Трансплантация эмбрионов

Тема: «Трансплантация эмбрионов»

Содержание.

1. Введение……………………………………………………………………….....3
2. Эффективность различных способов полиовуляции у коров……………...…6
1. Отбор коров – доноров и реципиентов……………………………….6
2. Методы гормонального вызывания суперовуляции…………………11
3. Синхронизация половых циклов доноров и реципиентов………..…14
4. Осеменение коров – доноров……………………………………...…..17
3. Сравнительная эффективность разных способов вымывания эмбрионов у коров…………………………………………………………………………….21
1. Контроль реакции яичников………………………………………..…21
2. Хирургические методы……………………………………………….. 21
3. Нехирургические методы………………………………………...……22
4. Приживление эмбрионов при различных способах пересадки…………..…25
1. Стадии развития и качество эмбрионов в зависимости от дня извлечения……………………………………………………………...25
2. Оценка качества эмбрионов и их культивирование…………………26
3. Криоконсервирование эмбрионов………………………………….... 29
4. Пересадка зародышей реципиентам………………………………..…33
5. Эффективность использования метода трансплантации эмбрионов в молочном скотоводстве…………………………………………..……36
5. Заключение…………………………………………………………………..…38
6. Список используемой литературы……………………………………..……..40

Введение.

 Одним из основных направлений  дальнейшего развития молочного  и мясного скотоводства страны  является интенсивное использование  маточного поголовья крупного  рогатого скота, особенно, с высоким  генетическим потенциалом продуктивности. Однако воспроизводство крупного  рогатого скота представляет  собой весьма сложный биологический  процесс, так как этому виду  животных свойственны одноплодие, длительный период репродуктивного  цикла и низкие темпы размножения. 

Научные достижения в области изучения репродуктивной функции самок животных привели к разработке нового биотехнического  метода интенсивного воспроизводства  и селекции крупного рогатого скота - метода трансплантации эмбрионов, что стало основой ускоренного воспроизводства высокопродуктивных животных. С его помощью можно получать от одной генетически выдающейся коровы-донора несколько десятков или даже сотен эмбрионов и высокоценных потомков, что позволяет быстро размножить и распространить ценный генетический материал выдающихся представителей по генотипу в целях селекции популяции (А.В.Квасницкий и др., 1988; Б.П.Завертяев,1989; Ф.И.Осташко,1995 и другие). Полагают также, что трансплантация эмбрионов позволит не только повысить производство животноводческой продукции, но и возможно станет одним из средств оздоровления сельскохозяйственных животных от ряда инфекционных заболеваний.

В сложившейся ситуации метод трансплантации эмбрионов открывает огромные возможности  в разведении и воспроизводстве  крупного рогатого скота как с  целью повышения эффективности племенной работы.

Трансплантация эмбрионов открывает  огромные перспективы ускорения  темпов селекционного прогресса  в животноводстве. С внедрением в  практику разведения животных метода искусственного осеменения резко возросли масштабы использования высокоценных племенных производителей для получения  потомства, между тем как влияние  маточного поголовья на селекционный процесс осталось прежним. Так, от коровы за всю ее жизнь получают 3-6 потомков, между тем как потомство от быков - улучшателей исчисляется десятками и сотнями тысяч голов.

Современная технология трансплантации эмбрионов позволяет получить от коровы - рекордистки за ее жизнь несколько десятков телят, расширяет возможности обмена генетическим материалом между странами и континентами. Транспортировка эмбрионов несравненно проще и дешевле, чем животных; к тому же отпадают ветеринарные проблемы, поскольку прочная оболочка непроницаема как для бактерий, так и для вирусов. США, Канада, Англия, Новая Зеландия осуществляют экспорт эмбрионов в десятки стран мира.

В молочном скотоводстве крупномасштабное воздействие метода эмбриопересадок  на генетических прогресс достигнуто путем комплектования центров и  станций исскуственного осеменения быками - трансплантатами, полученными  от наиболее выдающихся родителей плановых пород.

Расчеты показывают, что трансплантация эмбрионов усиливает ежегодный  генетический прогресс в животноводстве на 3%.

Метод трансплантации эмбрионов в  перспективе может быть использован  для создания генофонда редких и  исчезающих пород животных.

Разработка техники культивирования  ооцитов позволяет получить потомство  от животных, выбывших из эксплуатации.

Технологические этапы  трансплантации эмбрионов:

1. Отбор доноров и реципиентов;
2. Суперовуляция и синхронизация половых циклов у животных;
3. Искусственное осеменение доноров;
4. Оценка вымытых эмбрионов по морфологической структуре;
5. Пересадка свежевымытых или замороженных эмбрионов;
6. Замораживание.

2. Эффективность различных способов  полиовуляции у коров.

2.1. Отбор коров – доноров и реципиентов. 

Эффективность применения метода трансплантации эмбрионов во многом зависит от клинического и  физиологического состояния коров, их способности реагировать на экзогенные гонадотропины и выделять достаточное  число качественных зародышей. Следовательно, одним из наиболее существенных моментов в технологии трансплантации эмбрионов, способных повысить эффективность  метода является отбор доноров и  реципиентов.

Исходя из того, что донор - животное высокой племенной  ценности, то первое, на что обращают внимание при их отборе - это молочная продуктивность, которая за ряд лактаций должна быть на 50-60% выше стандарта данной породы, а содержание жира в молоке - на20% и более. Число учитываемых  признаков может быть расширено  в зависимости от поставленных селекционных целей. Например, содержание белка в  молоке, пригодность к машинному  доению (форма вымени, скорость молокоотдачи), крепость конституции, экстерьер и  т.д. Племенная ценность донора, наряду с оценкой собственного генотипа, должна подтверждаться продуктивностью  родителей. Коровы-доноры должны иметь  известное происхождение, подтвержденное документально по системам групп  крови. В большинстве случаев  в качестве доноров используют лактирующих  или выбракованных коров (не связанных  с гинекологической патологией), в  возрасте от 4 до 8 лет, живой массой 500-650 кг, с удоем по наивысшей лактации не ниже 7 тыс. кг молока, жирностью 3,7% и  более.

Не менее важным, а может и определяющим фактором при отборе доноров является состояние  репродуктивных органов. Поэтому для  гормональной обработки следует  отбирать животных не ранее, чем через 2,5-3 месяца после отела. При этом уменьшение размеров матки до физиологически необходимых размеров не может служить  гарантией готовности давать эмбрионы высокого качества. Такой гарантией может быть только проведение клинического обследования предполагаемого донора, которое при необходимости дает возможность определить направление восстановления функций размножения на основе экзогенной гормонотерапии.

Целесообразно проводить  разовую индукцию полиовуляции потенциальных  доноров с целью выяснения  ответной реакции яичников на введение гонадотропина, после чего делается окончательное заключение о пригодности  животного к использованию в  технологии трансплантации. Коровы и  телки с положительной ответной суперовулирующей реакцией (10 и более  овуляций) и давшие не менее 4-х жизнеспособных эмбриона за первую обработку переводятся  в группу постоянных доноров.

Оптимальный интервал между повторными обработками животных - 60-70 дней, в этом случае от донора можно  извлекать эмбрионы до 5 раз в  год. В технологии трансплантации эмбрионов  коров-доноров с уровнем реакции  полиовуляции до 6 желтых тел можно  использовать повторно через 35-45 дней.

Дополнительными критериями отбора животных для трансплантации эмбрионов являются гормональный статус и метаболическая активность потенциальных  доноров. Для получения от донора не менее 10 овуляций и 6 жизнеспособных эмбрионов необходимо, чтобы в  крови коров содержание эстрадиола было на уровне 15,4 пг/мл, тестостерона - 0,18 нг/мл, ЛГ - 1,46 МЕ/л на 0-й день полового цикла, а также прогестерона - от 2,0 до 5,0 нг/мл (в среднем 3,55) и ЛГ - 1,54 МЕ/л на 10-й день полового цикла. Вызывание суперовуляции может  быть эффективным при содержании в крови холестерина не менее 3,55 ммоль/л, β-каротина - 8,88 мкмоль/л, витамина А - 4,36 мкмоль/л, активность аланинаминотрансферазы не ниже 0,24 мкмоль/л.(4)

Сервис-период более  точно и намного раньше, чем  интервал  между отелами, выявляет потенциальные возможности воспроизводительной функции у коров. Он тесно связан с межотельным периодом (коэффициент корреляции составляет 0.9). Оптимальный сервис-период не должен превышать 80 дней. Однако анализ сервис-периода, проведенный в ведущих племенных стадах черно-пестрой породы, показал, что данный показатель воспроизводительной функции коров имеет высокий коэффициент изменчивости, который составил 61%.

Сервис-период в  основном зависит от интервала между  отелом и первым осеменением, и интервала  между первым и последним, т.е. эффективным  осеменением. Высокопродуктивных коров  следует осеменять на втором месяце после нормального отела. Это  обусловлено тем, что первый половой  цикл проявляется слабо, половая  охота клинически плохо определяется или вовсе не обнаруживается.

Первое осеменение коров на втором месяце после отела  не удлиняет сервис- и межотельный  период. При оптимальном сервис-периоде  до 80 дней после первого и второго  осеменений средняя оплодотворяемость  коров составляет 95-98%, а продолжительность  межотельного периода не превышает  одного года.

Для оценки воспроизводительных  способностей коров, отобранных в качестве потенциальных доноров, необходимо анализировать такие параметры  как оплодотворяемость от первого  осеменения и индекс осеменения. При  правильной технике осеменения и  своевременном определении половой  охоты оплодотворяемость коров  от первого осеменения должна составлять в среднем 60%.

Важным показателем  воспроизводительной способности  коров является индекс осеменения, т.е. количество осеменений на одно оплодотворение. Индекс осеменения характеризуется  высокой степенью изменчивости - коэффициент  вариабельности может достигать 70%.

Существенное влияние  на изменчивость индекса осеменения оказывают такие факторы, как  продолжительность периода от отела  до первого осеменения, своевременное  выявление коров в половой  охоте, оплодотворяющая способность  спермы быка и др. Индекс осеменения коров, выделенных в группу потенциальных  доноров, не должен превышать 1.5. В идеальном  случае потенциальная корова-донор  должна иметь индекс осеменения равный 1. У коров-доноров при всех отелах должны отсутствовать осложнения (мертворождаемость, задержание последа, послеродовые заболевания половых органов).

В качестве реципиентов  используются телки случного возраста (16-18 месяцев) не представляющие племенной  ценности, живой массой 380-400 кг. Не рекомендуется  использовать телок с низкой живой  массой.

Реципиенты должны быть клинически здоровы, внутренние и  наружные половые органы хорошо развиты, половой цикл должен соответствовать  физиологическим параметрам. При  ректальном исследовании матка и  яичники реципиента должны находиться в тазовой полости. Шейка матки  должна быть четко выражена, длиной 7-12 см, диаметром 2,5-3,0 см. Длина рогов  матки от 20 до 35 см. Яичники должны иметь округлую или овальную форму, плотную консистенцию, размер 3х2 см у коров и 2,0х1,5 см у телок.

Исследованиями  выявлена зависимость приживляемости зародышей от морфофункционального состояния органов воспроизведения  реципиентов. У телок-реципиентов  с нормально развитой половой  системой уровень стельности в среднем  составляет 57%, в то время как при  отклонениях в развитии половой  системы - 20%.

При отборе потенциальных  реципиентов следует также учитывать  параметры половой цикличности. В качестве реципиентов следует  использовать телок с продолжительностью полового цикла 19-22 дня, поскольку у  животных с менее (16-18) или более (23-26дней) продолжительным циклом отмечено достоверное  снижение приживляемости зародышей  на 15-20%.

При отборе потенциальных  реципиентов для трансплантации существенное значение имеет определение  качества желтого тела животного. Если на яичнике реципиента пальпируется желтое тело отличного качества (размер 1,0-1,5 см, выступает над поверхностью яичника, имеет грибовидную форму) или хорошего качества (размер 0,7-1,0 см, округлая или грибовидная форма), то уровень приживляемости зародышей  составляет 53-57%. При удовлетворительном желтом теле (размер 0,5 см, округлая форма) уровень стельности находится в пределах 28-30%. Не рекомендуется использовать для пересадки эмбриона реципиента, на яичниках которого имеется одновременно желтое тело и фолликул до 1,0 см.

Для более объективной  оценки функциональной активности яичников и снижения эмбриональной смертности при трансплантации, наряду с диагностированием  качества желтых тел, следует проводить  определение концентрации стероидных гормонов и биохимических показателей  крови реципиентов на 6-7 день естественного  или индуцированного полового цикла.

Пересадку эмбрионов  следует проводить реципиентам, независимо от качества желтого тела, с уровнем прогестерона в крови  от 2,0 до 4,9 нг/мл. Соотношение прогестерона к эстрадиолу должно быть 1:10. В случае использования телок в качестве реципиентов с уровнем прогестерона свыше 5 нг/мл приживляемость снижается  на 10-17%, а с уровнем ниже 2,0 нг/мл - на 25-30%. Содержание холестерина должно быть в пределах от 2,60-3,90 мкмоль/л, β-каротина - 12,2-17,3 мкмоль/л.

После ветеринарных обработок коров и телок для  трансплантации эмбрионов их можно  использовать только через 3 недели. На каждого донора следует готовить 5-6 реципиентов.

Диагностика стельности реципиентов проводится ректальным методом спустя 2-3 месяца после эмбриопересадок.

Кормление доноров  и реципиентов должно быть биологически полноценным. Недостаточный уровень  кормления, несбалансированность рациона  по общей питательности и другим жизненно важным элементам, использование  кормов низкого качества ведут к  нарушению обмена веществ, что оказывает  отрицательное влияние на эффективность  гормонального вызывания суперовуляции, качество полученных эмбрионов и  их приживляемость.

2.2 Методы гормонального вызывания суперовуляци. 

После отбора доноров приступают к индуцированию множественной  овуляции (суперовуляции). Этот метод разработан в СССР, и обуславливает синхронный рост фолликулов в яичниках при введении гонадотропинов не позднее 50 дня с момента отела. Оптимальный результат – выход минимум 10-20 яйцеклеток. На момент введения гормонов в яичнике должно быть много мелких фолликулов, при наличии одного большого или нескольких результат обработок сводится к нулю. Нужно учитывать и то, что фолликулы растут асинхронно, поэтому обработку гонадотропинами проводят в несколько этапов.

Для вызывания суперовуляции  у крупного рогатого скота используются гонадотропные препараты: гонадотропин сыворотки жеребых кобыл - ГСЖК и фолликулостимулирующий гормон - ФСГ - гипофиза животных, для синхронизации половых циклов - аналоги простагландина Ф2-альфа (эстрофан, магэстрофан, клопростенол, суперфан, ремофан, клатрапростин, эстуфалан и др.). Препараты ГСЖК обладают комплексной фолликулостимулирующей и лютеинизирующей активностью. Период полураспада экзогенного ГСЖК у коров составляет около 6 дней. Соотношение ФСГ и ЛГ в различных партиях неодинаковое, что сказывается на результативности суперовуляции. Стимуляция роста фолликулов препаратами ГСЖК сопровождается, как правило, увеличением массы яичников, образованием после овуляции разного числа и величины желтых тел. Из-за длительного распада ГСЖК в крови животных накапливаются повышенные концентрации гормонов. Изменение эндокринного статуса при индукции суперовуляции может оказывать неблагоприятное действие на оплодотворяемость яйцеклеток, развитие зародышей, а также на физиологическое состояние половых органов (в частности, наблюдается кистозное перерождение яичников). Для исключения длительной стимуляции роста фолликулов применяется анти-СЖК. Обработка антисывороткой в день проявления охоты нейтрализует циркулирующую в крови животных ГСЖК и тем самым прекращает дальнейшую стимуляцию роста фолликулов в яичниках. Это создает более благоприятный фон для овуляции, оплодотворяемости яйцеклеток и последующего развития зародышей. В практике используются стандартные гонадотропные препараты высокой степени очистки: сергон (Чехия), фоллигон (Голландия), прегмагон (Германия). Эти препараты инъецируют донорам на 11-12-ый день полового цикла, однократно, в дозе 50 И.Е. на 100 кг живой массы животного. Применение этих гонадотропинов обеспечивает вызывание множественной овуляции у 75-78% животных и получение в среднем 3,5-4,0 жизнеспособных эмбриона на донора.

Опыт работы по вызыванию  суперовуляции у коров-доноров  сывороточными и гипофизарными  препаратами показал, что при  использовании гипофизарных гормонов (ФСГ-п, ФСГ-супер, фолликотропин, фоллитропин) получаются более стабильные и высокие  результаты суперовуляции и эмбриопродукции (таб.1). Так, процент коров-доноров, реагирующих на обработку сывороточными гонадотропинами, составил 75,0-78,3%, гипофизарными препаратами - 85,3-88,8%, число овуляций на донора - соответственно 8,3-9,7 и 10,2-12,0, количество пригодных эмбрионов - 3,5-4,0 и 5,5-6,1. 

Залогом эффективного применения метода трансплантации эмбрионов  в практике племенной работы являются высокие показатели овулирующей реакции яичников коров-доноров на гонадотропные обработки и выход достаточного числа качественных эмбрионов. Высокая вариабельность и непредсказуемость как по числу вызванных овуляций, так и по количественному и качественному составу извлеченных зародышей создают трудности в планировании программы пересадок эмбрионов реципиентам и ведут к повышению затрат на трансплантацию.

В связи с этим, для совершенствования схем индукции полиовуляции у коров-доноров требуется  изыскания новых подходов к решению  этой проблемы, разработки эффективных  препаратов, позволяющих получать хорошие  результаты по выходу эмбрионов.

Изучена эффективность  гонадотропина ФСГ-Б, полученного  в лаборатории генетики БелНИИЖ, и рекомендуется для практики следующая схема его применения: начало гормональной обработки 10-12-й  день полового цикла; суммарная доза – 1500-1650 ИЕ на одного донора; инъекция простагландина F2-α на 3-й день обработки  в дозе 750 мкг.

Инъекция гонадотропина  ФСГ-Б по предложенной схеме позволяет  получать в среднем на донора 10-11 овуляций, 7,2-8,1 эмбриона, в том числе 5,2-5,5 полноценных.

Таблица 1 - Результаты суперовуляции и эмбриопродукции доноров при использовании разных гонадотропинов

В то же время использование  вышеперечисленных гонадотропинов при индукции полиовуляции не исключают  образования на яичниках неовулировавших  фолликулов, наличие которых может  привести к нарушениям гормонального  статуса доноров. С целью исключения длительной стимуляции роста фолликулов и наступления равномерной овуляции рекомендуется использовать синтетические  аналоги гонадотропин рилизинг-гормона (Гн-РГ). Инъекция донору Гн-РГ (сурфагон, диригистран и др.) в день охоты  способствует выделению лютеинизирующего гормона и овуляции фолликулов в  фиксированное время. 

Многолетний опыт нашей  работы показал, что инъекция Гн-РГ в 2-3 раза снижает число неовулировавших  фолликулов, повышает на 6-9% количество овуляций и на 11-19% число эмбрионов, пригодных к пересадке, в расчете  на одного донора. 

2.3 Синхронизация половых циклов доноров и реципиентов.

Синхронность проявления эструса между донором и реципиентом - важнейшее условие высокой приживляемости эмбрионов. Для синхронизации охоты используют простагландин ПГФ2-альфа или его синтетические аналоги (эстрофан, магэстрофан, ремофан, клопростенол, клатрапростин, суперфан, эстуфалан и др.).

По технологии трансплантации на каждого донора следует подготавливать не менее 5 реципиентов, причем день охоты  реципиента должен совпадать с днем первого осеменения суперовулирующего  донора. В случае использования в  технологии трансплантации постоянных доноров (проверенных на гормональную обработку и имевших стабильный выход качественных эмбрионов) число  реципиентов можно увеличить  до 10.

Перед гормональной обработкой животных исследуют ректально (определяют размеры и форму яичников, наличие и выраженность желтого  тела). Лютеиновая фаза цикла соответствует  оптимальному времени для инъекции препаратов. Простагландины вводят внутримышечно  в дозах, указанных в наставлениях по их применению. Как правило, животные приходят в охоту через 48-72 часа после  инъекции препарата. Не пришедших в  охоту животных обрабатывают повторно через 10-11 дней с момента первого  введения ПГФ2-альфа. Двукратное введение препарата (в любую фазу полового цикла) с 10-ти дневным интервалом эффективно использовать на большом поголовье  доноров и реципиентов, так как  это способствует увеличению числа  животных, проявивших признаки половой  охоты, и снижает трудоемкость операций обслуживающего персонала.

Эффективен способ синхронизации эструса у доноров  и реципиентов путем комплексного использования в лютеиновой фазе полового цикла инъекций гонадотропина  с простагландином Ф2 и гонадотропин рилизинг-гормоном. Животных, имеющих  хорошо выраженное желтое тело, обрабатывают ФСГ-супер в общей дозе 10 Арм.ед. для телок и 15 Арм.ед. для коров  двукратно по 5-7,5 Арм.ед. через 12 часов, на следующий день однократно инъецируют эстрофан по 500 мкг, а через 60 часов  от момента введения эстрофана дополнительно  сурфагон по 25 мкг. Половая охота  у животных проявляется на 2-3 сутки  после введения простагландина.

Следует учитывать, что данные обработки осуществляются не параллельно: доноров обрабатывают за 15 дней до начала стимулирования суперовуляции, а реципиентов – на второй день после начала стимулирования суперовуляции  у доноров.

Исследованиями  установлено (табл. 2), что комплексное  использование гормональных препаратов ФСГ, ПГФ2альфа Гн-РГ для синхронизации  эструса у самок крупного рогатого скота существенно повышает эффективность  работ по трансплантации. Из 50 телок, обработанных в опыте, клинически выраженную охоту проявили 88% животных, что на 11,4% больше, чем в контроле, а число реципиентов, пригодных для эмбриотрансплантации, и приживляемость пересаженных зародышей увеличилась соответственно на 15,0 и 12,2%.

Таблица 2 - Эффективность  способов подготовки животных для эмбриотрансплантации 

Аналогичная закономерность наблюдалась по группе коров-доноров. Количество животных, пригодных для  использования в качестве доноров, увеличилось на 15,5, а число коров, положительно реагирующих полиовуляцией, на – 14,8%. В опытной группе по сравнению  с контрольной повысился выход  полноценных эмбрионов от донора на 24% , а выход зародышей, пригодных  для пересадки, от общего числа извлеченных  зародышей -–14,7%. 

Таким образом, комплексное  использование гормональных препаратов для синхронизации эструса самок  крупного рогатого скота позволяет  повысить количество телок-реципиентов и коров-доноров, пригодных для эмбриотрансплантации, соответственно на 15 и 15,5%, уровень приживляемости зародышей – на 12,2%, выход полноценных эмбрионов от числа извлеченных – на 14,7%. 

2.4 Осеменение коров – доноров.

Результаты суперовуляции  определяются эффективным осеменением  животных-доноров. Проблема оплодотворения яйцеклеток и получения биологически полноценных эмбрионов все еще  остается открытой.

Для определения эффективности  осеменения животных-доноров используют как свежую, так и замороженную сперму. Эффективность осеменения доноров  свежей спермой выше по сравнению  с осеменением глубокозамороженной. Это различие объясняется главным  образом тем, что сперматозоиды, не подвергавшиеся охлаждению, сохраняют  всю активность в половых путях  животных более длительное время, чем  после оттаивания. Однако учитывая большие преимущества осеменения коров  глубокозамороженной спермой оцененных  быков-производителей, в практике используют именно  такую сперму.

При осеменении доноров применяют  цервикальный метод введения спермы, используя один из трех способов ее введения в шейку матки: ректо-цервикальный, моно-цервикальный и визо-цервикальный. Осеменение наиболее предпочтительно  производить ректо-цервикальным способом, позволяющим контролировать состояние половых органов коров.

Искусственное осеменение предотвращает  распространение целого ряда заболеваний. Уровень оплодотворения после осеменения несуперовулирующих животных глубокозмороженной спермой составляет 85-95 % и только 60-80 % яйцеклеток, извлекаемых из суперовулировавших животных-доноров, является оплодотворенным.

Осеменение доноров производят 3 раза двойной дозой глубокозамороженно-оттаянной  спермой с интервалом 10-12 ч, точно  фиксируя при этом время прихода  в охоту. Замороженную сперму используют после оттаивания при подвижности  спермиев не менее 4 баллов. В дозе спермы для осеменения должно быть не менее 50 млн. подвижных спермиев.