Ферменты. 11

ВВЕДЕНИЕ.

«Ферменты ( от латинского слова fermentum – закваска) – белки, которые обладают каталитической активностью  и характеризуются очень высокой  специфичностью и эффективностью действия. Все процессы в живом организме- дыхание, пищеварение, мышечное сокращение, фотосинтез и другие – осуществляются с помощью ферментов. Ферменты находятся  во всех живых клетках и составляют большую часть всех их белков. Они  во много миллионов раз ускоряют самые разнообразные химические превращения, из которых складывается обмен веществ. Под действием  различных ферментов составные  компоненты пищи: белки, жиры и углеводы – расщепляются до более простых  соединений, из которых затем в  организме синтезируются новые  макромолекулы, свойственные данному  типу. » Вот, всё что я знал о  ферментах. Я решил пополнить  свои знания и поэтому взял реферат  по ферментам.

I. Общие свойства и номенклатура

1.1 Общие  Свойства ферментов 

Будучи белками, ферменты обладают всеми их свойствами. Вместе с тем  биокатализаторы характеризуются  рядом специфических качеств, тоже вытекающих из их белковой природы. Эти  качества отличают ферменты от катализаторов  обычного типа. Сюда относятся термолабильность ферментов, зависимость их действия от значения рН среды, специфичность  и, наконец, подверженность влиянию  активаторов и ингибиторов.

Термолабильность ферментов объясняется  тем, что температура, с одной  стороны, воздействует на белковую часть  фермента, приводя при слишком  высоких значениях к денатурации  белка и снижению каталитической функции, а с другой стороны, оказывает  влияние на скорость реакции образования  фермент-субстратного комплекса и  на все последующие этапы преобразования субстрата, что ведет к усилению катализа.

Зависимость каталитической активности фермента от температуры выражается типичной кривой. До некоторого значения температуры (в среднем до 5О°С) каталитическая активность растет, причем на каждые 10°С примерно в 2 раза повышается скорость преобразования субстрата. В то же время  постепенно возрастает количество инактивированного  фермента за счет денатурации его  белковой части. При температуре  выше 50°С денатурация ферментного  белка резко усиливается и, хотя скорость реакций преобразования субстрата  продолжает расти, активность фермента, выражающаяся количеством превращенного  субстрата, падает.

Детальные исследования роста активности ферментов с повышением температуры, проведенные в последнее время, показали более сложный характер этой зависимости, чем указано выше: во многих случаях она не отвечает правилу удвоения активности на каждые 10°С в основном из-за постепенно нарастающих  конформационных изменений в  молекуле фермента.

Температура, при которой каталитическая активность фермента максимальна, называется его температурным оптимумом.

Температурный оптимум для различных  ферментов неодинаков. В общем  для ферментов животного происхождения  он лежит между 40 и 50°С, а растительного - между 50 и 60°С. Однако есть ферменты с  более высоким температурным  оптимумом, например, у папаина (фермент  растительного происхождения, ускоряющий гидролиз белка) оптимум находится при 8О°С. В то же время у каталазы (фермент, ускоряющий распад Н₂О₂ до Н₂О и О₂) оптимальная температура действия находится между 0 и -10°С, а при более высоких температурах происходит энергичное окисление фермента и его инактивация.

Зависимость активности фермента от значения рН среды была установлена  свыше 50 лет назад. Для каждого  фермента существует оптимальное значение рН среды, при котором он проявляет  максимальную активность. Большинство  ферментов имеет максимальную активность в зоне рН поблизости от нейтральной  точки. В резко кислой или резко  щелочной среде хорошо работают лишь некоторые ферменты.

Переход к большей или меньшей (по сравнению с оптимальной) концентрации водородных ионов сопровождается более  или менее равномерным падением активности фермента.

Влияние концентрации водородных ионов  на каталитическую активность ферментов  состоит в воздействии ее на активный центр. При разных значениях рН в  реакционной среде активный центр  может быть слабее или сильнее  ионизирован, больше или меньше экранирован  соседними с ним фрагментами  полипептидной цепи белковой части  фермента и т.п. Кроме того, рН среды  влияет на степень ионизации субстрата, фермент-субстратного комплекса и  продуктов реакции, оказывает большое  влияние на состояние фермента, определяя  соотношение в нем катионных  и анионных центров, что сказывается  на третичной структуре белковой молекулы. Последнее обстоятельство заслуживает особого внимания, так  как определенная третичная структура  белка-фермента необходима для образования  фермент-субстратного комплекса.

Специфичность - одно из наиболее выдающихся качеств ферментов. Эго свойство их было открыто еще в прошлом  столетии, когда было сделано наблюдение, что очень близкие по структуре  вещества - пространственные изомеры (метилглюкозиды) расщепляются по эфирной связи двумя совершенно разными ферментами.

Таким образом, ферменты могут различать  химические соединения, отличающиеся друг от друга очень незначительными  деталями строения, такими, например, как  пространственное расположение метоксильного  радикала и атома водорода при 1-м  углеродном атоме молекулы метилглюкозида.

По образному выражению, нередко  употребляемому в биохимической  литературе, фермент подходит к субстрату, как ключ к замку. Это знаменитое правило было сформулировано Э. Фишером в 1894 г. исходя из того, что специфичность действия фермента предопределяется строгим соответствием геометрической структуры субстрата и активного центра фермента.

В 50-е годы нашего столетия это статическое  представление было заменено гипотезой  Д. Кошланда об индуцированном соответствии субстрата и фермента. Сущность ее сводится к тому, что пространственное соответствие структуры субстрата  и активного центра фермента создается  в момент их взаимодействия друг с  другом, что может быть выряжено формулой “перчатка - рука”. При этом в субстрате уже деформируются  некоторые валентные связи и  он, таким образом, подготавливается к дальнейшему каталитическому  видоизменению, а в молекуле фермента происходят конформационные перестройки. Гипотеза Кошланда, основанная на допущении  гибкости активного центра фермента, удовлетворительно объясняла активирование  и ингибирование действия ферментов  и регуляцию их активности при  воздействии различных факторов. В частности, конформационные перестройки  в ферменте в процессе изменения  его активности Кошланд сравнивал  с колебаниями паутины, когда  в нее попала добыча (субстрат), подчеркивая  этим крайнюю лабильность структуры  фермента в процессе каталитического  акта.

В настоящее время гипотеза Кошланда постепенно вытесняется гипотезой  топохимического соответствия. Сохраняя основные положения гипотезы взаимоиндуцированной настройки субстрата и фермента, она фиксирует внимание на том, что  специфичность действия ферментов  объясняется в первую очередь  узнаванием той части субстрата, которая не изменяется при катализе. Между этой частью субстрата и  субстратным центром фермента возникают  многочисленные точечные гидрофобные  взаимодействия и водородные связи.

1.2 Номенклатура

Ферментология очень долго не располагала  строго научной номенклатурой ферментов. Наименования ферментам давали по случайным  признакам (тривиальная номенклатура), по названию субстрата (рациональная), по химическому составу фермента, наконец, по типу катализируемой реакции  и характеру субстрата.

Примерами тривиальной номенклатуры могут служить названия таких  ферментов, как пепсин (от греч. пепсис - пищеварение), трипсин (от греч. трипсис - разжижаю) и папаин (от названия дынного дерева Carica papaja, из сока которого он выделен). По действию все эти ферменты являются протеолитическими, т. е. ускоряют гидролиз протеинов (белков). Характерное название была дано группе окрашенных внутриклеточных ферментов, ускоряющих окислительно-восстановительные реакции в клетке, - цитохромы (от лат. citos - клетка и chroma - цвет).

Наибольшее распространение получила рациональная номенклатура, согласно которой название фермента составляется из названия субстрата характерного окончания -аза. Она была предложена более столетия тому назад, в 1883 г. Э. Дюкло - учеником Л. Пастера. Так, фермент, ускоряющий реакцию гидролиза крахмала, получил название амилаза (от греч. амилон - крахмал), гидролиза жиров - липаза (от греч. липос - жир), белков (протеинов) - протеаза, мочевины - уреаза (от греч. уреа - мочевина) и т. п.

Когда методами аналитической химии  были достигнуты известные успехи в  расшифровке химической природы  простетических групп, возникла новая  номенклатура ферментов. Их стали именовать  по названию простетической группы, например, геминфермент (простетическая группа - гем), пиридоксаль-фермент (простетическая группа - пиридоксаль) и т.п.

Затем в названии фермента стали  указывать как на характер субстрата, так и на тип катализируемой реакции. К примеру, фермент, отнимающий водород  от молекулы янтарной кислоты, называют сукцинатдегидрогеназой, подчеркивая  этим одновременно и химическую природу  субстрата, и отнятие атомов водорода в процессе ферментативного действия.

В 1961 г. Международная комиссия по номенклатуре ферментов представила V Международному биологическому конгрессу  проект номенклатуры, построенный на строго научных принципах. Проект был  утвержден конгрессом, и новая  номенклатура прочно вошла в ферментологию. Согласно этой (Московской) номенклатуре название ферментов составляют из химического  названия субстрата и названия той  реакции, которая осуществляется ферментом. Если химическая реакция, ускоряемая ферментом, сопровождается переносом группировки  атомов от субстрата к акцептору, название фермента включает также химическое наименование акцептора.

Например, пиридоксальфермент, катализируюший реакцию переаминирования между L-аланином и L-кетоглутаровой кислотой, называется L-аланин: 2-оксоглутарат аминотрансфераза. В этом названии отмечены сразу три особенности: 1) субстратом является L-аланин; 2) акцептором служит 2-окcоглутаровая кислота; З) от субстрата к акцептору передается аминогруппа.

Названия ферментов по научной  номенклатуре неизмеримо выигрывают в  точности, но становятся в ряде случаев  гораздо сложнее старых, тривиальных. Так, уреаза (тривиальное название), ускоряющая реакцию гидролиза - мочевины на оксид углерода (IV) и аммиак, по научной номенклатуре именуется  карбамид - амидогидролазой:

Н₂N + СО +NН₂ + Н₂О =2NН₃ + СО₂

В этом названии дано точное химическое наименование субстрата и указано, что фермент катализирует реакцию  гидролиза амидогруппы. Трегалаза, ускоряющая реакцию гидролиза трегалозы, называется трегалоза-1-глюко-гидролазой.

В связи со значительным усложнением  научных названий в новой номенклатуре допускается сохранение наряду с  новыми старых тривиальных, рабочих  названий ферментов. Международной  комиссией был составлен детальный  список всех известных в то время  ферментов, существенно дополненный  в 1972 г. при пересмотре как классификации, так и номенклатуры некоторых  ферментов, где рядом с новым  научным названием каждого фермента приведено старое, а также указан химизм катализируемой ферментом реакции  и в некоторых случаях природа  фермента. Таким образом, исключается  возможность путаницы в наименовании ферментов. В 1964 г. список включал 874 фермента; в последующее время он был  существенно дополнен и возрос до 1770 ферментов в 1972 г. и до 3500 ферментов в 2012 г.

Каждому ферменту в указанном списке присвоен индивидуальный номер (шифр). Например, шифр уреазы выражается цифрами 3.5.1.5. Это означает, что уреаза относится к 3-му классу (первая цифра) ферментов, все представители которого катализируют реакции гидролиза. Вторая цифра (5) говорит о том, что уреаза принадлежит к 5-му подклассу этого класса, куда зачислены все ферменты, ускоряющие гидролиз С - N-связей, не являющихся пептидными. Третья цифра шифра (1) указывает на принадлежность уреазы к подподклассу 5-го подкласса, члены которого ускоряют гидролиз линейных амидов, а последняя цифра (5) - порядковый номер уреазы в этом подподклассе.

Упоминавшаяся ранее лактатдегидрогенеза  имеет шифр 1.1.1.27, т. е. относится к 1-му классу ферментов (оксидоредуктазы), к 1-му подклассу (оксидоредуктазы, действующие  на СН - ОН-группировки в качестве доноров атомов водорода), к 1-му подподклассу (акцептором атомов водорода служит никотинамидадениндинуклеотид) и занимает 27-е место в перечне ферментов упомянутого подподкласса. Таким образом, шифр абсолютно точно указывает место фермента в общем списке. В настоящее время принято в научных публикациях при первом упоминании фермента указывать в скобках его шифр.

1.3 Классификация ферментов и характеристика некоторых групп

По первой в истории изучения ферментов классификации их делили на две группы: гидролазы, ускоряющие гидролитические реакции, и десмолазы, ускоряющие реакции негидролитического распада. Затем была сделана попытка разбить ферменты на классы по числу субстратов, участвующих в реакции. В соответствии с этим ферменты классифицировали на три группы.

1. Катализирующие превращения двух субстратов одновременно в обоих направлениях: А+В)С+D.

 2. Ускоряющие превращения двух субстратов в прямой реакции и одного в обратной: А+В)С.

3. Обеспечивающие каталитическое видоизменение одного субстрата как в прямой, так и в обратной реакции: А)В.

Одновременно развивалось направление, где в основу классификации ферментов  был положен тип реакции, подвергающейся каталитическому воздействию. Наряду с ферментами, ускоряющими реакции  гидролиза (гидролазы), были изучены  ферменты, участвующие в реакциях переноса атомов и атомных групп (феразы), в изомеризации (изомеразы), расщеплении (лиазы), различных синтезах (синтетазы) и т. д. Это направление  в классификации ферментов оказалось  наиболее плодотворным, так как объединяло ферменты в группы не по надуманным, формальным признакам, а по типу важнейших  биохимических процессов, лежащих  в основе жизнедеятельности любого организма. По этому принципу все  ферменты делят на 6 классов.

1. Оксидоредуктазы - ускоряют реакции окисления - восстановления. 2. Трансферазы - ускоряют реакции переноса функциональных групп и молекулярных остатков. 3. Гидролазы - ускоряют реакции гидролитического распада. 4. Лиазы - ускоряют негидролитическое отщепление от субстратов определенных групп атомов с образованием двойной связи (или присоединяют группы атомов по двойной связи). 5. Изомеразы - ускоряют пространственные или структурные перестройки в пределах одной молекулы. 6. Лигазы - ускоряют реакции синтеза, сопряженные с распадом богатых энергией связей. Эти классы и положены в основу новой научной классификации ферментов.

К классу оксидоредуктаз относят ферменты, катализирующие реакции окисления - восстановления. Окисление протекает  как процесс отнятия атомов Н (электронов) от субстрата, а восстановление - как присоединение атомов Н (электронов) к акцептору.

В класс трансфераз входят ферменты, ускоряющие реакции переноса функциональных групп и молекулярных остатков от одного соединения к другому. Это  один из наиболее обширных классов: он насчитывает около 500 индивидуальных ферментов. В зависимости от характера  переносимых группировок различают  фосфотрансферазы, аминотрансферазы, гликозилтрансферазы, ацилтрансферазы, трансферазы, переносящие одноуглеродные остатки (метилтрансферазы, формилтрансферазы), и др. Например, амидазы ускоряют гидролиз амидов кислот. Из них важную роль в биохимических процессах  в организме играют уреаза, аспарагиназа и глутаминаза.

Уреаза была одним из первых белков-ферментов, полученным в кристаллическом состоянии. Это однокомпонентный фермент (М=480000), молекула его глобулярна и состоит  из 8 равных субъединиц. Уреаза ускоряет гидролиз мочевины до NН₃ и СО₂.

Характерные черты действия ферментов  класса лигаз (синтетаз) выявлены совсем недавно в связи со значительными  успехами в изучении механизма синтеза  жиров, белков и углеводов: Оказалось, что старые представления об образовании  этих соединений, согласно которым  они возникают при обращении  реакций гидролиза, не соответствуют  действительности. Пути их синтеза  принципиально иные.

Главная их особенность - сопряженность  синтеза с распадом веществ, способных  поставлять энергию для осуществления  биосинтетического процесса. Одним  из таких природных соединений является АТФ. При отрыве от ее молекулы в  присутствии лигаз одного или  двух концевых остатков фосфорной кислоты  выделяется большое количество энергии, используемой для активирования  реагирующих веществ. Лигазы же каталитически  ускоряют синтез органических соединений из  активированных за счет распада  АТФ  исходных продуктов. Таким образом, к лигазам относятся ферменты, катализирующие соединение друг с другом двух молекул, сопряженное с гидролизом пирофосфатной связи в молекуле АТФ или иного нуклеозидтрифосфата.

Механизм действия лигаз изучен еще недостаточно, но, несомненно, он весьма сложен. В ряде случаев доказано, что одно из участвующих в основной реакции веществ сначала дает промежуточное соединение с фрагментом распадающейся молекулы АТФ, а вслед  за этим указанный промежуточный  продукт взаимодействует со вторым партнером основной химической реакции  с образованием конечного продукта.

ii. Применение  ферментов в пищевых технологиях

2.1 Применение в пищевых технологиях

Человечество  использует ферменты для приготовления  продуктов питания с незапамятных времен. Эмпирическим путем люди выяснили, что существуют природные субстраты, которые при внесении их в тот  или иной вид сырья вызывают в  нем желательные изменения.

Такими субстратами были соки растений и ткани животных, содержащие ферменты, а также виноградный сок, молоко, тесто, самопроизвольно сбродившие в результате попадания в них  микроорганизмов. Например, для получения  сыра использовали соки растений, содержащие фермент фицин, или ткани желудка  птиц и животных, содержащие фермент  ренин. Для тендеризации мяса (размягчения  мышечной ткани) использовали сок папайи, содержащий фермент папайи.

Изучать ферменты начали в XVIII в.. когда  были открыты пищеварительные ферменты, выделены ферменты из биологических  объектов: пероксидаза из хрена, и  α-амилаза из зерна и др. В ХIX в. получены первые чистые формы ферментов  и предложен термин «энзим» (от греч, enzymos - связанный с брожением теста).     

Возникновение энзимологии как  самостоятельной научной дисциплины стало возможным с развитием химии, биологии и медицины.При изучении механизма действия ферментов было высказано предположение, что ферменты образуют комплексы с субстратами. Для объяснения пространственного взаимодействия между ферментом и субстратом Э. Фишер предложил модель «ключ к замку».  
Наибольший вклад в развитие энзимологии был сделан в XX в. Были разработаны теория фермент-субстратного комплекса и первая математическая модель для описания ферментативной кинетики. Однако вопрос о том. как ферменты ускоряют химические реакции, оставался не выясненным до возникновения теории переходного состояния. В 1948 г. Л. Полинг предположил, что каталитическое действие ферментов достигается стабилизацией переходного состояния химических реакций путем взаимодействия с активным центром фермента, что было в дальнейшем подтверждено экспериментально. В 50-60 гг. XX в. был пересмотрен вопрос субстратной специфичности ферментов. Согласно гипотезе «индуцированного соответствия» (модель Кошланда) ферментная активность может регулироваться небольшими молекулами, отличными от молекул субстрата или продуктов реакции. Было показано существование аллостеричных ферментов, разработаны методы регуляции активности ферментов. Было установлено, что катализ тесно связан с молекулярными взаимодействием между молекулами субстрата и компонентами молекул фермента, а природа и последовательность этих взаимодействий определяются механизмом реакции.  
        Начало изучения структуры ферментов было положено работой Д. Самнера, который впервые установил белковую природу ферментов. За 20 лет, прошедших после его открытии, было описано более 130 кристаллических ферментов.

В середине XX в. методы рентгеновской  кристаллографии и ядерно-магнитного резонанса стали использовать для  изучения каталитических свойств ферментов  и особенностей фермент-субстратных  взаимодействий.  
          В конце столетия появилась возможность открывать и создавать новые ферменты, ранее не существовавшие в природе, получать микроорганизмы-продуценты ферментов с необходимыми для человека свойствами, идентифицировать ранее неизвестные ферменты, изучить их и модифицировать: изменять аминокислотную последовательность первичной структуры ферментов, а также модифицировать химические группы ферментов, участвующие в образовании фермент-субстратного комплекса.  
         Достижения современной энзимологии значительно расширили возможности применения ферментов в первую очередь в медицине и пищевой промышленности, где их используют практически во всех отраслях(табл.1).  
          Это обусловлено их преимуществами по сравнению с химическими катализаторами: избирательностью и стерео-специфичностью действия, возможностью достижения высоких скоростей превращения субстратов при относительно мягких условиях технологии, безвредностью для окружающей среды и человека.

Ферменты не являются чужеродными  для организма человека веществами. В пищевых технологиях используют в основном ферменты, присутствующие в пищевом сырье, которые поступают  в организм человека при потреблении  свежих фруктов и овощей, орехов, молока, сброженных и консервированных продуктов. В пищевых продуктах  ферментов содержится мало - миллиграммы  на килограмм продукта. При кулинарной и технологической обработке  пищевых продуктов ферменты, как  правило, инактивируются. Продолжается поиск новых возможностей использования  ферментов в пищевой промышленности.     Основными направлениями исследования являются:  
• модификация свойств индивидуальных ферментов с целью повышения их активности и удешевления целевых продуктов;  
• скрининг новых микроорганизмов-продуцентов ферментов;  
• получение новых рекомбинантных ферментов с заданными свойствами;  
• применение ферментативных реакций для получения ценных пищевых ингредиентов и биологически активных веществ;  
• разработка пищевых нанотехнологий с использованием ферментов.  
Современные методы модификации ферментов позволяют увеличивать стойкость ферментов к действию различных химических реагентов и ингибиторов, рН, температурному воздействию; изменять рН оптимума ферментов, их субстратную специфичность и связывающие свойства; регулировать предпочтения определенных металлов-кофакторов и каталитические свойства ферментов.  
Химическая модификация - наиболее известный вид модификации ферментов . Ее методы должны отвечать следующим требованиям:  
• используемые химические реагенты должны быть безвредными (особенно в случаях дальнейшего использования ферментов в пищевых технологиях);  
• условия модификации не должны быть жесткими, приводящими к ухудшению свойств ферментов; модифицированные ферменты должны отделяться от реакционной среды относительно простыми и недорогими способами;  
• применение модифицированных ферментов должно быть экономически выгодным.

Примером химической модификации  служит модификация ферментов в  условиях неполярной (не водной) среды. Происходящее при этом снижение активности воды в реакционной системе существенно  изменяет свойства ферментов: реакция  сдвигается в сторону синтеза; образуются оптически активные продукты; повышается термостабильность фермента и стабильность при хранении; фермент приобретает  способность катализировать новые  реакции, не протекающие в водной среде (синтез пептидов, алифатических  амидов и др.); ферменты проявляют  активность в органических растворителях  при температуре выше 100 °С. Данный способ химической модификации использован  при модификации таких ферментов, как липазы, химотрипсин , трипсин, субтилизин , термолизин , полифенолоксидазы , глюкоамилазы , папаин , химозин . С помощью физико-химических методов модификации изменяют силы электростатического взаимодействия, водородные связи и гидрофобные взаимодействия в молекулах белков.

Например, широко используемый для  изомеризации глюкозы в фруктозу фермент ксилозоизомераза модифицируется в направлении увеличения его  термостабильности, снижения значения рН оптимума, изменения предпочтения активирующего катиона металла, изменения субстратной специфичности  от ксилозы к глюкозе. К активно  развивающимся областям энзимологии  относится разработка биологических  методов модификации ферментов. Особенно многообещающим является направление, получившее название «белковая инженерия». Методы белковой инженерии, основанные на знании зависимости между аминокислотной последовательностью, трехмерной структурой и каталитической активностью ферментов, позволяют успешно модифицировать ферменты для улучшения их технологических  свойств. Широко используется способ замены определенных аминокислот в структурах .молекул ферментов.

Показано, что замена в молекуле фосфолипазы А2 Asn89 на Asp и Glu92 на Lys вблизи N-терминального конца спирали 5 увеличивает  ккал/моль , а замена Asp56 на Ser, Ser60 на Gly и Asn67 на Туr значительно увеличивает  активность и средство фосфолипазы  А2 к фосфолипидным мицеллам . Путем  замены аминокислот в структурах молекул ферментов изменяют также  их субстратную специфичность . Изменение  соотношения активности к растворимому и нерастворимому субстратам у целлобиогидролаз достигается путем замены внешних  остатков ароматических аминокислот, которые захватывают конец молекулы полисахарида и направляют ее внутрь активного центра. Увеличение стабильности ферментов к температуре и  экстремальным значениям рН достигается  путем таких замен среди сближенных в его третичной структуре  аминокислотных остатков, которые приводят к образованию дополнительных нековалентных  гидрофобных связей, солевых мостиков или ковалентных S-S-связей, повышающих общую стабильность глобулы молекулы фермента. Во многих случаях замены осуществляются на основе сопоставления  совершенствуемых структyp с соответствующими структурами аналогов из экстремофильных  родственных организмов (термо-, ацидо- и алкалофильных).