения высокоактивных и стабильных препаратов микробных ферментов.

4. Иммобилизация ферментов

Общая характеристика иммобилизованных ферментов

В современной биотехнологии  одно из видных мест принадлежит ферментам. Ферменты и ферментные системы широко используются в различных отраслях промышленности, медицине, сельском хозяйстве, химическом анализе и т.д.

Ферменты - вещества белковой природы и поэтому неустойчивы  при хранении, а также чувствительны  к тепловым воздействиям. Кроме того, ферменты не могут быть использованы многократно из-за трудностей в отделении  их от реагентов и продуктов реакции. Решить эти проблемы помогает создание иммобилизованных ферментов. Начало этому  методу было положено в 1916 году, когда  Дж.Нельсон и Е.Гриффин адсорбировали на угле инвертазу и показали, что она сохраняет в таком виде каталитическую активность. Сам термин "иммобилизованные ферменты узаконен в 1971 году, и означает любое ограничение свободы передвижения белковых молекул в пространстве.

Сущность иммобилизации  ферментов -- прикрепление их в активной форме к нерастворимой основе или заключение в полупроницаемую мембранную систему. Прикрепление фермента к носителю осуществляется адсорбционно, химической связью или путем механического включения фермента в органический или неорганический гель (в капсулу и т. п.). При этом допускается прикрепление фермента только за счет функциональных групп, не входящих в активный центр фермента и не участвующих в образовании фермент-субстратного комплекса. Носитель фермента или матрица может иметь вид зернистого материала, волокнистой структуры, пластинчатой поверхности, пленок или тканей, полых волокон, трубочек, капсул и т. д. Имеет значение размер частиц носителя. Важно иметь большую поверхность, поэтому рекомендуются небольшие частицы диаметром 0,1--0,2 мм. Носитель фермента может быть как природное вещество, так и синтетический полимер. Преимущества иммобилизованных ферментов перед нативными предшественниками:

1. Гетерогенный катализатор  легко отделим от реакционной  среды, что дает возможность  остановить реакцию в любой  момент, использовать фермент повторно, а также получать чистый от  фермента продукт.

2. Ферментативный процесс  с использованием иммобилизованных  ферментов можно проводить непрерывно, регулируя скорость катализируемой  реакции и выход продукта.

3. Модификация фермента  целенаправленно изменяет его  свойства, такие как специфичность  (особенно в отношении макромолекулярного  субстрата), зависимость каталитической  активности от рН, ионного состава и других параметров среды, стабильность к денатурирующим воздействиям.

4. Можно регулировать  каталитическую активность иммобилизованных  ферментов путем изменения свойств  носителя действием физических  факторов, таких как свет и  звук. Иммобилизовать ферменты можно  как путем связывания на нерастворимых  носителях, так и путем внутримолекулярной  или межмолекулярной сшивки белковых  молекул низкомолекулярными бифункциональными соединениями, а также путем присоединения к растворимому полимеру

5. Классификация носителей для ферментов

Для получения иммобилизованных ферментов используется ограниченное число как органических, так и  неорганических носителей. К носителям  предъявляются следующие требования (Дж.Порат, 1974):

высокая химическая и биологическая  стойкость;

высокая химическая прочность;

достаточная проницаемость  для фермента и субстратов, пористость, большая удельная поверхность;

возможность получения в  виде удобных в технологическом  отношении форм (гранул, мембран);

легкая активация;

высокая гидрофильность;

невысокая стоимость.

Классификация носителей  схематично представлена на рисунке

Классификация носителей  для иммобилизованных ферментов

Следует отметить, что органические носители (как низко-, так и высокомолекулярные) могут быть природного или синтетического происхождения. Природные полимерные органические носители делят в соответствии с их биохимической классификацией на 3 группы: полисахаридные, белковые и липидные. Синтетические полимеры также можно разделить на группы в связи с химическим строением основной цепи макромолекул: полиметиленовые, полиамидные, полиэфирные.

Для иммобилизации ферментов  наиболее широко используются природные  полисахариды и синтетические носители полиметильного типа, остальные применяются значительно реже. Большое значение природных полимеров в качестве носителей для иммобилизации объясняется их доступностью и наличием реакционно-способных функциональных групп, легко вступающих в химические реакции. Характерной особенностью этой группы носителей также является их высокая гидрофильность. Недостаток природных полимеров - неустойчивость к воздействию микроорганизмов и довольно высокая стоимость. Наиболее часто для иммобилизации используются такие полисахариды, как целлюлоза, декстран, агароза и их производные. Целлюлоза гидрофильна, имеет много гидроксильных групп, что позволяет модифицировать её, замещая эти группы. Для увеличения механической прочности целлюлозу гранулируют путем частичного гидролиза, в результате которого разрушаются аморфные участки. На их место для сохранения пористости между кристаллическими участками вводят химические сшивки. Гранулированную целлюлозу довольно легко превратить в различные ионообменные производные, такие как ДЭАЭ-целлюлоза, КМЦ и т.д.

Широко распространены носители на основе декстрана, выпускаемые под  названием "сефадексы". При высушивании они легко сжимаются, в водном растворе сильно набухают. В этих носителях размер пор в геле регулируется степенью сшитости. К группе декстранов относят и крахмал. Химически модифицированный крахмал сшивается агентами, такими как формальдегид. Таким способом был получен губчатый крахмал, обладающий повышенной устойчивостью по отношению к ферментам, гидролизу. Водорастворимые препараты на основе декстрана часто применяются как носители лекарственных средств в медицине.

Хорошим носителем считается  агар. Его свойства улучшаются после химической сшивки, например, диэпоксидными соединениями. Такой агар становится устойчивым к нагреванию, прочен, легко модифицируется.

Белки в качестве носителей  обладают рядом достоинств: вместительны, способны к биодеградации, могут  применяться в качестве тонкой (толщиной 80 мкм) мембраны. Иммобилизацию ферментов  на белковых носителях можно проводить  как в отсутствие, так и в  присутствии сшивающих агентов. Белки используются и в фундаментальных  биологических исследованиях, и  в медицине. К недостаткам белков в качестве носителей относят  их высокую иммуногенность (за исключением  коллагена и фибрина). Наиболее для иммобилизации используются структурные (кератин, фибрин, коллаген), двигательные (миозин) и транспортные (альбумин) белки.

Синтетические полимерные носители применяются для ковалентной  и сорбционной иммобилизации  ферментов, для получения гелей, микрокапсул. Полимеры на основе стирола  применяются сорбционной иммобилизации. Они могут иметь макропористую, изопористую структуру, а также гетеропористую структуру. Для получения полимерных гидрофильных носителей широко используется акриламид - производное акриловой кислоты.

Широкое распространение  получил метод включения ферментов  и клеток в полиакриламидный гель, имеющий жесткую пространственную сетчатую структуру. Полиакриламидный гель устойчив к химическим воздействиям. Очень интересную группу представляют полиамидные носители. Это группы различных гетероцепных полимеров  с повторяющейся амидной группой  -С(О)-NH-. Например, полимеры на основе N-винилпирролидона используются для получения иммобилизованных ферментов, способных медленно распадаться в организме. Кроме того, они биологически инертны, что особенно важно при использовании в медицинских целях. Существенным недостатком большинства полимерных носителей является их способность накапливаться в организме. В этом отношении предпочтение отдается природным полимерам, которые гидролизуются ферментами. Поэтому в состав лекарственных препаратов часто входит декстран, а из синтетических носителей - полимеры на основе N-винилпирролидона. В настоящее время ведутся эксперименты по созданию синтетических полимеров, расщепляющихся с образованием нетоксичных продуктов обмена.

6. Методы иммобилизации ферментов

Существует два основных метода иммобилизации ферментов: физический и химический.

Физическая иммобилизация  ферментов представляет собой включение  фермента в такую среду, в которой  для него доступной является лишь ограниченная часть общего объема. При физической иммобилизации фермент  не связан с носителем ковалентными связями. Существует четыре типа связывания ферментов:

- адсорбция на нерастворимых  носителях;

- включение в поры геля;

- пространственное отделение  фермента от остального объема  реакционной системы с помощью  полупроницаемой перегородки (мембраны);

- включение в двухфазную  среду, где фермент растворим и может находиться только в одной из фаз.

Способы иммобилизации ферментов: а - адсорбция на нерастворимых носителях, б - включение в поры геля, в - отделение  фермента с помощью полупроницаемой  мембраны, г - использование двухфазной реакционной среды

Адсорбционная иммобилизация  является наиболее старым из существующих способов иммобилизации ферментов, начало ей было положено еще в 1916 г. Этот способ достаточно прост и достигается  при контакте водного раствора фермента с носителем. После отмывки неадсорбировавшегося белка иммобилизованный фермент готов к использованию. Удерживание адсорбированной молекулы фермента на поверхности носителя может обеспечиваться за счет неспецифических ван-дер-ваальсовых взаимодействий, водородных связей, электростатических и гидрофобных взаимодействий между носителем и поверхностными группами белка. Вклад каждого из типов связывания зависит от химической природы носителя и функциональных групп на поверхности молекулы фермента. Взаимодействия с носителем могут оказаться настолько сильными, что сорбция биокатализатора может сопровождаться разрушением его структуры. Например, при адсорбции некоторых растительных клеток на гранулах цитодекса клеточная стенка деформируется, повторяя рельеф поверхности частиц носителя. Преимуществом метода адсорбционной иммобилизации является доступность и дешевизна сорбентов, выступающих в роли носителей. Им также можно придать любую конфигурацию и обеспечить требуемую пористость. Важным фактор - простота применяемых методик. При адсорбционном связывании можно решить и проблему очистки фермента, так как связывание белка с носителем во многих случаях достаточно специфическое. К сожалению, прочность связывания фермента с носителем не всегда достаточно высока, что ограничивает применение метода. К недостаткам адсорбционной иммобилизации следует отнести отсутствие общих рекомендаций, позволяющих сделать правильный выбор носителя и оптимальных условий иммобилизации конкретного фермента.

Некоторых из перечисленных  затруднений можно избежать при  иммобилизации ферментов путем  включения в гели. Суть этого метода иммобилизации состоит в том, что молекулы фермента включаются в  трехмерную сетку из тесно переплетенных  полимерных цепей, образующих гель. Среднее  расстояние между соседними цепями в геле меньше размера молекулы включенного  фермента, поэтому он не может покинуть полимерную матрицу и выйти в  окружающий раствор, т.е. находится  в иммобилизованном состоянии. Дополнительный вклад в удерживание фермента в сетке геля могут вносить также ионные и водородные связи между молекулой фермента и окружающими ее полимерными цепями. Пространство между полимерными цепями в геле заполнено водой, на долю которой обычно приходится значительная часть всего объема геля. Например, широко применяемые гели полимеров акриловой кислоты в зависимости от концентрации полимера и его природы содержат от 50 до 90% воды.

Для иммобилизации ферментов  в геле существует два основных способа. При одном из них фермент помещают в водный раствор мономера, а затем  проводят полимеризацию, в результате чего образуется полимерный гель с  включенными в него молекулами фермента. В реакционную смесь часто  добавляют также бифункциональные (содержащие в молекуле две двойные связи) сшивающие агенты, которые придают образующемуся полимеру структуру трехмерной сетки. В другом случае фермент вносят в раствор готового полимера, который затем каким-либо образом переводят в гелеобразное состояние. Способ иммобилизации ферментов путем включения в полимерный гель позволяет создавать препараты любой геометрической конфигурации, обеспечивая при этом равномерное распределение биокатализатора в объеме носителя. Метод универсален, применим для иммобилизации практически любых ферментов, полиферментных систем, клеточных фрагментов и клеток. Фермент, включенный в гель, стабилен, надежно защищен от инактивации вследствие бактериального заражения, так как крупные клетки бактерий не могут проникнуть в мелкопористую полимерную матрицу. В то же время, эта матрица может создавать значительные препятствия для диффузии субстрата к ферменту, снижая каталитическую эффективность иммобилизованного препарата, поэтому для высокомолекулярных субстратов данный метод иммобилизации не применим вообще.

Общий принцип иммобилизации  ферментов с использованием мембран  заключается в том, что водный раствор фермента отделяется от водного  раствора субстрата полупроницаемой  перегородкой. Полупроницаемая мембрана легко пропускает небольшие молекулы субстрата, но непреодолима для крупных  молекул фермента. Существующие модификации  этого метода различаются лишь способами  получения полупроницаемой мембраны и ее природой. Водный раствор фермента можно включать внутрь микрокапсул, представляющих собой замкнутые  сферические пузырьки с тонкой полимерной стенкой (микрокапсулирование). При двойном эмульгировании получается водная эмульсия из капель органического раствора полимера, содержащих, в свою очередь, еще более мелкие капли водного раствора фермента. Через некоторое время растворитель затвердевает, образуя сферические полимерные частицы с иммобилизованным в них ферментом. Если вместо водонерастворимого отвердевающего полимера используются жидкие углеводороды с высокой молекулярной массой, метод называется иммобилизацией путем включения в жидкие мембраны. К модификациям метода иммобилизации ферментов с использованием полупроницаемых оболочек относятся также включение в волокна (при этом вместо капель, содержащих ферменты, получаются нити) и включение в липосомы. Применение систем мембранного типа позволяет получать иммобилизованные препараты с высоким содержанием фермента. Метод, как и предыдущий, достаточно универсален, т.е. применим как ферментам, так и к клеткам, а также их фрагментам. Благодаря высокому отношению поверхности к объему и малой толщине мембраны удается избежать значительных диффузионных ограничений скорости ферментативных реакций. Основной недостаток мембранных систем - невозможность ферментативного превращения высокомолекулярных субстратов.