Теоритические предпосылки формирования генной инженерии

                                              СОДЕРЖАНИЕ 

   Введение………………………………………………………………....2                                              

1. Теоретические предпосылки формирования генной инженерии……....3

  1.1.   Открытие двойной структуры ДНК и матричного синтеза………....3                  

2. Возможности генной инженерии..............................................................5                           

3. Области практического  применения генной  инженерии……………...6      

  1.1.   Создание трансгенных растений…………………………………....6                                                          

  1.2. Изменение свойств сельскохозяйственных технических растений…..7    

  1.3.Генетическая модификация пластид……………………………….....8                                                   

  1.4.   Генные вакцины. Актуальность разработки новых вакцин………….8                                                                                                                                  

  1.5. Разработка  ДНК-вакцин……………………………………………...9                                                                        

  1.6.   Генная инженерия человека………………………………………..10                                                                 

4. Молекулярная генетика наследственных патологий…………………10         

     4.1.   Наследственные болезни – объект обратной генетики……………..12                     

     4.2.   Транс- действующие мутации……………………………………...13                                                              

5. Проблематика генной инженерии……………………………………...14                                                                 

     5.1.   Потенциальная опасность генно–инженерных методов……………14                   

     5.2.   Биоэтика. Центральные постулаты биоэтического кодекса………...15              

     5.3.   Реальные опасности генной инженерии…………………………….16                                              

     5.4.   Этические проблемы генной инженерии……………………………17                                             

     5.5.   Юридические проблемы генной инженерии………………………...18                                        

  Заключение………………………………………………………………..19                                           

  Список литературы……………………………………………………......20                                     

ВВЕДЕНИЕ.

    Генная  инженерия - направление исследований в молекулярной биологии и генетике, конечной целью которых является получение с помощью лабораторных приемов организмов с новыми, в  том числе и не встречающимися в природе, комбинациями наследственных свойств. В основе генной инженерии лежит обусловленная последними достижениями молекулярной биологии и генетики возможность целенаправленного манипулирования с фрагментами нуклеиновых кислот. К этим достижениям следует отнести установление универсальности генетического кода, то есть факта, что у всех живых организмов включение одних и тех же аминокислот в белковую молекулу кодируются одними и теми же последовательностями нуклеотидов в цепи ДНК; успехи генетической энзимологии, предоставившей в распоряжение исследователя набор ферментов, позволяющих получить в изолированном виде отдельные гены или фрагменты нуклеиновой кислоты, осуществлять in vitro синтез фрагментов нуклеиновых кислот, объединить в единое целое полученные фрагменты. Таким образом, изменение наследственных свойств организма с помощью генной инженерии сводится к конструированию из различных фрагментов нового генетического материала, введение этого материала в реципиентный организм, создания условий для его функционирования и стабильного наследования. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

1. ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ ПРЕДПОСЫЛКИ ФОРМИРОВАНИЯ ГЕННОЙ ИНЖЕНЕРИИ.

    1.1. Открытие двойной  структуры ДНК  и матричного синтеза.

    Начальные работы американских учёных Уотсона  и Крика были произведены в 1953 году. Они дали возможность развиваться генной инженерии в качестве самостоятельного раздела науки. Эти открытия заключены в следующем:

    Была  открыта двойная структура ДНК  и постулирован её матричный синтез. Двойная спираль ДНК при репликации разделится, и вдоль нити ДНК специальные ферменты-полимеры собирают точные копии материнской ДНК, таким образом в клетке перед делением две совершенно одинаковые молекулы ДНК, одна из которых после деления клетки попадает в дочернюю клетку. Таким образом дочерняя клетка несет ту же самую информацию, что и материнская, следовательно выполняет те же самые функции. Итак, в клетках живого организма возможен особый тип реакции – матричный синтез. Одна молекула – матрица, а вторая строится по её программе, репликация ДНК, синтез всех видов РНК и сборка молекул белка, в соответствии со структурой и-РНК – это все варианты матричного синтеза, который происходит всегда при участии нуклеиновых кислот.

    По  тому же самому механизму осуществляется сборка РНК, только не двух спиралей, а  одной. Этот процесс получил название – транскрипция. Поток информации в клетке обеспечивает реакции матричного синтеза: репликация ДНК(необходима для передачи наследственной информации дочерним клеткам), транскрипция(синтез и-РНК в ядре клетки) и трансляция(сборка белковой цепи на и-РНК при помощи рибосомы).

    Казалось  бы, что на рубеже 70-х годов молекулярная биология достигла определённой степени  завершенности: были установлены структура  и механизм репликации ДНК, провозглашена  «центральная догма» экспрессии гена (транскрипция и трансляция), выявлены основные аспекты регуляции активности гена. В этот период главным объектом молекулярно-генетических исследований были микроорганизмы. Переход к эукариотам(включая человека) встретился с дополнительными проблемами и трудностями, и кроме того, существовавшие в то время методы не позволяли рассчитывать на получение принципиально новых результатов.

    Стремительный порыв в развитии молекулярной генетики в начале 70-х годов начался, благодаря появлению нового экспериментального инструмента – рестриктационных эндонуклеаз. Был открыт путь для широкомасштабного получения генных продуктов(физически значимых белков) и для генетического манипулирования с различными организмами. Наши знания о структуре генетического материала и эукариот, в разных областях, таких как: действие гена, популяционная генетика, эволюция и генетическая консультация, включая пренатальную диагностику. Достигнутые успехи заставили ученых задуматься об этической стороне манипулирования с человеческим зародышем  при  возникновении различных болезней в процессе генно-инженерных исследований. Многие из этих вопросов были подняты самими учеными, активно работающих в данной области. В настоящее время большинство исследователей считают, что опасения, касающиеся генной инженерии, не имеют достаточно оснований, но многие этические проблемы остаются нерешенными, и продолжают возникать новые.

    В прошлом, генетика и медицинская генетика развивались, как относительно независимые отрасли науки, теперь многие из их разделов оказались вовлечёнными в общее русло молекулярно-генетических исследований, и провести между ними грань достаточно трудно.

    Можно сделать заключение, что теоретическими предпосылками формирования генной инженерии как науки, явились:

    1.Открытие двойной спирали ДНК.

    2.Получение информации о матричном синтезе:

       Репликации ДНК.

       Транскрипции ДНК.

       Трансляции ДНК.

    3. Открытие плазмид.

    4. Открытие фрагментов рестриктаз.

    5. Осуществление процесса рекомбинации  хромосом

    6. Идентификация и анализ генов.

    7. Способность к гибридизации цепей ДНК.

    8. Секвенирование ДНК. 

    2. ВОЗМОЖНОСТИ ГЕННОЙ  ИНЖЕНЕРИИ.

    Значительный  прогресс достигнут в практической области создания новых продуктов  для медицинской промышленности и лечения болезней человека (табл.2).

    ТАБЛИЦА 2.

    Использование генно-инженерных продуктов в медицине.

    3. ОБЛАСТИ ПРАКТИЧЕСКОГО ПРИМЕНЕНИЯ ГЕННОЙ ИНЖЕНЕРИИ.

3.1. Создание трансгенных растений.

    Еще 10 лет тому назад биотехнология растений заметно отставала в своем развитии, но за последние 3 года наблюдается быстрый выброс на рынок трансгенных растений с новыми полезными признаками. Трансгенные растения в США в 1996 году занимали площадь 3 млн. акров, в 1997 году площадь увеличилась до 15 млн. акров, в 1998 году – до 60 млн. акров, а в прошлом году до 80 млн. акров. Поскольку основные трансгенные формы кукурузы, сои, хлопчатника с устойчивостью к гербицидам и насекомым хорошо себя зарекомендовали, есть все основания ожидать, что площадь под генно-иженерные растения в будущем (2001 году) увеличатся в 4-5 раз.

    Так как число жителей за последнее  столетие увеличилось с 1.5 до 5.5 млрд. человек, а к 2020 году предполагается вырост до 8 млрд., таким образом возникает  огромная проблема, стоящая перед человечеством. Эта проблема заключается в огромном увеличении производства продуктов питания, несмотря на то, что за последние 40 лет производство увеличилось в 2.5 раза, все равно этого не достаточно. И в мире в связи с этим наблюдается социальный застой, который становится все более настоятельным. Другая проблема возникла с медицинским лечением. Несмотря на огромные достижения современной медицины, производимые сегодня лекарственные препараты столь дороги, что большой % населения  Земли сейчас полностью полагается на традиционные донаучные методы лечения, прежде всего на неочищенные препараты растительного происхождения.

    В развитых странах лекарственные  средства на 25% состоят из природных  веществ, выделенных из растений. Открытия последних лет (противоопухолевые препараты: таксол, подофиллотоксин) свидетельствуют о том, что растения еще долго будут оставаться источником полезных биологически-активных веществ (БТА), и что способности растительной клетки к синтезу сложных БТА все еще значительно превосходят синтетические способности инженера-химика. Вот почему ученые взялись за проблему создания трансгенных растений.

3.2. Изменение свойств сельскохозяйственных технических растений.

    Современная биотехнология в состоянии манипулировать многими важнейшими признаками, которые можно разделить на три группы:

    Сельскохозяйственные  производства. К ним можно отнести  процент общей продуктивности растений за счет регулирования синтеза фитогормонов или дополнительного снабжения кислородом растительных клеток, а также признаки, обеспечивающие устойчивость к разного рода вредителям, кроме этого в создании форм растений с мужской стерильностью и возможностью дольше сберегать урожай.

3.3. Генетическая модификация пластид.

    Во  многих случаях генетической модификации будут подвергаться не ядерные геномы, а геномопластит или митохондрия. Такие системы позволяю значительно увеличить содержание продукта в трансгенном материале.

    В генной инженерии исследуются следующие  направления:

    Управляемая активность генов;

    Селективная экспрессия трансгена в определенных тканях;

    Система экспрессии растения в чужеродной генетической информации, опосредованной вирусами.

    Разработанная усилиями компании “Biosource” (США) технология позволяет быстро и в больших количествах нарабатывать в растениях белки и небольшие молекулы за счет инфицирования растений генетически модифицированными вирусами, со встроенными чужеродными генами тех или иных белков. За этой системой большое будущее, так как она позволяет изменить биосинтетические процессы в растениях без длительных и дорогостоящих манипуляций с растительным геномом. 

3.4. Генные вакцины. Актуальность разработки новых вакцин.

    Вакцины — одно из самых значительных достижений медицины, их использование к тому же чрезвычайно эффективно с экономической точки зрения. В последние годы разработке вакцин стали уделять особое внимание. Это обусловлено тем, что до настоящего времени не удалось получить высокоэффективные вакцины для предупреждения многих распространенных или опасных инфекционных заболеваний. По данным созданной в прошлом году международной организации «Всемирный союз по вакцинам и иммунизации» (в числе ее участников — ВОЗ, ЮНИСЕФ, Международная федерация ассоциаций производителей фармацевтической продукции, Программа Билла и Мелинды Гейтс по вакцинации детей, Рокфеллеровский фонд и др.), в настоящее время отсутствуют эффективные вакцины, способные предупредить развитие СПИДа, туберкулеза и малярии, от которых в 1998 г. умерло около 5 млн человек. Кроме того, увеличилась заболеваемость, обусловленная теми инфекциями, с которыми человечество ранее успешно боролось. Этому способствовало появление лекарственно-устойчивых форм микроорганизмов, увеличение числа ВИЧ-инфицированных пациентов с иммунной недостаточностью, ослабление систем здравоохранения в странах с переходной экономикой, увеличение миграции населения, региональные конфликты и др. При этом распространение микроорганизмов, устойчивых к воздействию антибактериальных препаратов, приобрело характер экологической катастрофы и поставило под угрозу эффективность лечения многих тяжелых заболеваний. Повышенный интерес к вакцинам возник после того, как была установлена роль патогенных микроорганизмов в развитии тех заболеваний, которые ранее не считали инфекционными. Например, гастриты, пептическая язва желудка и двенадцатиперстной кишки, ассоциированная с H. pylori, злокачественные новообразования печени (вирусы гепатита В и С).

3.5. Разработка ДНК-вакцин.

    Используемые  сегодня вакцины можно разделить  в зависимости от методов их получения  на следующие типы:

    • живые аттенуированные вакцины;

    • инактивированные вакцины;

    • вакцины, содержащие очищенные компоненты микроорганизмов (протеины или полисахариды);  
      • рекомбинантные вакцины, содержащие компоненты микроорганизмов, полученные методом генной инженерии.

3.6. Генная инженерия человека.

    В применении к человеку генная инженерия  могла бы применяться для лечения наследственных болезней. Однако, технически, есть существенная разница между лечением самого пациента и изменением генома его потомков.

    В настоящее время эффективные  методы изменения генома человека находятся  на стадии разработки. Долгое время генетическая инженерия обезьян сталкивалась с серьезными трудностями, однако в 2009 году эксперименты увенчались успехом: дал потомство первый генетически модифицированный примат - игрунка обыкновенная.

    Хотя  и в небольшом масштабе, генная инженерия уже используется для того, чтобы дать шанс забеременнеть женщинам с некоторыми разновидностями бесплодия. Для этого используют яйцеклетки здоровой женщины. Ребёнок в результате наследует генотип от одного отца и двух матерей. 

    4. МОЛЕКУЛЯРНАЯ ГЕНЕТИКА  НАСЛЕДСТВЕННОЙ ПАТОЛОГИИ

    Молекулярная  генетика наследственных болезней - это  относительно молодая отрасль молекулярной медицины. Ее зарождение связано с  разработкой нового методического  арсенала (методическая революция 70-х  годов), который предоставил исследователям возможность выделения индивидуальных генов путем их молекулярного клонирования, химического анализа нуклеотидных последовательностей ДНК, конструирования новых генетических структур, изучения механизмов экспрессии генов и ее регуляции. В рамках этого направления сделаны фундаментальные открытия, которые существенно изменили традиционные представления о структуре генов, их организации в геноме и взаимоотношениях ген - белок, ген - признак и генотип - фенотип.

    Методическая  революция 70-х годов имела следствием не только усовершенствование техники генетического анализа и увеличение его разрешающей способности, но и принципиальные изменения методологии современной генетики. Классическая генетика имеет дело с анализом фенотипических признаков разной степени сложности (структура и функциональная активность белков, морфологические признаки, клинические проявления болезней и т.д.), их сцепления и мутационных изменений. При этом изменения признаков трактуются как следствие мутаций соответствующих генов, а идентификация нормального гена, как правило, основана на обнаружении его мутантных (полиморфных) аллелей. Такая стратегия генетических исследований (''от признака к гену'' и ''от мутантного аллеля к нормальному гену'') характерна для всего предшествующего периода развития генетики человека.

    Разработка  принципиально новых методических подходов коренным образом изменила общую стратегию медико-генетических исследований. Во-первых, ген стал основным объектом исследования и изменения  его структуры выявляются не дедуктивно (по фенотипическому проявлению), а путем непосредственного химического анализа первичной структуры ДНК. Во-вторых, появилась возможность структурного анализа клонированных аллелей дикого типа, то есть нормальных генов. А это обстоятельство имеет два существенных следствия: 1) дедуктивное определение аминокислотных последовательностей неизвестных белков на основании первичной структуры клонированного гена и 2) обнаружение мутантных аллелей путем прямого сопоставления первичных структур нормального гена и его мутантов.

    Эта принципиально новая стратегия генетических исследований, особенно важная для изучения генома человека и основ наследственных болезней, может быть сформулирована в форме общих принципов ''от гена к белку'' и ''от нормального гена к мутантному аллелю''. В целом это направление иногда в литературе называют ''обратная генетика'', что подчеркивает принципиальное различие методологий классической (прямой) и молекулярной (обратной) генетики. Совершенно очевидно, что в применении к изучению наследственных болезней эти два разных направления не должны противопоставляться. Между ними нет антагонизма. Наоборот, только комплексное (молекулярное, биохимическое, клиническое) исследование наследственных дефектов будет способствовать решению таких важных фундаментальных и прикладных проблем, как выяснение молекулярных основ этиологии и патогенеза моногенных наследственных болезней, идентификация генетических факторов риска распространенных болезней, пренатальная и преклиническая диагностика и профилактика наследственной патологии, наконец, генная терапия как способ ее радикальной коррекции. В то же время с позиций обратной генетики требуются уточнение и конкретизация некоторых терминов и понятий, привычных и достаточных для трактовки сложных и вариабельных взаимоотношений генотип - фенотип с точки зрения классической генетики.

4.1. Наследственные болезни – объект обратной генетики.

    Каталог моногенных признаков человека, наследуемых  в соответствии с законами Менделя (болезни и нейтральные признаки), который периодически издается американским генетиком В. Мак Кьюсиком, насчитывает более 4 тыс. наименований.     Из них несколько сот болезней можно связать с нарушениями дискретных биохимических функций. К ним относятся гемоглобинопатии, энзимопатии, дефекты систем свертывания крови и фибринолиза, коллагенопатии, лизосомальные болезни накопления. Примерно такое же количество наследственных болезней исследуется в настоящее время методами обратной генетики. Их число постоянно увеличивается в связи с прогрессом молекулярного анализа генома человека. В применении к наследственной патологии большую роль играет стратегия позиционного клонирования, сочетающая подходы классической и молекулярной генетики. Она основана на первоначальном установлении локализации локуса болезни на хромосомах, с последующим выделением фрагментов ДНК из этого локуса и определением их нуклеотидных последовательностей (секвенированием), и обнаружением патологических мутаций при наследственной болезни. Этот подход успешно реализован при идентификации генов, мутации которых вызывают муковисцидоз, мышечную дистрофию Дюшенна, болезнь Гентингтона, гепатолентикулярную дегенерацию (болезнь Вильсона), болезнь Менкеса, синдром Марфана и другие нозологические формы. Позиционное клонирование является эффективным методом обратной генетики, дополняющим принцип тотального секвенирования генома. На основании мирового опыта молекулярного анализа наследственных болезней можно предложить схему взаимоотношений между генотипом, его биохимическими проявлениями (биохимический фенотип) и клинической картиной наследственных болезней (клинический фенотип), которые будут предметом дальнейшего изложения. 
 

4.2. Транс-действующие мутации.

    Существует  довольно большое количество наследственных дефицитов индивидуальных белков или  групп функционально родственных белков, имеющих моногенную природу, и наследуемых в соответствии с законами Менделя, которые не ассоциированы с какими-либо изменениями структуры генов, кодирующих эти белки. Такого рода вторичные, но специфические и патогенетически существенные дефициты белков часто являются фенотипическим выражением мутаций в генах, белки-продукты которых сами по себе не контролируют каких-либо явных фенотипических проявлений, например биохимических реакций (генах-модификаторах в терминах классической генетики). Для обозначения группы мутаций, локализованных вне гена, но нарушающих его нормальную (в количественном и качественном отношениях) экспрессию и вызывающих клинические аномалии, можно предложить термин ''транс-действующие мутации'' (в связи с тем, что эти гены кодируют транс-действующие белковые факторы, необходимые для адекватной экспрессии генов-мишеней и взаимодействующие с регуляторными цис-элементами ДНК). Гены этой группы кодируют компоненты аппарата генной экспрессии (например, белки-регуляторы транскрипции, белки системы образования активной мРНК из РНК - первичного транскрипта гена, белки-ферменты, катализирующие созревание белков и их адекватный внутриклеточный транспорт после их синтеза на рибосомах). Каждый этап экспрессии гена (от гена до признака) контролируется большим количеством белков. Часть их необходима для нормальной экспрессии всех генов, часть - для образования полноценных индивидуальных белков или групп белков, объединяемых общей функцией или внутриклеточной локализацией. Наконец, существует большая группа генов, контролирующих молекулярную программу включения и выключения различных групп генов в онтогенезе. Мутации этих генов вызывают множественные и разнообразные по фенотипу синдромы нарушения эмбрионального развития. Белки-продукты всех этих генов можно обобщенно назвать транс-действующими факторами, а их мутации, вызывающие вторичные, но специфические аномалии биохимического и клинического фенотипа - транс-действующими мутациями. 

    5. ПРОБЛЕМАТИКА ГЕННОЙ  ИНЖЕНЕРИИ.

5.1. Потенциальная опасность генно-инженерных методов.

    С появлением генно-инженерных методов  стало ясно, что они несут в  себе потенциальную опасность. В  чем заключается эта опасность, какие проблемы юридического и этического характера рождает генная инженерия, как формируются и чем регламентируются основные этические принципы медицинской генетики?

    Некоторые потенциально опасные исследования (например, включение генов опухолеродных  вирусов в ДНК плазмид) еще  недавно находились под запретом. Многие предлагают запретить генную инженерию. Однако эти предложения не обоснованны по следующим причинам.

    Во-первых, в настоящее время разработаны  безопасные «векторы», которые вряд ли могут выживать и размножаться вне лабораторий. Чаще всего векторами  выступают плазмиды. Весь процесс  получения бактерий, несущих «нужный» ген, включает в себя несколько стадий: разрезание ДНК человека, включение фрагментов ДНК человека в плазмиды, введение рекомбинантных плазмид в бактериальные клетки, отбор среди клонов трансформированных бактерий тех, которые несут нужный человеческий ген.

    Во-вторых, в большинстве экспериментов  используется бактерия Escherichia соli, а  это повсеместно распространенный вид, живущий в кишечнике человека. Но лабораторные штаммы этой бактерии существуют вне тела человека уже  на протяжении многих тысяч поколений. Их эволюция за это время зашла настолько далеко, что им теперь трудно выжить вне пробирки.

    В-третьих, отработаны обычные меры техники  безопасности, при соблюдении которых  исключены утечки опасных генетических конструкций.

    В-четвертых, в природе существуют пути переноса ДНК от одних видов другим, аналогичные тем, что используются в лабораториях, а генную инженерию, осуществляемую природой, нельзя запретить (речь идет о возможности существования трансдукции генов от одного вида к другому с помощью вирусов).

5.2. Биоэтика. Центральные постулаты биоэтического кодекса.

    Нарастающее проникновение биотехнологий в  изучение наследственности человека вызвало  необходимость появления специальной  науки – биоэтики, разработка проблем  которой имеет уже 15-летнюю историю.

    Из  общей этики, которая возникла еще  во времена античности как часть  практической философии, в наше время  выделилась биоэтика – наука об этичном отношении ко всему живому, в том числе и к человеку. Это важная ступень развития этики в современную эпоху, поскольку присущие промышленному производству высокие технологии очень агрессивны по отношению к человеку, и не только к его телесному здоровью, но и к интеллектуально-эмоциональной сфере.