Ирина Эланс

Автор который поможет с любыми образовательными и учебными заданиями

Технология производства тетрациклина

МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

федеральное Государственное бюджетное образовательное учреждение

высшего профессионального образования

«Поволжский государственный технологический университет»

КУРСОВАЯ РАБОТА

По дисциплине: «Теоретические основы биотехнологии»

На тему: «Технология производства тетрациклина»

Выполнила: ст. гр. БТ-21

Андреева И.В.

Проверила: Криворотова Т.Н.

Йошкар-Ола

2014

Содержание

Введение.

Применение тетрациклина.

Общие сведения о производстве тетрациклина.
Природа тетрациклина. Их назначение в практической деятельности человека.

Технология получения тетрациклина.

Методы культивирования продуцента тетрациклина.
Ферментеры.
Приготовление и стерилизация питательной среды.
Подготовка почвенного материала.
Развитие продуцента тетрациклина в ферментёрах.
Предварительное образование культуральной жидкости, выделение и химическая очистка тетрациклина.
Сушка, контроль и расфасовка препарата.

Биологическая безопасность и характеристика условий работающих на производстве тетрациклина.
Отходы производства и охрана окружающей среды при производстве тетрациклина.

Основные отходы.
Охрана окружающей среды.

Заключение.

Список литературы.

Введение

Биотехнология – интегрированное использование биохимии, микробиологии и биоинженерии для промышленной реализации потенциальных возможностей микроорганизмов, культур клеток, тканей или отдельных их .Основной целью биотехнологии является получение максимального количества целевых продуктов в границах генетически детерминирующих свойств биологического агента за счет оптимизации факторов окружающей среды.

Производство антибиотиков занимает одно из ведущих мест в современной медицинской биотехнологии и относится к отраслям, сфера применения которых постоянно растет. Это связано с тем, что антибиотики, являясь веществами и образуемые микроорганизмами или получаемые из других природных источников, обладают антибактериальным, антивирусным и противоопухолевым действием. Они вмешиваются в обмен белков, нуклеиновых кислот и в энергетические процессы пораженных организмов и клеток, избирательно воздействуя на определенные молекулярные механизмы.

Создание новой биотехнологии производства антибиотиков опирается на достижение молекулярной биологии, молекулярной генетики и генной инженерии. В настоящее время разрабатывается перспективное направление, основанное на предположении о биосинтезе антибиотиков или их отдельных ключевых структур, например трипептида d-L-a-аминоадитинил-L-цистеинил-D-валина, при биосинтезе пенициллинов и цефалоспоринов, поликетидном синтезе углеродного скелета тетрациклинов, агликонов у макролидов и в других случаях, в мультиферментных комплексах, являющихся вторичным продуктом полигенного оперона транскрипта, как это уже установлено для антибиотиков, имеющих пептидное строение, а также для ферментов, катализирующих реакции основных путей метаболизма.

Создание новой биотехнологии производства антибиотиков предполагает возможность использования мощных индукторов биосинтеза нуклеиновых кислот и белков-ферментов, вследствие чего резко увеличивается концентрация первичных метаболитов, из которых при участии соответствующих ферментов образуются антибиотики.

За последние годы фармацевтическая наука достигла значительных успехов: разработаны научные основы и созданы более перспективные технологии при получении лекарственных средств, в производство внедрено современное технологическое оборудование, используются новые группы лекарственных и вспомогательных веществ, созданы высокоэффективные лекарственные препараты.

Дальнейшее развитие фармацевтической отрасли предусматривает углубление и совершенствование знаний об основных аппаратах и технологических линиях фармацевтического производства, дальнейшее внедрение прогрессивных технологий, разрешение наиболее сложных проблем гидродинамических, тепловых, массообменных и других процессов.

Рациональное приготовление лекарственных препаратов, создание их новых видов, изыскание более совершенных методов производства требуют глубоких знаний отдельных технологических операций .

В промышленных условиях выпускаются различные антибиотики. Биосинтез антибиотиков происходит в клетках, прошедших стадию интенсивного роста (трофофазу), то есть в микроорганизмах, прекративших рост (идиофазу). В связи с этим антибиотики относятся к метаболитам-идиолитам. Они в неблагоприятных условиях подавляют рост конкурирующих микроорганизмов, обеспечивая тем самым более благоприятные условия для выживания микроба-продуцента того или иного антибиотика. Значение процесса антибиотикообразования в жизнедеятельности микробной клетки подтверждается тем, что у тетрациклинов около 1% геномной ДНК приходится на долю генов, кодирующих ферменты биосинтеза антибиотиков, которые в течение продолжительного времени могут не экспрессироваться.

Тетрациклин относится к группе антибиотиков, получаемые из стрептомицетов, который выпускается как на Украине, так и за рубежом. Эти антибиотики обладают широким спектром антимикробного действия: бактериостатическое или фунгиостатическое, задерживающее рост и развитие бактерий или грибов. Механизм действия: нарушают синтез белка.

Тетрациклины широко распространены в природе, которые синтезируются микроорганизмами на среде, содержащей кукурузную муку, кукурузный экстракт, а также другие питательные вещества, обусловливающие биосинтез антибиотика.

Основными задачами курсового работы является: рассмотрение возможных вариантов технологических схем производства, выбор оптимальной технологической схемы; проанализировать процессы получения высокопродуктивных штаммов; рассмотрение влияния питательной среды на производственные процессы.

Присутствие биологического агента влияет на технологическое и аппаратурное оформление производства: необходимость ряда специфических условий герметизации и введения субстратов; соблюдения узких физико-химических показателей среды; учета влияния срезовых усилий. Таким образом, возникает необходимость описания культуральных и морфолого-физиологических показателей биологического агента.

Присутствие БАВ обуславливает специфику технологического оборудования. В связи с этим будут рассмотрены физико-химические свойства готового продукта – медицинского препарата тетрациклина, а также другие его характеристики.

Существует три способа получения антибиотиков:

1. биологический синтез, используя высокопродуктивные штаммы микроорганизмов;

2. химический синтез. С помощью этого метода получают все синтетические антибиотики.

3. Комбинированный способ.

Применение тетрациклина.

Общие сведения о производстве тетрациклина.

В производстве тетрациклина применяют микробиологический синтез, который возможно проводить одним из способов культивирования: глубинное или поверхностное. В настоящее время поверхностное культивирование не считается перспективным. По сравнению с ним глубинное культивирование имеет ряд преимуществ: при его применении возможно изменять состав питательной среды в широком интервале значений концентраций различных компонентов, достигая при этом максимального выхода целевого продукта с единицы объема ферментационного оборудования; в технологическом процессе значительно сокращается доля ручного труда; он требует меньше затрат на организацию процессов автоматизации стадии ферментации; дает возможность упростить последующую переработку биомассы микроорганизмов с целью выделения и очистки готового. Все перечисленные достоинства привели к тому, что в настоящее время для получения антибиотиков преимущественно используют глубинный метод культивирования продуцентов. В качестве продуцента тетрациклина используют Streptomyces aurefaciens.

Получение антибиотиков определенной активности диктуется требованиями отраслей экономики – их потребителей. Так, например, тетрациклин применяют в таблетированной форме или в виде мази. В зависимости от назначения и способа применения выбирают и соответствующую схему очистки, а схема биосинтеза остается постоянной, не зависящей от функционального предназначения медицинского препарата. На стадии культивирования только определенные факторы влияют на выход продукта и его активность.

Природа тетрациклина. Их назначение в практической деятельности человека.

Тетрациклин является солью тетрациклина основания, продуцируемого грибами Streptornyces aureofaciens.

Это желтый кристаллический порошок горьковатого вкуса, хорошо растворим в воде. В сухом состоянии он устойчив, но в водных растворах, особенно имеющих нейтральную или основную реакцию, быстро разлагается, мутнеет и теряет антимикробную активность. При нагревании растворы разлагаются, поэтому их нельзя стерилизовать нагреванием. Растворы для парентерального введения должны применяться непосредственно после их приготовления. Антибиотик разрушается кислотами, основаниями, окислителями, солями кальция, магния и особенно тяжелых металлов. Не совместим со стрептомицином, поскольку их сочетание обладает повышенной токсичностью и может вызвать жировое перерождение печени. Тетрациклин устойчив к действию желудочного сока и пищеварительных ферментов. Ввиду этого и местного раздражающего ткани действия, назначают парентерально и внутрь через рот, реже — ректально.

Тетрациклин обладает широким спектром антимикробного действия, охватывающим многие виды грамположительных и грамотрицательных бактерий, спирохеты, лептоспиры, риккетсии, многие штаммы микоплазм, хламидии и некоторых простейших (амебы, трихомонады, кокцидии и др.). Устойчивы микобактерии туберкулеза, многие штаммы синегнойной палочки и протея, грибы, вирусы.

Чувствительны патогенный стафилококк, стрептококк и другие кокки, различные энтеробактерии, бруцеллы, листерии, пастереллы, возбудители газовой гангрены, сибирской язвы, дифтерии, коклюша, холеры, гемофильная палочка инфлюэнцы, актиномицеты. Хотя устойчивость к нему развивается сравнительно медленно, но среди. бактерий чувствительных видов, особенно стафилококка, шигелл, эшерихий и клебсиелл, в настоящее время наблюдается значительное количество (80—90 %) устойчивых к тетрациклинам штаммов. Это значительно уменьшает их эффективность в настоящее время, а следовательно, и применение. Между различными, тетрациклинами отмечается перекрестная устойчивость (но не к остальным химиотерапевтическим препаратам).

На чувствительные микроорганизмы оказывает бактериостатическое действие, бактерицидное отмечается только при концентрациях, в 50—100 раз превышающих концентрации бактериостатические.Тетрациклин быстро всасывается в пищевом канале, преимущественно в тонких кишках, меньше в толстых, однако не полностью: до 15 % выделяется с испражнениями. Ионы кальция, магния, железа и алюминия, различные антациды, а также молоко и молочные продукты несколько уменьшают всасывание в результате образования нерастворимых хелатных соединений. Молоко и молочные продукты уменьшают количество и тяжесть иногда наблюдаемых диспепсических явлений. Наличие в кишках пищи также ослабляет всасывание тетрациклина. После приема тетрациклина в крови и различных органах быстро появляются значительные его концентрации. Максимальное содержание в крови отмечается через 2—3 ч после приема и сохраняется в течение 8—12 ч. Он быстро проникает в большинство тканей и органов (костную ткань, ткани глаза, за исключением хрусталика, печень, почки, легкие, поджелудочную, предстательную и щитовидную железы). Особенно высокие концентрации определяются в почках, печени, затем в легких и лимфатических узлах. Проникает в плевральную и асцитическую жидкость и внутрь лейкоцитов. Накапливается в костях и воспаленных тканях. Слабо проникает в спинномозговую жидкость, в которой отмечается до 5—10%, а при менингите — до 15—25% наблюдаемого в крови, с максимальным содержанием через 6—12 ч. Хорошо проникает в плод, где может оказывать отрицательное побочное, а иногда даже тератогенное действие. Тетрациклин характеризуется тропизмом к молодым, активно растущим тканям. Проникает и в клетки чувствительных микроорганизмов. Из организма выделяется быстро, в основном с мочой (15— 25 % введенной дозы), образуя в ней высокие концентрации (до 50—300 мкг/мл), иногда в 50—100 раз превышающие содержание в крови. Часть антибиотика выделяется с желчью, в которой могут наблюдаться концентрации, в 5—10 раз превышающие содержание в крови. Хорошо проникает в молоко, образуя концентрации 50— 200 мг в 100 мл, поэтому препарат не следует назначать кормящим женщинам. У новорожденных тетрациклин выделяется значительно слабее, чем у детей старших возрастных групп. Большая часть подвергается в организме инактивированию и выделяется в неактивном состоянии. Выраженным кумулятивным действием не обладает, но в некоторых органах может накапливаться, особенно в костной ткани и печени, в меньшей степени в почках и легких.

Технология получения тетрациклина.

2.1 Методы культивирования продуцента тетрациклина.

В современных условиях наиболее перспективным методом выращивания микроорганизмов — продуцентов антибиотиков признан метод глубинного культивирования. Метод состоит в том, что микроорганизм развивается в толще жидкой питательной среды, через которую непрерывно пропускается стерильный воздух, и среда перемешивается.

Можно указать четыре основные модификации глубинного способа выращивания микроорганизмов.

1) Периодическое культивирование. При этом способе весь процесс развития микроорганизмов полностью завершается в одном ферментере, после чего ферментер освобождается от культуральной жидкости, тщательно промывается, стерилизуется и вновь заполняется свежей питательной средой. Среда засевается изучаемым микроорганизмом, и процесс возобновляется.

2) Отъемный метод. Культивирование микроорганизмов осуществляется в ферментерах с периодическим отбором части объема культуральной жидкости (от 30 до 60% общего объема). Объем культуральной жидкости в ферментере при этом доводится свежей питательной средой до исходного уровня.

3) Батарейный способ. Развитие микроорганизмов проходит в ряду последовательно соединенных ферментеров. Культуральная жидкость на определенной стадии развития микроорганизма перекачивается из первого ферментера во второй, затем из второго — в третий.

Освобожденный ферментер немедленно заполняется свежей питательной средой, засеянной микроорганизмом. При этом способе выращивания микроорганизмов происходит более рациональное использование емкостей.

4) Непрерывное культивирование. Метод принципиально отличен от указанных модификаций глубинного культивирования продуцентов антибиотиков.

В основе этого метода лежит то, что развитие микроорганизма происходит в условиях непрерывного протока питательной среды, что позволяет поддерживать развитие микроорганизма на определенной стадии его роста

2.2 Ферментеры.

Для изучения условий образования антибиотиков и производства этих биологически активных веществ в промышленных масштабах применяются ферментеры — специальные герметически закрытые емкости, обеспечивающие глубинное выращивание продуцентов антибиотиков.

Ферментер — это довольно сложный аппарат, в котором создаются хорошие условия для глубинного развития продуцента и биосинтеза им антибиотика. В этих целях ферментер снабжен приспособлениями для достаточной аэрации и перемешивания культуры, поддержания необходимой температуры, а также контрольно-измерительными приборами.

Обеспечение культур микроорганизмов кислородом осуществляется в основном следующими способами: пропусканием воздуха через культуральную жидкость с одновременным ее перемешиванием; встряхиванием культуральной среды, находящейся в колбах, на специальных качалках; выращиванием микроорганизмов в виде пленки на поверхности питательной среды. [6]

Поддержание температуры, оптимальной для хорошего роста продуцента антибиотика и проявления им повышенной физиолого-биохимической активности, обеспечивается рубашкой ферментера или системой змеевиков. Змеевики используются также для подачи пара в процессе стерилизации или воды для охлаждения.

Наблюдение за основными процессами жизнедеятельности организма осуществляется контрольно-измерительной аппаратурой. Это позволяет поддерживать на заданном уровне температуру внутри ферментера, рН среды, количество пропускаемого воздуха, давление внутри ферментера и другие параметры. Применяются установки, позволяющие автоматически определять содержание азота в среде по ходу развития организма. Ферментеры снабжены приспособлениями для переноса инокулята, внесения дополнительных питательных веществ, необходимых для лучшего развития культуры, пеногасителя и устройством для взятия проб.

В современных ферментерах контрольно-измерительная аппаратура соединена с электронно-вычислительной машиной, что позволяет автоматически контролировать весь биосинтетический процесс по заданной программе.

В зависимости от характера проводимых работ используются различного типа ферментеры: лабораторные, полупроизводственные, производственные.

Лабораторные ферментеры изготовляются из стекла или нержавеющей стали и имеют, как правило, емкость не более 30 л. Обычно стерилизацию таких ферментеров производят в автоклавах. Питательную среду, как правило, стерилизуют отдельно, а затем переносят в стерильный ферментер.

Полупроизводственные ферментеры имеют емкость 100 л, выполнены из нержавеющей стали.

Производственные ферментеры. В промышленных условиях получения антибиотиков применяют ферментеры различной емкости — от 500 л до 50 и 100 м3.

Стерилизация полупроизводственных и производственных ферментеров, а также всех обслуживающих их коммуникаций осуществляется перегретым паром. Воздух, необходимый для аэрации, стерилизуется путем фильтрации через специальные фильтры, заполненные стеклянной ватой или активированным древесным углем.

Использование волокнистых фильтров — широко распространенный и экономически наиболее выгодный механический способ стерилизации воздуха, причем, чем меньший диаметр имеют волокна материала, тем лучше их фильтрующая способность.

2.3 Приготовление и стерилизация питательной среды.

Питательная среда – субстрат предназначенный для накопления, выделения, изучения и сохранения микроорганизмов.

Стерилизация является заключительной операцией при приготовлении любой питательной среды. Питательные среды после разливки их в сосуды чаще стерилизуют нагреванием — термостерилизацией. Перед стерилизацией сосуды (колбы, пробирки) с налитыми в них средами закрывают ватными пробкам предохраняющими их в дальнейшем от заражения микробами из вне. Стерилизация насыщенным паром под давлением. Такую стерилизацию проводят в автоклаве. Автоклав представляет собой двухстенный металлически котел, герметично закрывающийся крышкой. Между стенками котла находится вода. Стерилизуемые объекты ставят на дно автоклава. Автоклав снабжен манометром указывающим давление пара в котле, выпускным краном для выхода воздуха и пара и предохранительным клапаном, обеспечивающим выход пара при превышении заданного давления. Автоклав обогревается газом или электричеством. Образующийся при кипении воды пар поступает в котел через отверстия, имеющиеся в верхней части его внутренней стенки, и через выпускной края выходит, вытесняя из автоклава воздух. После полного вытеснения воздуха (при этом выделяется сильная сплошная струя пара) выпускной кран закрывают и в автоклаве постепенно повышается давление. Когда оно достигнет 1 атм (по манометру), подогрев регулируют, чтобы поддерживать давление на одном уровне в течение необходимого времени. При таком давлении водяной пар имеет температуру 120° С. При этой температуре выдерживают питательные среды (если объем их не более 0,5—1 л) в течение 20—30 мин. При таком режиме стерилизации погибают не только вегетативные клетки микроорганизмов, споры плесеней и дрожжей, но и бактериальные споры. По окончании стерилизации выключают источник нагрева, после того как стрелка манометра снизится до нуля, осторожно открывают выпускной кран, чтобы вытеснить из автоклава пар. Крышку автоклава открывают лишь после того, как он охладится.

Стерилизуют в автоклаве воду, мясо-пептонный бульон, дрожжевой автолизат, агаровые и другие среды, которые не претерпевают заметных изменений при темпетуре 120° С. Стерилизация текучим паром. Эта стерилизация бывает дробной, или последовательной. Она применяется чаще для питательных сред, которые могут заметно изменять свои свойства при стерилизации в автоклаве, например молоко, среды, содержащие сахара, желатин. Для стерилизации используется аппарат Коха (кипятильник Коха). Он представляет собой металлический цилиндр, покрытый изоляционным материалом, с двойным дном и неплотно закрывающейся крышкой, снабженной термометром. На дно цилиндра наливается вода. Над водой располагается металлическая подставка с отверстиями для прохождения пара, на которую помещают стерилизуемые питательные среды. Вода в аппарате нагревается газом или электричеством до 100°С. Образующийся пар (текучий), прогревает стерилизуемые материалы, выходит через специальное отверстие и неплотности крышки. Стерилизация производится дробно — в три приема три дня подряд по 30 мин ежедневно. Повторная стерилизация, вызывается тем, что при температуре 100° гибнут не все споры бактерий. В промежутках между нагревами (каждый — раз в сутки) питательная среда выдерживается в термостате при 25° С. За это время оставшиеся живыми споры прорастают в вегетативные клетки, которые и уничтожаются последующим нагревом при 100° С.

2.4 Подготовка почвенного материала.

Подготовка посевного материала — одна из ответственнейших операций в цикле биотехнологического метода получения тетрациклина. От количества и качества посевного материала зависит как развитие культуры в ферментере, так и биосинтез тетрациклина. Продуцент обычно тетрациклина выращивается на богатых по составу натуральных средах, способных обеспечить наивысшую физиологическую активность микроорганизмов. Подготовка посевного материала — процесс многоступенчатый. Микроорганизм предварительно выращивают на агаризированной среде в пробирке, затем из пробирки делают высев в колбы с жидкой питательной средой и проводят две генерации при глубинном выращивании на качалках в течение 2—3 суток для каждой генерации. Из второй генерации культуры в колбе делают посев в небольшой инокулятор, после чего хорошо развившуюся культуру переносят в более крупный инокулятор, откуда и производят посев в основном ферментере. Для посева в основной ферментер используют от 5 до 10 объемных процентов посевного материала (инокулята). Однако в случае получения пенициллина споровый материал гриба, приготовленный на отрубях, рисовых зернах или пшене, засевают сразу в инокулятор.

2.5 Развитие продуцента тетрациклина в ферментёрах.

Процесс развития микроорганизма в ферментерах проходит при строгом контроле всех его стадий, очень точно выполняется разработанный регламент условий развития организма — продуцента тетрациклина. Большое внимание уделяется поддержанию заданной температуры культивирования, активной кислотности среды, степени аэрации и скорости работы мешалки. В процессе развития организма осуществляется биологический контроль, учитывается потребление организмом основных питательных компонентов субстрата: источников углерода, азота, фосфора; внимательно следят за образованием антибиотика.

Существенное внимание при развитии продуцента в ферментерах обращают на процесс пеногашения. При продувании воздуха через культуру микроорганизма происходит обильное образование пены, которая существенно нарушает протекание всего процесса развития продуцента антибиотика в ферментере. Основная причина появления большого количества пены — наличие белковых веществ в среде и ее высокая вязкость, обусловленная обильным накоплением биомассы.

Для борьбы с пеной в ферментерах при антибиотикообразовании используют различные поверхностно-активные вещества: растительные масла, животный жир, а иногда минеральные масла, спирты и высшие жирные кислоты. Нередко в качестве пеногасителей используют специально синтезированные вещества.

Многие вещества (масла, жиры, спирты), используемые в качестве пеногасителей, потребляются продуцентами антибиотиков как дополнительные источники углеродного питания. При этом часто наблюдается повышение выхода тетрациклина. Однако внесение пеногасителя может снижать скорость растворения кислорода, что, в свою очередь, может отрицательно сказаться на развитии микроорганизма и его биосинтетической активности. Общая схема производства тетрациклина до стадии выделения и химической очистки представлена на рисунке 1.

Схема производства тетрациклина(рис1): I - приготовление посевного материала; II - инокуляторы для наращивания посевного материала; III - стерилизатор среды для большого ферментатора; IV - установка для биосинтеза антибиотика; а - стерилизация среды в колбах; б - охлаждение и посев культуры продуцента в колбу; в - рост культуры в покое; г - рост культуры в качалке; д - инокулятор со стерильной средой; е - инокулятор со средой, засеянной культурой продуцента; ж - фильтры и компрессор; з - резервуар со сжатым воздухом; и - нагрев воздуха; к - ферментатор; л - рубашка для охлаждения ферментатора.