Афинная хроматография

Введение

Принцип хроматографии, разработанный в 1903 г. русским ученым М. С. Цветом, основан на способности пигментов (или любых других окрашенных и неокрашенных веществ) специфически адсорбироваться на адсорбенте, заключенном в колонке.

В результате происходит разделение анализируемых веществ и их концентрирование в строго определенном слое адсорбента. Затем через колонку пропускают подходящие элюенты, которые ослабляют силы адсорбции и выносят с током раствора индивидуальные вещества. Последние последовательно собирают в коллекторе фракций (принцип сорбции-десорбции).

 Чрезвычайно эффективным средством фракционирования белков из смеси оказалась колоночная хроматография с гидроксилапатитом, различными ионообменными смолами и производными целллюлозы в качестве носителей. При выделении и очистке белков используют четыре основных типа хроматографии: адсорбционную, распределительную, ионообменную и аффинную (хроматография по сродству) – в соответствии с разными физическими и химическими механизмами, лежащими в основе каждого из них. Хроматография широко применяется не только для выделения белков, но и для разделения множества других органических и неорганических веществ, входящих в состав живых организмов.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

История Возникновения

Макромолекулы, такие, как белки, полисахариды и нуклеиновые кислоты, внутри своих индивидуальных групп отличаются по физико-химическим свойствам лишь незначительно; поэтому их выделение, основанное на различиях в этих свойствах, например, с помощью ионообменной хроматографии, гель-фильтрации или электрофореза сопряжено с известными трудностями и требует много времени. Вследствие этого в ходе выделения существенно падает их активность из-за денатурации, расщепления, ферментативного гидролиза и т. п. Одним из наиболее харак-терных свойств этих биологических макромолекул является их способность обратимо связывать другие вещества. Например, ферменты образуют комплексы с субстратами или ингибиторами, антитела – с антигенами (против которых получены), а нуклеиновые кислоты, такие, как информационная РНК, гибридизуются с комплементарными ДНК и т.д. Образование специфических диссоциирующих комплексов биологических макромолекул служит основой метода их очистки, известного как аффинная хроматография.

Однако термин «аффинная хроматография» вызывал много возражений. Делались попытки заменить его более точным: например, «биоспецифическая адсорбция» или «биоаффинная хроматография», в особенности, когда было найдено, что ряд сорбентов, в особенности такие, которые связываются с синтетическими ингибиторами своей гидрофобной углеводородной цепью, могут сорбировать макромолекулы в результате преимущественно гидрофобных взаимодействий. Использование комплексообразования биологических макромолекул, основанного на гидрофобных взаимодействиях, положило начало гидрофобной хроматографии. Однако во многих случаях провести четкую границу между биоспецифическим комплексом и комплексом, образующимся в результате действия неспецифических гидрофобных взаимодействий, не так просто, как могло бы показаться на первый взгляд.

Часто одно и то же вещество, привязанное к носителю, с одной группой мак-ромолекул может образовывать биоспецифические комплексы, в то время как с дру-гой оно может давать комплексы исключительно благодаря неспецифическим гидрофобным взаимодействиям, а в образовании связей с третьей группой макромолекул могут принимать участие оба типа взаимодействий. В качестве примера можно привести гексаметилендиамин. Это соединение, будучи привязанным к сефарозе. использовано Гендерсоном и др., а также Якубовским и Павелкевичем в качестве сорбента для гидрофобной хроматографии аминоацил-тРНК-синтетаз и L-гистидинолфосфат-амииотраксфераз. Торая и др. предложили его в качестве био-специфического сорбента для аминооксидазы из Aspergillus niger, в то же время Восбек и др. выделяя с помощью того же сорбента аминопептидазы из Streptomyces griseus, не пришли к определенному заключению о типе связи, образующейся при специфической сорбции. Поэтому логически объяснимо, почему Якоби и Вильчек среди аффинных методов, т. е. методов биоспецифической сорбции, рассматривали не только аффинную хроматографию, но также гидрофобную хроматографию (Шальтиель ), ковалентную хроматографию (Бламберг и Строминджер, Броклехурст и др.), аффинную элюцию (Хаар), аффинное изменение плотности (Баллах) и аф-финный электрофорез (Хорейши и Коцоурек). Недавно термин «аффинная хромато-графия» был еще более расширен отнесением к нему металлохелатной аффинной хроматографии (Порат и др.) и матричной хроматографии, нашедшей применение при исследованиях взаимодействий на носителях со связанными олигонуклеотидами.

Аффинная хроматография как метод, впервые была применена Штаркенштайном в 1910 г. для выделения ά-амилазы с помощью нерастворимого субстрата (крахмала). Кемпбелл и др. были, вероятно, первыми (1951 г.), в чьих работах этот принцип получил практическое приложение для выделения антител на колонке с целлюлозой с ковалентно присоединенным антигеном. Для выделения ферментов аффинная хроматография впервые была применена в 1953 г. Лерманом, который выделил тирозиназу на колонке с целлюлозой, эфирно связанной с остат-ками резорцина. В последующие годы аффинная хроматография использовалась весьма редко, что; очевидно, обусловлено свойствами известных в то время нерастворимых подложек, которые ограничивали возможности образования комплексов между выделяемыми продуктами и присоединенными аффинантами. На подложках с гидрофобными или ионогенными группами часто наблюдалась неспецифическая сорбция.

 

 

 

 

 

 

 

 

Фазы аффинной хроматографии. Суть метода.

В аффинной хроматографии выделяют две фазы: подвижной фазой (элюентом) служит жидкость, неподвижной фазой может быть твердый сорбент. Главная особенность, которая обусловливает высокую эффективность этого метода, состоит в том, что разделение основано на различии не физико-химических признаков молекулы (заряда, формы и размера), а специфичности функциональных свойств, отличающих данный фермент от множества других биополимеров. Разделение в аффинной хроматографии обычно проводят на хроматографических колонках в две фазы (адсорбция и десорбция); иногда разделяемую смесь помещают в сосуд с сорбентом и выдерживают до полного связывания исследуемого компонента. Затем сорбент (в колонке или сосуде) промывают буферным раствором для удаления не связавшихся веществ, после чего десорбируют исследуемый компонент. Десорбция (элюция) последнего обычно достигается повышением ионной силы, изменением рН буферного р-ра или добавлением в него органического растворителя, что ослабляет взаимодей-ствие лиганд - фермент. Более избирательна десорбция раствором лиганда.

 

Различают колоночную жидкостную хроматографию, в которой через колонку, заполненную неподвижной фазой, пропускают порцию разделяемой смеси веществ в потоке элюента (под давлением или под действием силы тяжести), и тонкослойную жидкостную хроматографию, в которой элюент перемещается под действием капиллярных сил по плоскому слою сорбента, нанесенного на стеклянную пластинку или металлическую фольгу, вдоль пористой полимерной пленки, по поверхности цилиндрической кварцевой или керамической палочки, по полоске хроматографической бумаги.

 

Неподвижная фаза в аффинной хроматографии представляет собой специально получаемый сорбент, построенный обычно по схеме: носитель - соединяющее звено ("ножка") - специфический лиганд. Носителем служит чаще всего сефароза - производное агарозы, имеющее поперечные сшивки. Присоединение к ней лиганда или "ножки", содержащих, как правило, аминогруппу, осуществляется после активации сефарозы бромцианом:

Активацию сефарозы осуществляют в процессе инкубации раствора бромциана с водной суспензией сефарозы. Бромциан взаимодействует с гидроксильными группами сефарозы, в результате чего образуется имидокарбонат, содержащий электрофильный атом углерода. Помимо этого в ходе реакции образуется неактивный карбамат, не способный к реакции с нуклеофильными боковыми группами аминокислот. При взаимодействии имидокарбоната с нуклеофильными группами, прежде всего с e-аминогруппами лизина, происходит образование прочной ковалентной связи белка с активированной матрицей через остаток изомочевины или N-замещенного карбамата (рис. 1). Реакция активации матрицы бромцианом проходит только в щелочной среде с выделением бромистоводородной кислоты, для нейтрализации которой требуется постоянное добавление щелочи к реакционной смеси. Реакция бромциана с гидроксилами матрицы экзотермична, поэтому ее проводят на ледяной бане.

Рис. 1. Схема иммобилизации белка на BrCN-активированной сефарозе.

 

 

Содержание лиганда колеблется от 0,1 до 10 мкмоль на 1 г влажного сорбента. Сефароза, однако, малоустойчива к действию ряда химических веществ и микроорганизмов.

Основные требования к аффинной адсорбции

1. Лиганд должен быть присоединен к матрице таким образом, чтобы при

связывании его с белком не возникало серьезных затруднений.

2. Удлиняющий мостик между матрицей  и лигандом должен облегчать

доступ белка к лиганду.

3. Неспецифическое взаимодействие  не должно быть слишком сильным,

чтобы сопутствующие белки не могли связаться с адсорбентом.

4. Связь лиганда с матрицей должна быть стабильна в условиях хроматографии и в процессе регенерации адсорбента.

Более стабильны макропористые неорганические носители (кремнезем, или силика-гель, стекло) и органические полимеры. Если лиганд присоединяется непосредственно к носителю, эффективность специфического взаимодействия с ферментом заметно снижается вследствие пространственных затруднений. "Ножка", как правило, устраняет стерические препятствия, отдаляя лиганд от носителя. Как и носитель, она должна быть инертной и не влиять на процессы в ходе аффинной хроматографии, чего, однако, не всегда удается достигнуть. Например, присоединение "ножки" по приведенной выше реакции приводит к образованию катионной группировки изомочевины, и сорбент приобретает свойства анионита. В качестве "ножки" используют обычно ди- и полиамины, ω-аминокислоты, пептиды, олигосахариды . Лигандами могут служить такие субстраты как крахмал или гликоген, однако их превращение в ходе аффинной хроматографии, катализируемое разделяемым ферментом, постоянно изменяет свойства сорбента. Поэтому, как правило, применяют аналоги субстратов, устойчивые к дальнейшему превращению, т.е. ингибиторы ферментов. Так, для выделения протеиназ используют не расщепляемые ими пептиды D-аминокислот. Эффективны также природные ингибиторы ферментов, например, пепстатин - ингибитор аспартильных протеиназ. Иногда применяют лиганды, связывающие большие группы родственных ферментов (в частности, киназы и дегидрогеназы). Примеры таких "группоспецифических" лигандов - антрахиноновые красители, аналоги никотинамидаденин-динуклеотида. Известны лиганды (например, производные фенилборной кислоты), имитирующие при взаимодействии с ферментом структуру переходного комплекса с субстратом. Такие лиганды эффективны при выделении сериновых гидролаз.

В иммунохимических исследованиях с использованием BrCN-активированной сефарозы готовят два типа носителей — носители с иммобилизованными антигенами и носители с иммобилизованными антителами. Первые имеют ограниченное применение и используются, как правило, для выделения из сыворотки иммунного животного (содержащей антитела различной специфичности) пула антител, специфичных только к белку, иммобилизованному на носителе. Гораздо чаще на практике используют носители с иммобилизованными антителами. Основная область применения таких носителей — экстракция из грубой смеси макромолекул (как правило — белков). Высокая специфичность антител к антигену позволяет за короткий промежуток времени и в одну стадию получить высокоочищенный (с чистотой до 95-99%) препарат белка.

Рис. 2. Установка для колоночной иммуноаффинной хроматографии.

Экстракцию исследуемого белка из смеси осуществляют двумя способами. Первый, используемый, как правило, для получения препаративных количеств белка, основан на применении метода колоночной иммуноаффинной хроматографии (Рис.2). В зависимости от поставленной задачи аффинным носителем заполняют колонки различного диаметра (от нескольких миллиметров до метра) и через эти колонки пропускают белковый раствор, содержащий исследуемый антиген. Большинство макромолекул проходит, через частицы носителя не задерживаясь, в то время как между антителами, иммобилизованными на носителе, и антигеном, содержащимся в растворе, образуется иммунный комплекс (рис. 3). После отмывки носителя от не связавшихся белков иммунный комплекс разрушают, пропуская через носитель растворы с низкими (pH 2,0 — pH 4,0) или высокими (pH 11,0 — pH 12,0) значениями рН, либо растворы с высокой ионной силой (2М NaCl), либо растворы, содержащие хаотропные соединения (KSCN). При этом исследуемый белок элюируют с носителя, его собирают и переводят в оптимальный для хранения данного белка буфер.

Рис. 3. Схема хроматографии белков на аффинном носителе.

Второй способ экстракции исследуемого белка из сложной смеси — иммунопреципитация, или экстракция в объеме. Иммунопреципитацию используют при работе с незначительными (нано- и микрограммы) количествами вещества. При этом объем аффинного носителя обычно не превышает сотен микролитров, а объем исследуемого образца — нескольких миллилитров. То есть, иммунопреципитацию используют в тех ситуациях, когда из-за малого количества исследуемого вещества оказывается технически сложным создать адекватную по размерам аффинную колонку.

Рис. 4. Схема аффинного выделения белков методом иммунопреципитации.

При проведении иммунопреципитации образец, содержащий исследуемый белок, некоторое время инкубируют (при постоянном перемешивании) с частицами носителя. В процессе инкубации образуется иммунный комплекс, и исследуемый белок переходит из раствора на частицы носителя. После этого носитель осаждают, как правило, центрифугированием, супернатант отбрасывают, а иммунный комплекс, иммобилизованный на частицах носителя, разрушают добавлением тех же растворов, что и в случае с колоночной хроматографией (рис. 4). Также иммунный комплекс может быть разрушен ДСН-содержащим буфером, который используют для приготовления образца белка при проведении ДСН электрофореза. Такой буфер используют в том случае, если в дальнейшем планируют изучать экстрагированный белок с использованием метода электрофореза в денатурирующих условиях, или методом вестернблоттинг. Однако при использовании данного метода элюции белка следует учитывать, что повторное использование носителя становится невозможным из-за денатурации иммобилизованных антител. Кроме того, исследуемый образец помимо целевого белка будет содержать легкие и тяжелые цепи иммуноглобулинов.

 

 

 

Подвижная фаза аффинной хроматографии должна элюировать анализируемые соединения с оптимальными значениями k', обладать низкой вязкостью, обеспечивать необходимый уровень селективности, быть дешевой, нетоксичной, инертной, совместимой с методами детектирования (например, с УФ-детектором нельзя ис-пользовать в качестве элюента бензол). Обычно используют углеводороды (гексан, гептан, изооктан, циклогексан) с добавлением небольших количеств СНСl3, изо-С3Н7ОН, диизопропилового эфира. Если компоненты разделяемой смеси имеют близкие значения k', хроматографируют одним элюентом (изократический режим), если отдельные компоненты смеси сильно удерживаются сорбентом, используют серию элюентов возрастающей силы (ступенчатое или непрерывное градиентное элюирование).

Аффинная хроматография представляет собой один из наиболее специфических методов выделения реакционноспособных соединений, в частности, ферментов, и даже таких надмолекулярных агрегатов, как вирусы. Разделение биологически активных веществ в этом варианте хроматографии основано на их специфическом взаимодействии с лигандами, ковалентно связанными с нерастворимым носителем (матрицей). Сорбентом в этом случае служит гель типа агарозы, к которому ковалентно присоединен подходящий лиганд, например субстрат фермента. Когда раствор, содержа-щий выделяемое вещество (скажем, фермент), пропускают через колонку с соответствующим образом приготовленным сорбентом, взаимодействие этого вещества с закрепленным на сорбенте лигандом (в данном случае фермента с его субстратом) приводит к его удерживанию и, следовательно, к концентрированию. Поскольку сорбция носит обратный характер, это вещество можно затем элюировать с колонки. Разделение по методу аффинной хроматографии может быть основано на различного рода специфических взаимодействиях, таких как связывание фермента с ингиби-тором, гормона с рецептором, антигена с антителом, а также гибридизация полинуклеотидов. Этот метод позволяет выделять даже целые клетки.

 

 

 

 

 

 

 

Механизм разделения в аффинной хроматографии

Схематически механизм разделения в аффинной хроматографии

представлен на рис.12 [63]. Лиганд L фиксирован на матрице, целевое

вещество S связывается с лигандом и вследствие этого извлекается из раствора. На стадии элюирования комплекс разрушается и целевое вещество

вновь переходит в раствор.

Разделение основано на равновесной реакции:

L + S K,

где K – комплекс.

Взаимодействие вещество – лиганд должно быть специфическим и

обратимым. Характеристикой обратимости процесса является константа

диссоциации. Данные по константе диссоциации можно брать из литературных источников.

Лиганд должен иметь реакционноспособные функциональные группы, при помощи которых осуществляется его связь с матрицей, при этом

должна сохраняться биоспецифическая активность лиганда. Если лиганд

имеет несколько таких групп, его иммобилизация должна проводиться с

участием той из них, которая не входит в участок, взаимодействующий с

целевым веществом

 

 

 

Рис. 5. Механизм аффинной хроматографии:

Л - лиганд; Л — иммобилизованный лиганд; М — биологически активное вещество; МЛ - биоспецифический комплекс; ∆ - примеси; О - несорбирующиеся компоненты смеси

Активные центры многих биологически активных веществ (например, ферментов) часто локализованы в середине глобулы и недоступны для небольших молекул лигандов, непосредственно связанных с матрицей. По этому между матрицей и лигандом обычно встраивают дополнительный блок – «спейсер» (рис. 6).

Рис. 6. Иллюстрация роли «спейсера»: а – лиганд фиксирован непосредственно на матрице и недоступен для целевого вещества; б – лиганд фиксирован через промежуточный «спейсер» и способен взаимодействовать с молекулой целевого вещества

В качестве матрицы используются гели агарозы или полиакриламида. Выпускаются материалы с различными реакционноспособными группами, предназначенными для взаимодействия с лигандом. Схема реакции активации агарозы с помощью бромциана представлена на рис. 14а. На рис 14в приведена структурная формула активированной молекулы, готовой для связывания с лигандом. Выбор типа геля определяется типами функциональных групп лиганда.

 

Рис. 7. Активация молекулы агарозы и конденсация ее с лигандами: а – получение активированной молекулы агарозы; б – молекула агарозы, подготовленная для непосредственной конденсации с лигандом; в – конденсация активированной агарозы с лигандом или «спейсером», несущим амино- или карбоксигруппу

 

 

 

Аффинную хроматографию проводят в водных буферных растворах, подбирая оптимальные условия для каждого конкретного случая. Можно создать такие условия (значение рН раствора и концентрации соли), при которых взаимодействие целевого вещества с лигандом будет наиболее сильным. Среди других методов выделения веществ аффинная хроматография занимает особое место, поскольку процесс идет крайне специфически с использованием биологической активности целевого вещества. Эта особенность позволяет концентрировать целевые вещества из больших объемов растворов.

Аффинная хроматография применяется для выделения следующих классов веществ: аналогов субстратов, ингибиторов, кофакторов (при этом роль лигандов играют ферменты; антигенов, вирусов, клеток (лиганды –антитела); полисахаридов, гликопротеинов, клеток (лиганды – лектины); гистонов, полимераз (лиганды – нуклеиновые кислоты); рецепторов, бел-ков-переносчиков (гормоны, витамины); белков, специфически взаимодей-ствующих с мембраной клетки, лектинов (лиганды – клетки).

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Разновидности аффинной хромотографии

Одной из разновидностью афинной хроматографии является металхелатная хроматография, основанная на образовании комплексов между нанесенным на сорбент ионом металла, например кадмия или никеля (никель-хелатная хроматография), и специфичеким линкером, обычно 6-10 остатков гистидина, химически связанным с целевым белком (Рис. 2). Особенно часто данный метод применяется при очистке генноинженерных белков, генетический код которых заклонирован в специально сконструированные плазмиды. В результате чего молекула белка экспрессируется с присоедененным полигистидиновым концом, за счет которого она специфичеки связывается ионом металла при нанесении на колонку, а примеси при этом не задерживаются, что позволяет достичь очень большой чистоты целевого продукта при минимальных затратах. Также, при необходимости возможно провести ренатурацию связанных с сорбентом белков (например обратным градиентом мочевины) после чего элюировать уже чистый биологически активный белок.

Рис. 7. Прикрепление белка с гистидиновой зацепкой к грануле в аффинной колонке. Около 10 гистидиновых остатков присоединены к белку с помощью генетической инженерии, например, сочетанием сайт-специфического мутагенеза с полимеразной цепной реакцией (ПЦР) (см. Nolting, 1999b).

Гистидиновые остатки прочно связываются с гранулами, сделанными из никель-хелатирующей смолы.

Также возможен несколько иной вариант аффинной хроматографии, в котором неправильно свернутый белок с помощью шаперонов сворачивается правильным образом и элюируется буферным раствором (Рис. 3).

 

 

Рис. 8. Исправление свертывания дорогих, плохо сворачивающихся, белков: шапероны, называемые также шаперонинами, прикреплены к гранулам, и развернутый или неправильно свернутый белок пропускается сквозь колонку. Шаперон взаимодействует с образцом белка и катализирует его сворачивание в правильной конформации.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Список литературы

1.Аффинная хроматография: Методы: Пер. с англ./ Под ред. П.Дина, У.Джонсона, Ф.Мидла. – М.: Мир, 1988 – 278с., ил.

2.А.Н. Ибрагимов, А.Г. Бикмуллин, Д.А. Сатаева, Л.В. Лопухов,

Л.И. Зайнуллин, Ф.К. Алимова

ХРОМАТОГРАФИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ОЧИСТКИ БЕЛКОВ

УЧЕБНО-МЕТОДИЧЕСКОЕ ПОСОБИЕ

3.Остерман Л.А. Хроматография белков  и нуклеиновых кислот. – М.:, Наука, 1985. – 536 с.

4.Туркова Я. Аффинная хроматография: Пер. с англ. – М.: Мир, 1980. – 472 с.