Целлолюлитические ферменты



 

СОДЕРЖАНИЕ

 

Введение

1. Характеристика препарата

1.1. Показатели (нормы):

Внешний вид, цвет

Массовая доля влаги, %

Активность (ед/г)

Рабочая зона действия (pH, t)

Безвредность в тест-дозе

Гарантийный срок хранения

Упаковка

1.2. Катализируемая реакция

1.3. Применение и назначение препарата

2. Технология получения  препарата

2.1. Продуцент фермента

2.2. Источники углерода (С)

2.3. Источники азота  (N)

2.4. Способы культивирования

2.5. Выделение

2.6. Процессуально-технологическая  схема

Заключение

 

 

 

 

 

Введение

 

Ферментные препараты, способные разрушать целлюлозу, в ближайшее время найдут широчайшее применение в самых разных отраслях производства. В связи ростом народонаселения  Земли и активным поискам источникам пищевых ресурсов на основе непищевого сырья и новых источников энергии возрос интерес к целлюлозосодержащему сырью, возобновляемые запасы которого почти безграничны. Гидролиз целлюлозы дает глюкозу, которую можно использовать для производства пищевых и кормовых белковых препаратов, получать из нее спирт для энергетических целей, а также она может стать исходным продуктом для производства продуктов глюкозо-фруктозных сиропов. Известны промышленные способы гидролиза древесины до глюкозы, но они приводят к частичной деградации глюкозы и образованию нежелательных примесей, от которых необходимо освобождаться. Для проведения кислотного гидролиза требуется дорогое, стойкое к коррозии оборудование. Поэтому наиболее перспективным является использование целлюлаз для гидролиза целлюлозосодержащего сырья. Целлолюлитические ферменты с успехом применяют в самых различных производствах (спиртовая, пивоваренная, пищеконцентратная, хлебопечение , кормопроизводство и т.д.), где сырьем являются растительные материалы или отходы переработки растений. Использование целлюлаз повышает выходы целевого продукта и позволяет подойти к созданию безотходных технологий. Целлолютическим ферментам принадлежит большое будущее. Однако целлюлоза – очень сложный субстрат для действия ферментов, и в мире нет продуцентов, которые бы в полной мере были бы экономически рентабельны и удовлетворяли потребности отрасли, применающих целлюлазы.

Название "целловиридин" широко используется в России с 1976 года. Наименование ферментных препаратов в  СССР было принято образовывать из двух слов: наименование класса ферментов (например целлюлаза) + видовое названия штамма-продуцента (Trichoderma viride - вириде).

Таким образом, "целловиридином" можно называть любой препарат, обладающей целлюлазной активностью и произведенный  с использованием штаммов Trichoderma viride (T. reesei и T. longibrachiatum по современной классификации микроорганизмов - синонимы).

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

  1. ХАРАКТЕРИСТИКА ПРЕПАРАТА

 

    1. Показатели (нормы):

 

Внешний вид.

Препарат получают путем глубинного культивирования гриба Trichoderma reesei (viride). Мелкий, гигроскопичный, аморфный порошок от светло-желтого до темно-коричневого цвета, содержащий комплекс ферментов, способных гидролизовать растительные полисахариды — целлюлазы, глюканазы, ксиланазы, гемицеллюлазы и другие.

Массовая доля влаги.

Влажность готового высокоочищенного препарата составляет 0,5 %

Активность.

За единицу целлюлолитической  активности принимают такую активность, при которой 1 грамм фермента (в  стандартных условиях) катализирует образование 1 грамма восстанавливающих эквивалентов (целлобиозы) в час. Целловиридин выпускают с целлюлозолитической активностью 200 ед/г, 1000 ед/г и 2000 ед/г.

Рабочая зона действия.

Максимальную активность фермент проявляет в кислой зоне при pH=4,3-5,0, реже при 6,7; оптимальная температура действия лежит в диапазоне значений от 37 до 45 °C.

Безвредность в тест-дозе.

Препарат вносят в  корма, премиксы и мультиэнзимные композиции на комбикормовых заводах или  кормоцехах хозяйств, используя существующие технологии. Максимальные дозировки препарата: при производстве комбикормов — 300000 Ед. целлюлозолитической активности на 1 тонну корма; при производстве 1 % премиксов — 30000000 Ед. целлюлозолитической активности на 1 тонну премикса.

Агрегатное состояние  в воздухе - аэрозоль. Предельно допустимая концентрация (ПДК) в воздухе рабочей зоны - 2 мг/м3. Класс опасности - 3.

Гарантийный срок хранения.

В упаковке завода изготовителя в  чистых сухих помещениях, а также в закрытой таре в сухом, темном, хорошо вентилируемом помещении, исключающих попадание прямых солнечных лучей при температуре не выше 25 °С и не ниже минус 25 °С. Срок годности препарата в сухой форме - 1 год, в жидкой форме – 6 месяцев. Не допускается хранение совместно с минеральными удобрениями, ядохимикатами, кислотно-щелочными веществами, химическими отбеливателями для моющих средств.

Упаковка.

Упаковывают в мешки по 1,5, 10, 15, 20 и 25 кг.

 

    1. Катализируемая реакция

 

Целлюлолитические ферменты представляют собой сложный внеклеточный ферментативный комплекс, в который входят следующие ферменты:

- эндоглюканаза (1,4-β-D-глюкан-4-глюканогидролаза), способная неупорядоченно гидролизовать в целлюлозе и β-глюканах β-1,4-связи; в реакционной среде помимо целлоолигосахаридов возможно образование глюкозы и целлотриоз;

-  целлобиогидролаза (1,4-β-D-глюканцеллобиогидролаза), отщепляющая целлобиозу с нередуцирующих концов целлоолигосахаридов;

-  β-глюкозидаза (β-D-глюкозидглюкогидролаза, целлобиаза), отщепляющая концевые нередуцирующие остатки β-D-глюкозы с освобождением глюкозы. Фермент может гидролизовать β-D-глюкозиды и целлобиозу;

-  экзо-1,4-глюкозидаза (1,4- β -D-глюканглюкогидролаза), гидролизующая 1,4-связи в 1,4-β-D-глюканах, последовательно отщепляя глюкозные остатки.

Образующиеся целлобиоза и глюкоза подавляют синтез целлюлолитических ферментов. Природными ингибиторами целлюлаз являются фенольные соединения и танины.

Механизм гидролиза  или способ действия ферментов на целлюлозу и целлюлозные комплексы  принципиально одинаков, независимо от их происхождения. Гидролизу целлюлозы  предшествует адсорбция целлюлолитических ферментов на лигноцеллюлозном субстрате. Адсорбируемость ферментов зависит как от субстрата, так и от вида микроорганизмов. Этим обусловлены основные различия в скорости гидролиза целлюлозы целлюло- литическими комплексами.

 

 

    1. Применение и назначение препарата

 

Комплекс ферментов-карбогидраз  штамма Trichoderma reesei (viride) способен к глубокой деструкции как клеточных стенок, так и отдельных полисахаридов  растений: целлюлозы, глюкана, ксилана, гемицеллюлозы и других некрахмалистых полисахаридов. Разрушая стенки растительных клеток, ферментный комплекс Целловиридина, повышает доступность крахмала, протеина и жира для воздействия ферментов пищеварительного тракта; увеличивает переваримость питательных веществ и улучшает их всасывание в тонком отделе кишечника; нормализует микробиологическую среду кишечника за счет снижения вязкости и повышения уровня моносахаридов; компенсирует дефицит пищеварительных ферментов на ранних стадиях развития и при стрессе, когда выработка собственных ферментов лимитируется. При использовании Целловиридина, из растений более полно извлекаются питательные вещества и высвобождается энергия. В результате чего возрастает фактическая кормовая ценность рациона; увеличивается усвояемость белка, лизина и метионина; возрастает продуктивность при неизменных рационах; повышается сохранность поголовья; уменьшается количество и влажность помета, а также влажность подстилки. Препарат совместим с другими кормовыми добавками и компонентами комбикормов и премиксов.

Применяют для повышения переваримости и питательной ценности кормов с высоким содержанием клетчатки и других труднодоступных полисахаридов. Для увеличения привесов и продуктивности сельскохозяйственных животных и птицы.

 

  1. ТЕХНОЛОГИЯ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРАТА

 

2.1. Продуцент фермента

 

В промышленных целях используется сравнительно небольшое количество видов микроорганизмов, в основном относящихся к роду Trichoderma, реже – Geotrichum. Известно, что одним из очень активных продуцентов целлюлаз являются грибы, разрушающие в аэробных условиях древесину и анаэробные бактерии, живущие за счет разложения в почвах растительных остатков.

Традиционный отбор продуцентов  производится путем скрининга огромного  количества возможных продуцентов  на способность гидролизовать целлюлозу, а затем оптимизацией условий культивирования. В итоге по ряду продуцентов целлюлаз удалось получить чрезвычайно высокое выделение во внешнюю среду целлюлаз.

Характеристика штамма Trichoderma viride.

На агаризованной среде сусло-агар (содержание солодового сусла 5-6° по Баллингу) на 5 день развития микроорганизм образует характерные колонии до 5,0-5,5 см в диаметре с гладкой подошвой, слегка приподнятые над поверхностью среды, не врастающие в агар, с волнистым краем, пушистым воздушным мицелием, который покрыт спорами лимонно-желтого цвета. На 3 день развития в среду выделяется ярко-желтый пигмент лимонного оттенка. Гифы мицелия бесцветные, септированные, многократно ветвистые.

Систематическое положение.

Класс             Fungi imperfecti

Порядок Hyphomycetales

Род           Trichoderma

Вид           viride

Продуцент синтезирует высокоактивный комплекс целлюлолитических ферментов для производства ферментного препарата целловиридин. Максимальная активность целлюлазы составляет 35 ед/мл, ксиланазы - 42 ед/мл .

Продуцент растет на жидких и агаризованных средах. Культивирование гриба происходит 5 суток при температуре 36- 38 °С, затем 5 суток при комнатной температуре. Для размножения и хранения используется сусло-агар 5-6 °Б, рН среды - 5,0-6,0.

 

2.2. Источники углерода

 

Углерод крайне необходим микроорганизмам, так как он определяет основные метаболические пути любого организма. Источниками углерода могут быть самые различные органические соединения.

Предложены и испытаны самые  разнообразные источники углерода: фильтровальная бумага, линт, свекловичный жом, гузапайя, целлобиоза, стержни кукурузных початков, измельченная солома, хлопок, опилки, лактоза, пшеничные отруби и т.д.

Еще в 60-х годах для Trichoderma viride указывалось на возможность использования для роста культуры до 62 источников углерода. Однако активный биосинтез целлюлаз наблюдался на средах с целлюлозой, целлюлозосодержащем сырьем и на лактозе.

При изучении влияния  источников углерода на биосинтез целлюлаз грибами рода Trichoderma испытали лактозу, свекловичный жом, фильтровальную бумагу, хлопок и их различные сочетания. Наилучшие результаты получены при наличии в среде лактозы или свекловичного жома.

 

2.3. Источники азота

 

Большое значение имеет  и источник азота. При изучении влияния  неоргаических и органических источников азота наилучшие результаты для большинства продуцентов ферментов получены при введении в состав среды (NH4)2SO4, (NH4)2HPO4 , гидролизатов дрожжей, кукурузного экстрактов, солодовых ростков, соевой муки и особенно хлопкового шпрота и пшеничных отрубей.

 

2.4. Способы культивирования

 

Культивирование – это  развитие микроорганизма в специальном  аппарате (ферментере). Если культивирование  осуществляется с использованием жидких питательных сред – это так называемое глубинное культивирование или суспензионное. Если же используются твердые питательные среды – поверхностное культивирование.

Если речь идет о культуре микроорганизмов вместе с остатками  питательной среды, то ставится буква  «х». Чтобы показать степень очистки  к букве «х» ставится цифра. Например, 2 – жидкий концентрат исходной культуры, 3 – сухой экстракт (Э) или культуральная жидкость (КЖ), полученные распылением; 10 – сухие препараты ферментов полученные фракционированием Э или КЖ (высаливанием или обработкой органическими растворителями); 15,20,25 – препараты частично освобожденные от балластных веществ и сопутствующих ферментов. Нумерация степени очистки выше 20 обычно не практикуется, т.к. это уже высокоочищенные, можно сказать гомогенные ферменты. Они именуются согласно классической номенклатуре и классификации ферментов, предложенной Международным союзом по биохимии.

 

Получение препаратов целлюлаз из поверхностных культур.

Целлюлолитические ферментные препараты для использования  в сельском хозяйстве и кормопроизводстве часто получают при поверхностном способе культивирования. Эти препараты дешевы и содержат значительные количества сопутствующих гидролитических ферментов, таких как амилазы, протеазы, пектиназы и гемицеллюлазы, что также важно и ценно для потребителя.

Большое значение при  твердофазном культивировании имеют  толщина слоя и влажность питательной  среды. Для большинства продуцентов  целлюлаз оптимальной является влажность 60-65%. Такая высокая влажность возможна в связи с введением в состав среды солодовых ростков и других рыхлителей, но толщина слоя даже при такой сыпучести среды не должна превышать 25-30 мм.

Для большинства мезофильных  продуцентов целлюлаз рекомендуется  на первой фазе роста культуры увеличивать  температуру на 3-5 °С выше оптимальной  для ускорения прорастания спор. Этот период в зависимости от продуцента имеет длительность от 14 до 20 ч. Далее температура снижается до оптимальной. Такой прием позволяет сократить длительность роста культуры на 10-12 ч. и повысить уровень активности культуры на 10-15%.

При твердофазном культивировании  длительность выращивания практически  для всех продуцентов лежит в  интервале от 2,5 до 3 суток и совпадает  с фазой интенсивного спорообразования. Выход культуры обычно составляет 76-78% по сухой массе от исходной среды и мало изменяется в последние сутки роста, так как легкодоступные источники углерода полностью утилизируются, а целлюлоза утилизируется очень медленно.

 

Получение препаратов целлюлаз из глубинных культур.

В настоящее время  во многих лабораториях нашей страны и за рубежом продолжаются работы по подбору условий и состава сред для глубинного культивирования продуцентов целлюлаз.

Отличительная особенность  большинства продуцентов целлюлаз – это большая длительность культивирования. Обычно максимум активности приходит на 4-8 сутки. Анализ данных показывает, что в культуральной жидкости при оптимальных условиях выращивания может накапливаться от 2 до 30 ед. АФБ/мл и от 200 до 800 ед. КМЦ/мл.

Разработана питетельная  среда (в %): карттоф. Крахмал – 1,56%; отруби пшеничные – 1,25%; (NH4)2SO4 - 0,22%; K3PO4 – 0,14%; MgSO4 -  0,014%;CaCl2 – 0,014; пеногаситель – 0,001 (лапрол, пропинол); аммиачная вода (20%) – 0,6 (в пересчете на 100%) и вода до 100%. Усиление биосинтеза сопутствующих ферментов происходит при введении в среду соответствующих субстратов – крахмала, пектина, ксилана, ламинарина, лихеина, хитина.

С продуцентом Trichoderma viride возможны различные варианты промышленного культивирования, например:

- периодическая ферментация  на основе растворимого источника углерода или в присутствии целлюлозы или целлюлозосодержащего сырья;

- ферментация с подпиткой  на основе целлюлозы или целлюлозосодержащих  отходов;

- управляемая ферментация  с подпиткой, например, лактозой  на основе растворимых субстратов  в качестве единственного источника углерода или в комбинации с целлюлозосодержащими материалами в основной среде.

 

2.5. Выделение

 

На основе глубинной  культуры можно получить технические  препараты целлюлаз и очищенные  целлюлолитические препараты. Технические препараты получают путем высушивания распылением концентратов культуры без отделения твердой фазы или выпаривания ее жидкой фазы. Для снижения потерь при сушке в культуральную жидкость вводят стабилизаторы, чаще всего небольшие количества некоторых солей. Комплексные очищенные препараты из Trichoderma viride можно получить осаждением органическими растворителями и высаливанием сульфатом аммония.

На основе мутантного штамма Trichoderma viride разработан процесс получения комплексного целлюлазного препарата «Целловиридин». Технологическая схема состоит из следующих основных этапов:

- фильтрация культуральной  жидкости на фильтр-прессе на  капроновом или лавсановом полотне;

- высаливание, в качестве высаливающих агентов используют соли щелочных металлов и сульфат аммония;

- обессоливание проводят гель-фильтрацией (G25);

- тонкую очистку проводят  аффинной хроматографией;

- концентрируют вакуум – выпарной установкой;

- консервирование сублимационной сушкой.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Описание процессуально-технологической схемы получения целловиридина.

 

ВО1. Водоподготовка.

ВО2. Подготовка стерильного воздуха.

ВО3. Подготовка лабораторной культуры продуцента Trichoderma viride.

ТП1. Подготовка питательной  среды.

В состав питательной  среды входят следующие компоненты:

- картофельный крахмал (1,56%);

- пшеничные отруби (1,25%);

- (NH4)2SO4  (0,22%);

- K3PO4 (0,14%);

- MgSO4 (0,014%);

- CaCl2 (0,014%);

- пропинол (0,001%);

- аммиачная вода 20% (0,6%);

- вода до 100%.

Все компоненты смешивают, затем стерилизуют при t = 135-137°С, Р = 1,5 атм в течении 1 ч. Выдерживают 1ч при t = 70-80°С, после чего охлаждают до  t = 40 +_ 0,5°С.

ТП2. Подготовка посевного  материала.

Выращивание посевного  материала в лабораторных условиях происходит при t = 37°С, pH = 5,0 в течении 5 суток. Выращивание в промышленных условиях при тех же параметрах.

ТП3. Основная ферментация.

Происходит методом  глубинного культивирования при t = 37°С, pH = 5,0 в течении 5 суток.

ТП4. Получение культуральной  жидкости.

Культуральную жидкость получают фильтрацией при t = 37°С, pH = 5,0 в течении 5-8 мин.

 

ПО1. Биомасса продуцента и твердая взвесь среды.

ВО4. Дозирование (NH4)2SO4.

ТП5. Разделение белков на фракции.

Для того чтобы разделить  белки на фракции используют метод  высаливания. Высаливание проводят с помощью (NH4)2SO4, вследствие этого альбумины находятся в жидкой фракции, а глобулины выпадают в осадок.

ПО2. Отработанный (NH4)2SO4.

ВО5. Подготовка сефадекса G25.

ТП6. Обессоливание.

Обессоливание проводят гель-фильтрацией, используя сефадекс G25 для удаления  (NH4)2SO4. При этом сульфат аммония захватывается гелем, а белок переходит в раствор.

ПО3. Отработанный (NH4)2SO4.

ВО6. Подготовка сорбента.

В качестве сорбента используют порошковую целлюлозу. Сорбент закупают в «Полицелл». Представляет собой порошок белого, серого или кремового цветов  марка ПЦС ТУ 5410-029-32957739-2004.

ВО7. Подготовка буфера.

Ацетатная буферная смесь pH = 4,5-5,5/

ТП7. Тонкая очистка.

Для тонкой очистки применяют  аффинную хроматографию. Ее проводят  с использованием в качестве сорбента порошковую целлюлозу в буферном растворе с pH = 4,5-5,5 в течение 1 ч.

ПО4. Регенерация сорбента.

ВО8. Подготовка градиента элюента.

Приготовление буферных растворов с pH = 6,0; 6,3; 6,5; 6,8; 7,0.

ТП8. Десорбция.

Десорбцию ферментов  проводят элюцией при pH = 6,5-7,0 с понижением ионной силой элюента до дистиллированной воды.

 

ТП9. Концентрирование.

Этап концентрирования проводим процессом вакуум-упаривания при t = 30-40°С в течение 2 мин.

ВО9. Подготовка хладагента.

В качестве хладагента применяется  фреон R13 с tкип. = -80°С.

ТП10. Консервирование.

Консервирование происходит в сублимационной сушке при следующих  параметрах: t = -70 - -80°С, P = 0,001 атм в течение 10ч. Влажность препарата после сублимации составляет 0,5 %.

ПО5. Конденсат.

ТП11. Упаковка.

Упаковывают готовый высокоочищенный ферментный препарат «Целловиридин» в стеклянные флаконы объемом 5 мл.

 

 

 

 

                

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Заключение

 

Итак, ферментные препараты  повышают переваримость и усвояемость  питательных веществ кормов, устраняют  или снижают отрицательное влияние антипитательных веществ, в определённой степени восполняют дефицит пищеварительных ферментов в ранних стадиях развития молодняка с.-х. животных и птицы, когда выработка собственных ферментов затруднена, а также при кормлении животных кормами с высоким содержанием некрахмалистых полисахаридов. Благодаря действию ферментных препаратов фактическая питательность рациона возрастает на 5-8%, повышается продуктивность, снижаются расходы кормов на единицу продукции на 3-8% появляется возможность замены дорогих кормов (кукурузы, соевый шрот) на более дешёвые (рожь, ячмень, пшеничные отруби, подсолнечный жмых).

По мнению некоторых  учёных  использование кормовых ферментов обеспечивает такое же повышение обменной энергии рациона  как включение 2% кормового жира — можно подсчитать, что дешевле.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Список используемых источников:

 

  1. Бирюков, В.В. Основы промышленной биотехнологии / В.В. Бирюков. - М. КолосС, 2004.
  2. Варфоломеев С.Д., Гуревич К.Г. Биокинетика: практический курс. - М.: ФАЙР-ПРЕСС, 1999. - 720 с.
  3. Грачева И.М., Кривова А.Ю. Технология ферментных препаратов. - 3-е изд., перераб. и доп. М.: Изд-во “Элевар” 2000. 512с. ил.
  4. Грачева, И.М. Технология ферментных препаратов / И.М. Грачева. - М.: Агропромиздат, 1985.
  5. Кислухина, О.В. Ферменты в производстве пищи и кормов / О.В.Кислухина. - М.: КолосС, 2002.
  6. Манаков, М.Н. Теоретические основы промышленной биотехнологии / М.Н. Манаков, Д.Г. Победимский. - М.: Высшая школа, 1989. - 310 с.
  7. Околекова Т.М. , Кулаков Н.В. и др. Корма и ферменты. -Сергиев Посад, 2001-112с.
  8. Синицын А.П., Гусаков А.В., Черноглазов В.М. Биоконыерсия лигноцеллюлозных материалов: Учебное пособие. М.: издательство МГУ, 1995. – 125 с.
         

Д.238.04.101.01.0000ПЗ

Лист

           

Изм.

Лист

№ докум.

Подп.

Дата


 

           
         

Изм

Лист

№ докум.

Подп.

Дата

Разраб.

      

Содержание

Лит.

Лист

Листов

Пров.

      

У

    

3

  
         

Н. контр.

      

Утв.