Диагностические препараты. Диагностикумы и антигены
Государственное
бюджетное образовательное
высшего профессионального образования (ГБОУ ВПО)
«Томская государственная медицинская академия»
Минздрава РФ
Кафедра управления и экономики фармации,
с курсами ботаники, фармакогнозии, фармацевтической технологии,
фармацевтической и
РЕФЕРАТ
ДИАГНОСТИЧЕСКИЕ ПРЕПАРАТЫ. ДИАГНОСТИКУМЫ И АНТИГЕНЫ
Выполнила студентка ____________ Валерия Сергеевна Иванова
Научный руководитель ____________ Татьяна Михайловна Сидорова
к.б.н., ассистент кафедры
Томск 2013
СОДЕРЖАНИЕ
ВВЕДЕНИЕ…………………………………………………………
Глава 1 ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ О ДИАГНОСТИКУМАХ………………………………5
Глава 2 ДИАГНОСТИКУМЫ ДЛЯ РАСПОЗНАВАНИЯ
ИНФЕКЦИОННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ…………………………………………………
2.1 Бактерийные диагностикумы……………………………………………
2.2 Риккетсиозные диагностикумы……………………………………………
2.3 Вирусные диагностикумы – антигены……………………………………………..15
ЗАКЛЮЧЕНИЕ……………………………………………………
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК…………………………………………………..18
ВВЕДЕНИЕ
Эпидемическая обстановка в
мире никогда не была спокойной. Все
время наблюдались вспышки
Хорошо известно, что профилактика является самым эффективным и самым экономичным способом сохранения здоровья людей.
Люди научились бороться с инфекциями, однако их иммунная система стала слабее реагировать на патогены и не всегда справляется с инфекционными заболеваниями [2].
Диагностические препараты
относятся к
Диагностикумы применяют для выявления специфических антигенов и антител, аллергенов, сенсибилизированных иммунокомпетентных клеток, факторов естественной резистентности, иммунорегуляторов. В соответствии с целевым назначением диагностических препаратов они содержат те или иные специфические иммунореагенты (антигены, антитела, аллергены, иммуномодуляторы, факторы естественного иммунитета и др.), которые используют для выявления объекта исследования в определенных реакциях или тест-системах. Эффект реакции в соответствии с характером иммунореагентов и механизма реакции регистрируют по физическим (например, мутность), химическим (например, изменение цветности) или клиническим (симптомы и проявления) показателям [1].
На основе перечисленных
иммунологических реакций созданы
сотни современных
Целью моей работы является изучение антигенных диагностикумов.
Для достижения данной цели необходимо решить следующие задачи: провести обзор соответствующей литературы, ознакомиться с понятиями антигенной диагностики, определить степень значимости в современной медицине.
Глава 1 ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ О ДИАГНОСТИКУМАХ
Диагностикумы – это взвеси убитых микробов, чаще всего в физиологическом растворе, применяемые в качестве антигенов для серологических реакций. Преимущество диагностикумов перед живой культурой заключается в стабильности их агглютинабильных свойств, стандартности, безопасности и простоте обращения с ними. Использование диагностикумов дает возможность широко применять серологические методы в практике массовой работы. Особое значение имеют диагностикумы в случаях, когда работа с живыми бактериями или вирусами опасна из-за их высокой инфекционности (например, с бруцеллами, туляремийными бактериями, вирусами клещевого и японского энцефалитов и др.). Диагностикумы, используемые для распознавания инфекционных заболеваний, делятся на бактерийные, риккетсиозные и вирусные. С их помощью в сыворотке больных можно определить наличие антител по отношению к определенному виду микроба-возбудителя [1].
Более тонкие различия антител в изучаемой сыворотке устанавливают при помощи специфических монодиагностикумов. Так, при брюшном тифе для определения групповых О-антител и видовых Н-антител применяются соответствующие О- и Н-диагностикумы из культуры брюшнотифозных бактерий 0-901 или бактерий паратифа № 2, обладающих общим О-антигеном с брюшнотифозными бактериями; Н-диагностикум представляет собой взвесь бактерий, обладающих выраженной подвижностью [3].
Диагностические препараты применяются для следующих целей:
- для определения с помощью специфических иммунных сывороток вида или типа микроба выделенного от больного, носителя или из объектов внешней среды;
- для обнаружения с помощью диагностикумов антител в сыворотке больных или реконвалесцентов;
- для выявления с помощью аллергенов перестройки организма, возникающей при некоторых инфекционных заболеваниях.
Все диагностические препараты представляют собой антигены или антитела [4].
Глава 2 ДИАГНОСТИКУМЫ ДЛЯ РАСПОЗНАВАНИЯ ИНФЕКЦИОННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ
2.1 Бактерийные диагностикумы
Для приготовления бактерийных диагностикумов берется агаровая суточная культура определенного вида микроба, находящегося в S-форме. Культуры должны агглютинироваться соответствующими эталонными сыворотками в разведении до титра, определяемого реакцией агглютинации на три креста, а также быть типичными по морфологическим и биохимическим свойствам. Агглютинация с гетерологичными сыворотками в разведении выше 1/8 титра не должна иметь места [1].
Производство диагностикумов, как и всех биологических препаратов, требует стерильных условий. Проверенные 18-20 часовые агаровые культуры или 4 часовые бульонные засевают на матрацы с агаром, приготовленным на мясном, дрожжевом или казеиновом гидролизате. Через 18-20 часов инкубации в термостате при 37 °С из культур делают мазки (с каждого матраца отдельно) для проверки чистоты. Затем культуру смывают физиологическим раствором и полученную взвесь разных штаммов одного вида микробов сливают в одну градуированную бутыль. При массовом производстве применяется котловой метод выращивания бактерий. Диагностикумы готовят из разных количеств штаммов соответствующих микробов [5].
Густоту маточной взвеси определяют по оптическому стандарту. Допускается получение маточной взвеси, содержащей в 1 мл 10 млрд. микробных тел. Далее маточная взвесь инактивируется. Инактивацию можно проводить различными способами: прогреванием, действием формалина, алкоголя и др. Так, для определения фагоцитарной активности лейкоцитов диагностикумы готовят из микробов, убитых нагреванием, так как фенол или формалин обусловливают отрицательный хемотаксис лейкоцитов.
При изготовлении формалинизированных диагностикумов к 10-миллиардной взвеси добавляют разные количества формалина в зависимости от вида диагностикума. После прибавления формалина бутыль закрывают резиновой пробкой, тщательно встряхивают и помещают в термостат при 37 °С на 18-20 часов или оставляют на 2 суток при комнатной температуре. По истечении этого срока производят посев для определения стерильности, после чего проверяют агглютинабильность маточной взвеси с гомологичными сыворотками. Маточную взвесь разводят формализированным 0,1 % физиологическим раствором до густоты в 3 млрд. по оптическому стандарту. После разведения диагностикума снова производят контроль на стерильность [6].
Для изготовления спиртового диагностикума суточная культура О-штамма смывается с матрацев физиологическим раствором, содержащим 0,5 % карболовой кислоты. Маточная взвесь разводится до густоты 4-х млрд. в 1 мл. Для разведения применяется смесь карболизированного физиологического раствора с 96 % этиловым спиртом, взятым в соотношении 1:2. Спирт предварительно фильтруется через бактериальный фильтр. Содержимое бутылей тщательно перемешивается. Диагностикум помещается на 48 часов в термостат при 37 °С и затем оставляется на трое суток при комнатной температуре. Спиртовые диагностикумы также контролируются на стерильность [4].
Готовый диагностикум проверяют на агглютинабильность гомологичной агглютинирующей сывороткой и для выявления групповых агглютининов - гетерологичными сыворотками. Кроме того, диагностикум испытывают в реакции агглютинации с сыворотками здоровых людей (5 сывороток). Реакцию агглютинации с диагностикумами ставят по классической методике [1].
Готовые диагностикумы разливают в ампулы по 5 или 10 мл; они, как правило, содержат 3 млрд. микробных тел в 1 мл за исключением туляремийного, содержащего 50 млрд. бактерий в 1 мл, и бруцеллезного диагностикума, содержащего 20 млрд. микробных тел в 1 мл. После контроля производят этикетировку препарата. Диагностикумы годны в течение года с момента разведения маточной взвеси.
Формалинизированные Н-диагностикумы дают крупнохлопчатую Н-агглютинацию, при которой хлопья легко разбиваются, в связи с чем при чтении реакции следует избегать сильного встряхивания пробирок. О-диагностикумы дают мелкозернистую агглютинацию, не разбивающуюся при встряхивании [3].
Используется также Vi-
Микробная клетка представляет
собой сложный глюцидо-
Антигены из микробных клеток извлекают и другими способами: многократным замораживанием с последующим оттаиванием, кипячением, действием ультразвука, спирта, соляной кислоты и др.
Бактерийные антигены применяются в реакциях преципитации, пассивной гемагглютинации с диагностическими целями и для изучения антигенного аппарата микробов и их типизации [4].
В настоящее время разработаны методы приготовления эритроцитарных диагностикумов с длительным сроком годности. Действующим началом их являются извлеченные из тех или иных микроорганизмов антигены, которыми сенсибилизированы эритроциты.
Принцип приготовления эритроцитарных диагностикумов сводится к следующему: дефибринированная кровь человека О (1) группы или барана фильтруется через марлю и трижды отмывается на центрифуге охлажденным физиологическим раствором. После этого производится обработка эритроцитов формалином. Готовят взвесь, содержащую 12,5 % эритроцитов, в нее помещают целофановый мешок с формалином и встряхивают на шюттель-аппарате в течение 16 часов. В первые 2 часа формалин поступает через поры целофана, затем его прокалывают и, наконец, разрывают. Этот прием позволяет получить медленное вначале и постепенно усиливающееся действие формалина на эритроциты. По окончании срока встряхивания эритроциты вновь фильтруют через марлю, отмывают 6 раз десятикратным объемом охлажденного до 4-5 °С физиологического раствора на центрифуге при 2500-3000 об/мин, соединяют с равным объемом стерильного нейтрального физиологического раствора и разливают во флаконы. В таком виде формалинизированные эритроциты можно хранить до года. В дальнейшем, в зависимости от характера антигена, эти эритроциты либо обрабатывают дополнительно таннином, либо соединяют с антигеном без этой обработки [1].
Так, для приготовления дифтерийного и столбнячного эритроцитарных диагностикумов, формалинизированные эритроциты отмывают один раз физиологическим раствором (рН 7,2), разводят их до 2,5 % концентрации, добавляют равный объем таннина в разведении 1:20000, взбалтывают и выдерживают 15 минут при комнатной температуре. Затем эритроциты отмывают 3 раза пятью-шестью объемами физиологического раствора (рН 7,2). Проверяют на отсутствие спонтанной агглютинации, готовят 2,5 % взвесь, к которой прибавляют очищенные, концентрированные анатоксины - дифтерийный (10-20 Lf на один миллилитр взвеси) или столбнячный (5-10 ЕС на один миллилитр взвеси).
Смесь выдерживают при 37 °С – 3 часа. За один час до окончания инкубации добавляют 1 % формалина, встряхивают жидкость до образования равномерной взвеси. После этого срока эритроциты снова отмывают три раза нейтральным физиологическим раствором, содержащим 1 % формалина. Отмытые сенсибилизированные эритроциты разводят фосфатно-буферным раствором (рН 7,0) с формалином (1 %) так, чтобы в 0,05 мл взвеси содержалось 6-8 млн. эритроцитов (подсчет в камере Горяева). В препарате проверяют густоту взвеси, отсутствие спонтанной агглютинации, специфическую активность с соответствующими иммунными сыворотками. Для контроля применяют эритроциты, обработанные таким же способом только не сенсибилизированные антигеном.
Срок годности столбнячного и дифтерийного эритроцитарных диагностикумов – 6 месяцев [4].
При изготовлении туляремийного эритроцитарного диагностикума формалинизированные эритроциты сенсибилизируют антигеном, полученным по методу Буавена и Мезробеану из высушенных туляремийных бактерий.
Для постановки реакции употребляют 2,5 % взвесь сенсибилизированных эритроцитов. Активность препарата проверяют в реакции непрямой гемагтлютинация с агглютинирующей противотуляремийной сывороткой. Если сенсибилизированные эритроциты агглютинируются этой сывороткой в разведении ее меньшем, чем предусмотрено инструкцией – эритроцитарный диагностикум бракуется.
Срок годности препарата – 9 месяцев [6].
Эритроцитарный Ви-диагностикум представляет собой формалинизированные эритроциты человека 0 (1) группы, сенсибилизированные очищенным Ви-антигеном брюшнотифозных бактерий, в фосфатно-буферном физиологическом растворе. Препарат стандартизируют таким образом, чтобы 1 мл взвеси содержал 50 млн. эритроцитов. Специфическая активность эритроцитарного Ви-диагностикума определяется в РНГА с одной адсорбированной брюшнотифозной Ви-сывороткой и пятью сыворотками людей, привитых против брюшного гифа. Препарат годен в течение шести месяцев [5].
2.2 Риккетсиозные диагностикумы
Для дифференциальной диагностики риккетсиозов серологическим методом в постановке реакций связывания комплемента и агглютинации широко применяются цельные риккетсиозные антигены. Для приготовления диагностикумов из риккетсий могут быть использованы куриные эмбрионы, белые мыши, платяные вши. Для заражения куриных эмбрионов используются штаммы риккетсий Провачека, Музера и Бернета.
Риккетсии культивируют в желточном мешке эмбриона. После размножения риккетсий желточные мешки, извлеченные стерильными пинцетами из вскрытых яиц, помещают в стерильные банки со стеклянными бусами (5-10 желточных мешков в банку) и измельчают путем тщательного встряхивания. К полученной массе добавляется физиологический раствор из расчета 10 мл на 1 желточный мешок. Все вновь тщательно встряхивается для лучшего измельчения тканей, и затем, в каждую банку добавляется еще 100 мл физиологического раствора, содержащего формалин в количестве от 0,8 (для культур риккетсий Провачека и Музера) до 1 % (для риккетсий Бернета) и 10 % фосфатного буфера с рН 7,0. После встряхивания банки помещаются в рефрижератор и хранятся там до истечения срока обезвреживания [1] .
В дальнейшем полученная указанным способом первичная взвесь риккетсиозного материала сводится в бутыли соответствующей емкости (по 100 желточных мешков).
Дальнейшая обработка первичной взвеси риккетсий Провачека и Музера производится не ранее 48 часов пребывания риккетсиозного материала в формалинизированном физиологическом растворе, а риккетсий Бернета только после 15 дней пребывания в этих же условиях.
Обработка первичной взвеси производится методом сепарирования или центрифугирования в комбинации с эфирной обработкой. Осадок после третьего сепарирования состоит обычно из чистых риккетсий. Сепарированием и эфирной обработкой достигается отделение риккетсий от тканевых примесей [2].
Риккетсиозная взвесь стандартизуется по оптическому бактерийному стандарту и доводится путем разведения стерильным физиологическим раствором с 5 % сахарозы до концентрации, соответствующей мутности 2 млрд. микробных тел в 1 мл. Стандартизованная взвесь разливается в ампулы по 0,5 мл, замораживается при t -20 – 25°С и высушивается в вакууме. Риккетсиозный антиген подвергается контролю на растворимость, правильность стандарта, ставятся реакции агглютинации и связывания комплемента с типовой иммунной сывороткой, проводится микроскопический контроль на отсутствие бактериального загрязнения. Сухой антиген хранится при температуре +4 – +10°С. Он годен в течение 2,5 лет.
Для серологической диагностики некоторых риккетсиозов, например, исторического сыпного тифа, применяется антиген из риккетсий, культивированных в кишечниках вшей [1] .
Для изготовления антигена используется несколько штаммов риккетсий Провачека, выделенных от больных сыпным тифом. Этими штаммами заражают с помощью микроклизмы взрослых, здоровых платяных вшей. До момента гибели их кормят один раз в день на донорах, перенесших сыпной тиф или привитых.
Зараженные вши погибают в сроки от четвертого до восьмого дня. После гибели их помещают в 0,5 % фенол, через 2-3 дня вскрывают, отсепарировают кишечники, растирают их в ступке с физиологическим раствором, содержащим 0,5 % фенола, затем взвесь центрифугируется или оставляется для осаждения крупных частиц [1].
Антиген представляет собой взвесь в физиологическом растворе убитых фенолом риккетсий Провачека, культивированных в кишечниках зараженных вшей. Он содержит в 1 мл 3-5 млрд. риккетсий (50-60 кишечников зараженных вшей).
Для предупреждения порчи от замерзания во время транспортировки в некоторые серии добавляют 10 % глицерина; это не отражается на специфической активности препарата, но делает его более морозоустойчивым. Готовый антиген проверяют на агглютинабильность сыворотками сыпнотифозных больных или типовыми иммунными сыворотками и сыворотками здоровых людей. Готовый антиген испытывается на специфическую стерильность путем внутрибрюшинного введения 2 мл взвеси осадка антигена морским свинкам или вшам по методу Вейгля. У свинок ежедневно измеряют температуру. Если у них не отмечается повышения температуры, антиген считается специфически стерильным. При заражении вшей микроскопическое исследование мазков из кишечников проводится с 6-го по 10-й день, в мазках не должны обнаруживаться риккетсии [5].
Готовый диагностикум разливается в ампулы по 1,5 или 10 мл. Срок годности равен 1 году. Препарат проходит контроль на стерильность, соответствие стандарту и агглютинабильность.
Применяется в реакции макроагглютинации. Характер агглютинации риккетсий мелкозернистый. Реакция высокоспецифична. Положительный результат 1:40 считается диагностическим титром.
В разведенном виде препарат можно применять для реакции связывания комплемента.
Помимо вышеперечисленных антигенов для диагностики эпидемического сыпного тифа и крысиного риккетсиоза применяется антиген, приготовленный из легких белых мышей, зараженных риккетсиями Провачека и Музера.
Богатые риккетсиями мышиные легкие размельчаются в ступке с кварцевым песком и разводятся формалинизированным физиологическим раствором из расчета 3-4 мл на легкое.
Далее формалинизированная взвесь центрифугируется дважды: один раз при 1500 оборотах в минуту для удаления тканевых примесей, другой раз при 3000 оборотах в минуту для получения риккетсий в осадке. Осадок обрабатывается физиологическим раствором, содержащим 0,4 % формалина и 0,5 % фенола.
В дальнейшем он подвергается обработке эфиром, после чего к нему добавляется сахароза и производится высушивание из замороженного состояния в условиях глубокого вакуума.
Готовый препарат представляет собой сухой антиген из хорошо очищенных убитых формалином риккетсий, подвергнутый контролю по вышеописанной методике [3].
2.3 Вирусные диагностикумы - антигены
Вирусные диагностикумы представляют собой антигены, используемые для серологических реакций. В зависимости от цели применения их подразделяют на антигены для реакции связывания комплемента и антигены для реакции торможения гемагглютинации.
Для изготовления диагностикумов из разных вирусов используются преимущественно следующие инфицированные материалы: для вируса гриппа - аллантоисная жидкость, для эпидемического паротита - амниотическая или аллантоисная жидкость, для орнитозов и лимфогранулемы - желточные мешки куриных эмбрионов, для вирусов энцефалитов - мозговая ткань мышей, куриных эмбрионов или культура тканей, для аденовирусов и полиомиелита - культуральные жидкости. Диагностикумы из аллантоисной и амниотической жидкости употребляют в нативном виде, другие - требуют специальной сложной обработки, так как обладают антикомплементарными свойствами [2].
Методы обработки антигенов делятся на физические и физико-химические. Из физических методов наибольшее применение имеет метод повторного замораживания и оттаивания, т.е. термолизис. Из физико-химических методов - обработка эфиром и хлороформом.
Метод термолизиса заключается в следующем: готовится 10 % суспензия на физиологическом растворе из инфицированной ткани, куда добавляется 2 % инактивированной сыворотки морской свинки. После 18-20 часового экстрагирования при 4 °С крупные тканевые частицы удаляют путем центрифугирования в течение 30 минут при 2500 оборотах. Надосадочная жидкость подвергается пятикратному замораживанию (при -7 °С) и оттаиванию (при +7 °С). Затем жидкость центрифугируют в течение часа при 3500 оборотах в минуту. Приготовленный таким образом диагностикум представляет собой слегка опалесцирующую жидкость [2].
Обработка вирусных диагностикумов физико-химическим методом заключается в том, что готовят суспензию, как описано выше для термолизиса, к ней добавляют полуторный объем эфира или хлороформа и в течение 2 часов производят встряхивание. Материал помещают на 18 часов в холодильник при 4 °С. Затем центрифугируют в течение 30 минут при 3000 оборотах в минуту. Происходит расслоение суспензии. В случае обработки эфиром антиген будет в нижнем слое, а при обработке хлороформом – в верхнем. Готовый антиген по внешнему виду представляет прозрачную жидкость. Вирусные диагностикумы не должны содержать живых вирусов. Инактивирование их производится либо прогреванием (37 °С), либо действием химических веществ (формалин, бетапропиолактон).
Существует значительное количество модификаций приготовления антигенов применительно к тому или иному вирусу. Выпускаются вирусные, антигены для диагностики следующих заболеваний: японского и клещевого энцефалита, лимфоцитарного хориоменингита, орнитозов, гриппа и эпидемического паротита, венесуэльского энцефаломиелита, западного энцефаломиелита лошадей, аденовирусных инфекций и др.
При многих инфекционных заболеваниях изменяется реактивность организма к возбудителю инфекции или его продуктам. Такая измененная реактивность организма называется инфекционной аллергией [1] .
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Ежегодно в нашей стране миллионы людей сельскохозяйственных животных болеют различными инфекциями, в том числе острыми кишечными заболеваниями. Экономический ущерб от этих заболеваний огромен.
Одним из важных этапов борьбы
с инфекциями является их ранняя диагностика.
Наиболее длительным и трудоемким этапом
микробиологического
Бурный научно-технический
прогресс во всех областях знаний, в
том числе и в области
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК
- Борисов, Л.Б. Медицинская микробиология, вирусология и иммунология. / Л.Б. Борисов, – М.: Наука, 2005 г. – 156 с.
- Виестур У.Э. Биотехнология: биологические агенты, технология, аппаратура. / У.Э. Виестур – Рига: Знание, 2008 г. – 169 с.
- Егоркина, Н.Е. Биотехнология. / Н.Е.Егоркина. – М., Высшая школа, 2005 г. – 543 с.
- Егорова, Н.С. Промышленная микробиология. / Н.С. Егорова, – М.: Высшая школа, 2009 г. – 192 с.
- Львов, Д.К. Медицинская вирусология. / Д.К. Львова, - М.: Медицинское информационное агентство, 2008 г. - 238 с.
- . Петров, В.Д. Иммунология. / В.Д. Петров, - СПб: Лань, 2010 г. – 575 с.

- Диагностические признаки анемий
- Диагностические признаки минералов
- Диагностические свойства минералов
- Диагностический анализ и его применение в совершенствовании систем управления
- Диагностический комплекс для детей с ЗПР
- Диагностическое интервью
- Диагностическое и статистическое руководство по психическим расстройствам DSM-IV
- Диагностическая значимость рисунка
- Диагностическая программа по определению психологической готовности детей к школьному обучению
- Диагностическая процедура и влияние культуры
- Диагностическая психология
- Диагностическая работа психолога по защите детей от жестокого обращения
- Диагностические параметры
- Диагностические препараты