Достижение генной инженерии

Министерство  образования и науке РФ

Федеральное агентство по образованию

Государственного  образовательного учреждения

Высшего профессионального образования 
 

Кафедра физики, теории и методики обучения физики. 
 

  «Достижения генной инженерии»

Реферат 
 

Выполнил:

Проверил:  
 
 
 
 
 
 
 
 

2011

СОДЕРЖАНИЕ

Введение ........................................................................................3

1. Генная инженерия.......................................……………………4-5

1.1. Методы генной инженерии ....................................................6-10

1.2. Методы введения ДНК в бактериальные клетки..................11-14

1.3. Генетическая рекомбинация in vitro ………………………..15-16

2. Достижения генной инженерии.....................................………17 -21

2.1. Молекулярная геномика………………………………………22-24

2.2. Генная терапия……………………………………………………25

Заключение ..............................................………………………….26

Список литературы ..................................…………………………27 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

Введение  

В своей работе я раскрываю тему достижений генной инженерии . Возможности, открываемые  генетической инженерией перед человечеством  как в области фундаментальной  науки, так и  во многих других областях, весьма велики и нередко даже революционны. Так, она позволяет осуществлять индустриальное массовое производство нужных белков, значительно облегчает  технологические процессы для получения  продуктов ферментации — энзимов  и  аминокислот, в будущем может  применяться для улучшения растений и животных, а также для лечения  наследственных болезней человека. Таким  образом, генная инженерия, будучи  одним из магистральных направлений  научно-технического прогресса, активно  способствует ускорению решения  многих задач, таких, как продовольственная, сельскохозяйственная, энергетическая, экологическая.

Но особенно большие возможности генная инженерия  открывает перед медициной и  фармацевтикой, поскольку применение генной инженерии и гибридомных  методов может привести к коренным преобразованиям медицины. Многие болезни, для которых в настоящее время  не существует адекватных методов диагностики  и лечения (раковые, сердечно-сосудистые, вирусные и паразитные инфекции, нервные  и умственные расстройства), с помощью  генной инженерии станут доступны и  диагностике, и лечению.  
 
 
 
 
 
 
 
 
 

Генная инженерия 

За последние 10—15 лет были созданы принципиально  новые методы манипулирования с  нуклеиновыми кисло­тами in vitro, на основе которых зародился и бурно  развивается новый раздел молекулярной биологии и генетики — генная инженерия. Принципиальное отличие генной инженерии  от использовавшихся ранее традиционных приемов изменения состоит в  том, что она дает возможность  конструировать функционально активные генетические структуры in vitro в форме  рекомбинантных ДНК.

Понятия «генная» и «генетическая» инженерия часто  употребляют как синонимы, хотя последнее  является более широким и включает манипулирование не только с отдельными генами, но и с более крупными частями генома. Работа по переделке  генотипа животных или растений с  помощью скрещиваний ограничены пределами вида либо близких в  видовом отношении форм. Напротив, генная инженерия, как будет показано ниже, стирает межвидовые барьеры, обеспечивая  возможность создания организмов с  новыми, в том числе и не встречающимися в природе, комбинациями наследственных свойств.

Генная инженерия  представляет собой совокупность методов, позволяющих не только получать реконбинантные ДНК из фрагментов геномов разных организмов, но и вводить такие  рекомбинантные молекулы в клетку, создавая условия для экспрессии в ней введенных, часто совершенно  чужеродных генов. Таким образом, в  этом случае исследователь оперирует  непосредственно с генами, причем их перенос может не зависеть от таксономического родства используемых организмов. Эта особенность генной инженерии представляет ее главное  отличие от ранее исполь­зовавшихся  приемов изменения генотипа.

Первенствующую  роль в формировании генной инженерии  сыграла генетика микроорганизмов, идеи и методы, разработанные молекулярной генетикой и химией нуклеиновых  кислот. Формальной датой рождения генной инженерии считают 1972 г., когда  группа П. Берга в США создала  первую рекомбинантиую ДНК in vitro, объединившую в своем составе генетический материал из трех источников: полный геном  онкогенного вируса обезьян SV40, часть  генома умеренного бактериофага К и  гены галактозного оперона Е. coli. Сконструированная  рекомбинантная молекула не была исследована  на функциональную активность, поскольку у авторов этой работы возникли опасения, что методы генной инженерии могут привести к появлению

микроорганизмов, опасных для здоровья человека, например бактерий Е. coil, способных перенести  онкогенные вирусы животных в кишечник человека. Разработанные позднее  правила работы с рекомбинантными  молекулами позволили практически  устранить возможность вредных  последствий создания рекомбинантных ДНК, объединяющих в своем составе  гены разного происхождения. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

Методы генной инженерии 

Возможность выделения  отдельных генов в составе  относительно небольших фрагментов ДНК была продемон­стрирована незадолго  до возникновения генной инженерии  в экспериментах in vitro . В 1969 г. Дж. Беквит, Дж. Шапиро и другие опубликовали работу по выделению генов лактозного оперона  Е.coli, основанную на сочетании традиционных методов генетики микроорганизмов  и физических методов выделения  и гибридизации молекул ДНК.

Отдельные гены с целью их последующего молекулярного  клонирования в составе рекомбинантных ДНК методами генной инженерии могут  быть получены следующими способами: 1)непосредственным выделением из природных источников; 2)путем химического синтеза;3) копированием соответствующей гену и РНК для получения комплиментарной ДНК-вой реплики (к ДНК).

Первый метод  широко использовался на раннем этапе  развития генной инженерии. Тотальную  ДНК из разных источников подвергали деградации различными рестриктазами, сшивали с векторными молекулами, вводили в реципиентные клетки и  отбирали клоны с гибридными молекулами, включавшими требуемый ген, по появлению  соответствующих маркеров донора (например, устойчивости к определенному антибиотику) либо с помощью специальных иммунологических и гибридизационных методов. Этот метод  не утратил своего значения и успешно  применяется, например для создания банка генов.

Искусственный синтез гена впервые осуществлен  химическим путем в 1969 г. группой  Кораны с сотрудниками. Химическому  синтезу генов существенно способствовало совершенствование методов изучения первичной структуры белков или  других продуктов, кодируемых синтезируемым  геном, а также методов определения  первичной структуры (секвенирования) нуклеиновых кислот. Секвенирование ДНК играет большую роль не только в работах по химическому синтезу  генов, но и при изучении их функции, их регуляторных последовательностей, а также целых генетических систем, например мобильных диспергированных генов у эукариот.

Анализ первичной  структуры ДНК, т. е. установление последовательности нуклеотидных остатков в ее молекуле, в настоящее время основан  на двух методах — методе химической деградации (А. Максам и В. Гилберт, 1977) и методе полимеразного копирования с использованием терминирующих аналогов нуклеотидов (Ф. Сэнгер, 1977).

В практике генной инженерии широко распространен  и третий метод искусственного получения  генов, основанный на их ферментативном синтезе с помощью механизма  обратной транскрипции. Этот механизм связан с активностью РНК-зависимой  ДНК-полимеразы или обратной транскриптазы  — фермента, впервые обнаруженного  при исследовании репликации  РНК  онкогенных вирусов. Фермент способен строить ДНК-копии на разных РНК, включая синтетические полирибонуклеотиды. С помощью обратной транскриптазы, называемой иногда ревертазой, можно  синтезировать практически любой  индивидуальный ген в присутствии  соответствующих иРНК, методы выделении  которых достаточно разработаны. В 70-е годы появились методы выделения  в чистом виде фрагментов ДНК с  помощью электрофореза. В руки ученых попали "молекулярные ножницы".

Транспортным  средством переноса генетической информации в клетку стал вирус. Явление трансдукции  — переноса генов из одной клетки в другую с помощью вирусов  изучали еще с 50-х годов. Но вирус  не должен был сразу уничтожать всю  клетку, поэтому не все вирусы подходили  для этой роли.

Известно, что  бактериальные клетки могут обмениваться генетическим материалом при помощи плазмид (небольших частиц с фрагментами ДНК). Поэтому введение нужного гена в плазмиду позволяет в дальнейшем перенести этот ген в бактерию (это еще один из механизмов транспорта в генной инженерии). Появилась возможность изучать распределение нуклеотидов в оп­ределенном гене или получать нужный белок. Для этого создается рекомбинантная ДНК, которая возникает, когда ДНК одного организма внедряется в клетки другого. В качестве последнего используются клетки организма, который размножается много быстрее первого, например, бактерии. Так, в 80-е годы были разработаны интерфероны ~ белки, способные подавлять размножение вирусов. Были выбраны наиболее подходящие для переноса гены и мобильные участки ДНК. Например, культурным растениям вводят гены, повышающие их иммунитет и устойчивость.

В 1983г. Барбара  Мак-клинток при изучении генетики кукурузы обнаружила в ее геноме один "подвижный" ген, отвечающий за цвет початка. Независимо от нес подвижные  гены были открыты методами молекулярной генетики советским ученым Г. П. Георгисвым. В 1981 г. процесс выделения генов  и получения из них различных  цепей был автоматизирован.

При всем разнообразии методов основная схема любой  генно-инженерной работы остается неизменной. Она включает:обработку кольцевой  векторной молекулы рестриктазой с  образованием линейной формы ДНК;сплавление ее с фрагментом чужеродной ДНК, ведущее  к формированию гибридной структуры;введение гибрида в клетку реципиента; отбор  клонов трансформированных клеток на селективных средах; доказательство присутствия рекомбинантной ДНК  в этих клонах путем ее выделения  из клеток, обработки соот­ветствующими  рестриктазами и анализа образовавшихся фрагментов методом электрофореза  в агарозном геле.

Известно несколько  методов объединения фрагментов ДНК из разных источников, позволяющих включить клонируемую донорную ДНК в состав вектора. Один из них основан на соединении фрагментов, каждый из которых несет идентичные «хлипкие» концы, полученные под действием одной и той же рестриктазы. При другом методе, ферментативном, используется возможность соединения двухцепочных концов фрагментов ДНК с помощью ДНК-лигазы. Для повышения эффективности лигазы к концам сшиваемых фрагментов ДНК химически присоединяют комплиментарные однонитивые олигонуклеотиды, например поли-А и поли-Т, создавая тем самым искусственные «липкие» концы.

Методы введения рекомбинантных молекул в клетки зависят от особенностей самих клеток и используемых векторов. В тех  случаях, когда векторами служат плазмиды, рекомбинантные ДНК вводят в реципиентные бактерии путем трансформации. Разработаны и методы трансформации  клеток животных, а также протопластов растений. Для защиты экзогенного  клеточного материала, вводимого в  клетки млекопитающих или в протопласты  растений, используют липосомы — сферические  тельца, оболочка которых состоит  из фосфолипидов. В составе липосом  в клетки высших эукариот введены  крупные вирусные РНК. Во всех случаях  липосомы надежно защищали молекулы нуклеиновых кислот от разрушения нуклеазами.

Один из путей  передачи генетической информации в  культуре клеток человека, животных и  растений — гибридизация соматических клеток, разработанная Б. Эфрусси  и Г. Барски (1960). Эффективность этого  метода значительно повысилась после  того, как было обнаружено, что частицы  инактивированного вируса парагриппа типа Сендай увеличивают частоту  слияния клеток из самых разных источников. Показана возможность передачи генов  из изолированных хромосом китайского хомячка в клетки соединительной ткани мыши. Описаны гибриды клеток человека и мыши, из которых часть хромосом человека удаляется, а часть остается функционально активной.

Для введения ДНК  в различные культуры клеток млекопитающих  или развивающиеся эмбрионы используют метод микро инъекций ДНК в  ядро с помощью микро­манипулятора. Развитие методов микрохирургии  клеток позволило заменять ядра оплодотворенных  яйцеклеток на ядра из соматических клеток и в результате получать абсолютно  идентичные организмы. Создание гибридов высших растений в обход полового скрещивания возможно путем слияния  протопластов и соматической гибридизации растительных клеток, в результате чего в ряде случаев появляются целые  гибридные растения.

Все эти методы могут быть использованы для конструирования  новых форм микроорганизмов, животных и растений путем введения и стабильного  наследования в них рекомбинантных ДНК, несущих, гены,детерминирующие желаемые признаки.Следует, однако, отметить, что, несмотря на очевидные успехи подобных работ по созданию микроорганизмов, синтезирующих ряд важных продуктов эукариотического происхождения, проблема экспрессии чужеродных генов у прокариот имеет ряд ограничений.

 Некоторые  из них связаны с тем, что  при сверхпродукции полезных  для человека и не нужных  клетке соединений, кодируемых гибридной  плазмидой, усиливается неустойчивость  самих гибридов и вероятность  элиминации из них встроенных  генов. Стабильность гибридных  ДНК снижается и с увеличением  размеров вставки в вектор. Поэтому  разрабатываются методы, направленные  на сохранение целостности гибридной  структуры. Использование регулируемых  промоторов предохраняет клетку  от чрезмерной для нее метаболической  активности, связанной с избыточной  продукцией чужеродного белка.  Вместе с тем проблема стабильности  гибридных молекул окончательно  не решена. Ограничения возможностей  конструирования микроорганизмов  — гиперпродуцентов ценных препаратов  распространяются на случаи клонирования и экспрессии любых генов как про -, так и эукариотического происхождения.

Наряду с этим существуют и ограничения, специфически связанные с выражением эукариотических  генов в прокариотах.

Первое из них  определяется тем, что эукариотические  промоторы могут не распознаваться бактериальной РНК - полимеразой.

 Второе заключается  в том, что и РНК транскрибирующаяся  с эукариотических генов, не  содержит последовательности Шайн—Далгарно,  необходимой для ее связывания  с рибосомами.

В-третьих, такая  иРНК может содержать интроны, которые  следует вырезать.

Наконец, эукариотические  белки часто становятся субстратами  для бактериальных протеаз, опознающих такие белки как чужеродные.

Первые два  ограничения преодолеваются за счет создания векторов, несущих собственные  промоторы и последовательность Шайн—Далгарно, третье можно обойти путем использования кДНК либо химически  синтезированных генов. Протеазная активность реципиентных бактерий подавляется  мутациями.

Преодоление всех этих ограничений открывает дальнейшие перспективы использования методов  генной инженерии при создании микроорганизмов  — продуцентов гормонов, вакцин, антисывороток и ферментов, представляющих интерес для медицины, ветеринарии, сельского хозяйства и микробиологической промышленности. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

Методы введения ДНК в бактериальные клетки 

В начале 1950-х  гг., вскоре после открытия Ледербергом  процесса конъюгации Escherichia coli, было установлено, что типы «спаривания» клеток бактерий обусловлены генетически и что  генетическая информация переносится  из клеток мужского типа в клетки женского типа, или реципиентные клетки. Способность  служить донорными клетками (или  фактор плодовитости F) передавалась при  конъюгации значительно чаще, чем  любой другой генетический признак. F-фактор передавался также независимо от любого другого известного гена донорной клетки. Ледерберг подметил, что F-фактор напоминает внехромосомные генетические элементы, имеющиеся в  цитоплазме высших организмов. Это  наблюдение позволило ему в 1952 г. присвоить подобным внехромосомным генетическим системам общее название—плазмиды.

В 1953 г. Хэйс, который  в то время работал в больнице Хаммерсмита в Лондоне, установил, что в определенных условиях F-фактор может оказаться сцепленным с  генетическими маркерами и индуцировать последовательный их перенос в ходе конъюгации. F-фактор присоединяется к  бактериальной хромосоме в специфическом  участке (сайте); именно в этой точке  хромосома разрывается при конъюгации и начинается ее перенос в реципиентную клетку. F-фактор способен также отделяться от хромосомы, захватывая подчас небольшие  фрагменты хромосомы; поэтому его  можно рассматривать как виехромосомный элемент, который иногда интегрирует  в хромосому.

Жакоб и Вольман, сотрудники Института Пастера в  Париже, отметили сходство в поведении F-фактора, умеренного бактериофага X, и  другой плазмиды—Со1Е1 (которая кодирует колицин—белок, убивающий клетки Е. coli ). Для обозначения генетического  элемента, который может реплицироваться  либо в свободном состоянии, либо соединившись с бактериальной хромосомой, они предложили новый термин—«эписома».

В 1959 г. в Японии при исследовании больных бактериальной  дизентерией, которые не поддавались  лечению обычно эффективными антибиотиками, было сделано замечательное открытие. В клетках патогенных бактерий (Shigella dysenteriae)  были найдены гены, придававшие  им устойчивость одновременно к нескольким антибиотикам; такая устойчивость передавалась другим кишечным бактериям во многом подобно тому, как передается F-фактор. Эти факторы устойчивости (называемые R-факторами) обладали сходством с F-фактором; так, они были способны индуцировать передачу самих себя от клетки к клетке при конъюгации. Позже удалось показать, что некоторые из них содержат последовательности нуклеотидов, близкие к таковым F-фактора.

В начале 1960-х  гг. Новик обнаружил подобные факторы  устойчивости у стафилококков; они  содержали ген, кодирующий фермент  пенициллин-β-лактамазу, или пенициллиназу; последняя расщепляет пенициллин и  таким образом обеспечивает устойчивость к этому антибиотику. R-факторы  стафилококков, по-видимому, не способны обеспечивать передачу самих себя посредством  конъюгации и переносятся лишь пассивно в процессе трансдукции, т. е. при  их встраивании в ДНК бактериофага. Это открытие указывало на наличие  нескольких R-факторов в клетках  кишечных бактерий.

К середине 1960-х  гг. стало очевидным, что большинство R-факторов кишечных бактерий и стафилококков (как и плазмида Со1Е1) отличаются от F-фактора и фага λ [И.С.1]тем, что  остаются внехромосомными элементами; их обратимого встраивания в хромосому  клетки не происходит. В строгом  смысле они не соответствовали определению  эписомы. В 1963 г. Новик предложил  пользоваться предпочтительно термином «плазмида», как более общим, а  не «эписома». В настоящее время  термин «плазмида» является общепринятым.

Плазмиды найдены  почти у всех видов бактерий. Штамм, содержащий плазмиду, способен давать начало вариантам, у которых плазмида утрачена; в подобных случаях плазмида теряется окончательно, клетка не способна ее регенерировать и может только получить ее из другой бактериальной  клетки.

Плазмиды представляют собой кольцевые молекулы ДНК, по размеру соответствующие 1—3% генома бакте­риальной клетки, однако даже столь  малая часть наследственного  аппарата кодирует важные генетические признаки, которые обычно сама бактериальная  хромосома не кодирует. Например, они  содержат информацию, необходимую для  конъюгации бактериальных клеток, ими  обусловлен ряд заболеваний растений и животных. Они позволяют клеткам  использовать многие сложные соединения в качестве источников питания и  обеспечивают устойчивость к разнообразным  токсичным агентам, особенно к антибиотикам. Плазмиды стафилококков несут гены устойчивости к пенициллину, соединениям  ртути и ряду тяжелых металлов, вызывающих летальный эффект (солям сурьмы, висмута, кадмия и свинца, ионам арсената и арсенита). Гены устойчивости к тяжелым металлам обнаружены также в составе R-плазмид Е. соli. Наличием плазмид  обусловлены также некоторые заболевания с выраженной диарреей, стафилококковый импедиго, створаживание молока и превращение его в сыр молочнокислыми бактериями, а также разнообразные биохимические реакции, характерные для бактерий рода Pseudomonas..  Плазмиды могут управлять синтезом инсектицида в клетках Bacillus thuringiensis .Использование плазмид в качестве векторов для введения чужеродных генов в бактериальные клетки начиная с 1975 г. послужило толчком для интенсивных исследований их структуры и характера репликации.

Количество плазмид  в клетке может колебаться от одной  до более сотни; в целом чем  крупнее плазмида, тем меньше количество ее копий в клетке. Обычно репликация плазмиды регулируется независимо от репликации хромосомы. Поскольку плазмиды могут различаться по количеству копий водной и той же клетке, количество копий ; должно определяться регуляторной системой, присущей самой  плазмиде. Такая система была описана  в 1972 г. датчанином Нордстрёмом из Университета Оденсе для плазмиды R1 Е. со1i; сходные  регуляторные системы были найдены  у плазмид стафилококков. Количество копий плазмиды R1 зависит, по-видимому, от белка или белков, которые подавляют  ее репликацию. Сегмент ДНК длиной не более двух тысяч пар нуклеотидов  управляет репликацией плазмиды, которая более чем в 50 раз его  крупнее.

Долгое время  считалось, что генетическая конституция  всех клеток данного вида одинакова  и не изменяется в течение длительного  времени, однако, как оказалось, значительная часть генетических признаков, причем не только у бактерий, но и у высших организмов, нестабильна (эти признаки имеются в одних клетках или  штаммах и отсутствуют в других,, клетки могут терять их и приобретать  вновь) и мобильна (способна переноситься между клетками или перемещаться в одной и той же клетке из одного локуса в другой). Такая нестабильность объясняетcя тем, что эти признаки определяются плазмидами и тугими атипичными генетическими системами. 

При конъюгации бактериальных клеток может происходить  обмен плазмидами между бактериями, принадлежащими к разным видам и  даже родам, которые не способны обмениваться генами, находящимися в хромосомах. Наконец, такой обмен может приводить  к переносу генов, находящихся в  плазмиде, из одного вида в другой при  совместном росте и конкуренции, в результате чего реципиентные клетки приобретают способность выживать за счет донорных клеток. Эти свойства показывают, что плазмиды способны к выживанию независимо от судьбы содержащих их клеток, они не только не снижают общей приспособленности клетки, но, напротив, снабжают ее дополнительными адаптивными функциями. В самом деле, плазмиды обладают способностью включать в себя новые гены, а уже содержащиеся в них гены «перетасовывают» так, что это, с одной стороны, не влияет на эффективность репликации самих плазмид, а с другой—наделяет клетку резервуаром генетической информации, которую она использует по мере надобности. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

Генетическая рекомбинация in vitro

Генетическая  рекомбинация заключается в обмене генами между двумя хромосомами. По определению, данному Понтекорво в 1958 г., рекомбинация—это любой процесс, способный привести к возникновению  клеток или организмов с двумя  или более наследственными детерминантами, по которым их родители различались  между собой и которые соединены  новым способом. Такая рекомбинация обязательно происходит у млекопитающих  при образовании половых клеток.

 В ходе  мейоза гомологичные хромосомы  обмениваются генами; именно эти  обмены позволяют объяснить перетасовку  наследственных признаков в ряду  поколений. У вирусов и бактерий  генетическая рекомбинация происходит  реже, чем у животных. Обмен генетическим  материалом, за которым следует  рекомбинация, происходит между  организмами одного и того  же или близких видов. Все  живые организмы обладают рестрикционными  эндонуклеазами, которые узнают  чужеродную ДНК, проникшую в  организм, и расщепляют ее, таким  образом сводя на нет генетическую  рекомбинацию между эволюционно  удаленными геномами.

Обмен генами, равно  как и введение в клетку гена, принадлежащего другому виду, можно  осуществить посредством генетической рекомбинации in vitro. Этот подход был  разработан на бактериях, в частности  на кишечной палочке, в клетки которой  вводили гены животных и человека и добивались их репликации.

Метод рекомбинации in vitro заключается в выделении  ДНК из разных видов, получении гибридных  молекул ДНК и введении рекомбинантных молекул в живые клетки с тем, чтобы добиться проявления нового признака, например синтеза специфического белка.

Выделение генов, которые представляют собой сегменты ДНК, осуществляется на основе биохимических  методов; сложность выделения зависит  от величины генома. В то время как  определенный ген вируса выделить относительно просто, для гена человека это очень  сложная задача.

Поэтому исследователи  прибегают к косвенному методу, основанному  на выделении информационной РНК (мРНК). В клетках животных транскрипция мРНК на ДНК осуществляется в клеточном  ядре; молекулы мРНК переносят информацию из ядра в цитоплазму, где она используется при трансляции 

белков, аминокислотные последовательности которых закодированы в последовательностях нуклеотидов мРНК (т. е. в конечном счете в ДНК). В клетках бактерий (прокариот), которые не имеют ядра, транскрипция и трансляция происходят одновременно и сопряжены; мРНК связана с рибосомами, в которых осуществляется соединение аминокислот с образованием белков. Рибосомы играют ключевую роль в трансляции и в клетках животных.