Физико-химические методы исследования флавоноидов

1.3 Физико-химические методы исследования флавоноидов

1.3.1 Оптические методы определения  флавоноидов

Спектрофотометрический  и фотоколориметрический анализы  являются разновидностями молекулярно-абсорбционного спектрального анализа. Сущность молекулярно-абсорбционного спектрального анализа заключается  в качественном и количественном определении веществ по их спектрам поглощения.

Количественное определение  исследуемых флавоноидных соединений в УФ- и видимой области спектров основано на измерении оптической плотности при длине волны в максимумах поглощения как растворов анализируемых веществ, так и растворов их окрашенных комплексов.

Спектрофотометрическое  определение по максимумам собственного поглощения в разновидности прямой спектрофотомерии или дифференциальной спектрофотомерии является одним из наиболее распространенных методов  анализа флавоноидов. При этом рабочими диапазонами длин волн служат как длинноволновые максимумы для флавоноидов – 330-370 нм, так и коротковолновые. Коротковолновые максимумы, хотя и более интенсивны, но в ряде случаев менее пригодны для аналитических целей из-за малой площади вершины пика, что приводит к большим ошибкам определения. Относительная ошибка прямого спектрофотометрического определения составляет ± 2-5 % и может быть снижена при дифференциальной методике анализа до 0.5-1.0 %.

Рабочий интервал концентраций спиртовых, спиртоводных растворов  составляет от 5 до 20 мкг вещества в 1 мл раствора. Обладая высокой чувствительностью, метод не селективен, так как не контролирует содержание каждого из веществ одного класса соединений и не позволяет судить о качественном составе материала.

Большой специфичностью обладают методики определения флавонолов по цветным комплексным соединениям с хлоридом алюминия, хлорокисью циркония (хлористым цирконилом), нитратом галлия. Окрашенные растворы имеют максимумы в интервалах: 385-460 нм с хлористым алюминием, 385-500 нм с хлористым цирконилом, 400-455 нм с азотнокислым галлием. Наибольшей чувствительностью обладает методика с применением нитрата галлия, позволяющая количественно определять 0.5 мкг в 1 мл раствора, затем с хлорокисью циркония – 0.9-1.0 мкг и с хлористым алюминием – 1-2 мкг.

Описаны методики анализа  флавоноидов с нитритом кобальта в среде уксусной кислоты при длине волны 575 нм, а также с цинком и мышьяком. Получить истинное суммарное содержание флавоноидов по образованию цветных комплексов с металлами возможно лишь при наличии у соединений одинакового количества комплексообразующих центров. Отсутствие таковых у целого ряда соединений приводит к отрицательной реакции с данными реактивами.

Несмотря на указанные  недостатки, метод нашел широкое  применение при установлении суммарного содержания флавоноидов в сырье и суммарных фитохимических препаратах. В качестве стандарта используют кверцетин, кемпферол или их гликозиды.

Широко распространена при  определении общего количества флавоноидных соединений в растениях методика фотометрического определения по реакции комплексобразования с борной кислотой при длине волны 470 нм (т.н. борно-лимонная реакция).

Методика обладает теми же недостатками, что и методика комплексобразования с солями металлов, и дает завышенные результаты, но простота проведения и доступность реактива дают возможность использовать их для ориентировочных определений. В качестве образцов используют как агликоны, так и гликозиды флавонов, флавонолов, халконов. Рабочая концентрация растворов 1-10 мкг/мл. Относительная ошибка определения ± 3.35 %.

В ряду спектрофотометрических методов анализа флаванонов наиболее чувствителен боргидридный метод (до 0.5-1 мкг/мл при длинах воли 535-560 нм). Несмотря на значительную селективность, он не имеет широкого применения из-за малого времени устойчивости окрашенного комплекса и плохой воспроизводимости результатов.

Комплексонообразующие свойства флавоноидов положены в основу флуорометрического метода, являющегося на порядок более чувствительным, чем спектрофотометрический. Количественно оценить флавоноиды этим методом возможно при наличии 0.05-1 мкг вещества в 1 мл раствора. Высокая чувствительность флуорометрического метода раскрывает широкие возможности его применения для предварительной идентификации биологически активных веществ в тканях растений. Однако получить объективные результаты при анализе сырья и фитохимических препаратов можно только после разделения веществ с помощью различных видов хроматографии [19].

В целом для флавоноидов характерно поглощение в УФ-видимой области спектра (210-600 нм). Спектр поглощения флавоноидного соединения содержит, как правило, две полосы: одна из них в низковолновой (210-290 нм) части – полоса II, другая – в более длинноволновой (320-380 или 490-540 нм для антоцианидинов) части – полоса I.

Положение полос поглощения служит в некоторой степени характеристическим признаком отдельных групп флавоноидов. Так, флаваноны и флаванонолы отличаются от других групп флавоноидов положением полосы II в области 270-290 нм и наличием полосы I в виде плеча при 310-330 нм (рисунок 1.12). В то время как для флавонов и флавонолов специфическим признаком служит положение полосы I в области 320-355 и 340-385 нм соответственно (рисунок 10). Для халконов характерно положение полосы II в несколько более длинноволновой области (рисунок 1.13).

Рисунок 1.12 – Положение  полос поглощения в УФ-видимой области спектра для изофлавона (1) и флавонона и флавононола (2)

Рисунок 1.13 – Положение  полос поглощения в УФ-видимой области спектра для флавона (1), флавонола (2) и халкона (3)

Внутри каждой группы флавоноидов выявлена более «тонкая» картина зависимости положения максимумов полос поглощения от структуры соединения. Например, у ряда флавонов с одинаковым 5,7-дигидроксизамещением кольца А полоса I перемещается в более длинноволновую область по мере возрастания числа гидроксильных групп в кольце В (таблица 1.4).

Таблица 1.4 – Зависимость  положения максимумов полос поглощения ОН-группы в кольце В у ряда флавонов

Абсорбционная спектроскопия  флавоноидов хорошо изучена, и выявленные закономерности широко используются в целях идентификации и установления строения новых соединений. Особенно информативной является процедура добавления шифт-реагентов, каждый из которых предназначен для выявления определенных «диагностических» признаков в структуре исследуемого соединения [ссылка].

Шифт-реагенты принято добавлять к раствору исследуемого флавоноидного соединения в метаноле (в случае антоцианов и/или антоцианидинов – в метаноле с 0.01% хлороводородной кислоты). После добавления шифт-реагента в исходном спектре происходит сдвиг полос поглощения и по характеру этих изменений делается вывод о наличии (или отсутствии) в соединении определенных структурных фрагментов.

Часто шифт-реагенты используются для обнаружения в структуре соединений:

1. гидроксильных групп с наиболее выраженными кислотными свойствами (7-ОН, 4'-ОН);
2. хелатообразующего фрагмента, т. е. сочетания 4-оксогруппы с 3-ОН- и/или 5-ОН-группами.

Гидроксильные группы различаются  по кислотности и располагаются  в следующий ряд: 7-ОН > 4'-ОН > 3'-ОН > 5-ОН. Для доказательства наличия  в структуре свободной наиболее кислой 7-ОН-группы служит слабощелочной  шифт-реагент – ацетат натрия (таблица 1.5). Несколько миллиграммов плавленого ацетата натрия добавляют к аликвоте исходного метанольного раствора исследуемого вещества, снимают спектр и сравнивают со спектром исходного раствора.

Таблица 1.5 – Шифт-проба с ацетатом натрия

Для доказательства свободной 4'-ОН-группы (одновременно с 7-ОН-группой) используется более сильный щелочной реагент — метоксид натрия (таблица 1.6). При этом к аликвоте метанольного раствора исследуемого соединения добавляют 2-3 капли шифт-реагента; снимают спектр сразу и еще после 3-5 минут стояния.

Для дигидрокемпферола (рисунок 1.14) на рисунке 1.15 приведен УФ-спектр, полученный с использованием шифт-агентов.

Таблица 1.6 – Шифт-проба с метоксидом натрия

Рисунок 1.14 – Химическая структура дигидрокемпферола

Рисунок 1.15 – УФ-спектр дигидрокемферола с использованием шифт-агентов

Шифт-проба с ацетатом натрия для дигидрокемпферола (рисунок 1.14) приводит к батохромному сдвигу полосы II на 36 нм, что соответствует наличию 7-ОН-группы во флаванонолах (табл. 6). В то же время артеметин, в структуре которого присутствуют замещенные (метилированные) гидроксильные группы в положениях 7 и 4', не дает положительной шифт-пробы с ацетатом натрия (отсутствует батохромный сдвиг полосы 1).

Широко используемой является реакция взаимодействия флавоноидов с хлоридом алюминия. Флавоноиды способны образовывать комплексные соединения с включением ионов А1³⁺. Считается, что в образовании комплекса с ионами металлов могут участвовать три центра в структуре молекулы флавоноида (рисунок 1.23).

Рисунок 1.23 – Возможные  центры хелатирования флавоноидами ионов металлов

В результате комплексообразования в УФ-спектрах поглощения наблюдается сильный батохромный сдвиг полос поглощения I или II в зависимости от типа флавоноидного соединения (таблица 1.7). Для определения центров комплексообразования – снимают спектр (1) метанольного раствора исследуемого раствора исследуемого вещества. К аликвоте метанольного раствора исследуемого вещества добавляют 2-3 капли 5%-го метанольного раствора А1С1₃ и снимают спектр (2). Спектры (1) и (2) сравнивают между собой [ссылка].

Например, в УФ-спектре кверцетина максимум полосы I сдвигается с 375 до 435 нм (батохромный сдвиг) и соответственно раствор приобретает яркое желтое окрашивание. На этом основано использование спиртового раствора AlCl₃ в качестве проявляющего реагента в ТСХ флавоноидов.

Для рамнетина, в молекуле которого в комплексообразовании могут участвовать три центра, шифт-проба с AlCl₃ приводит к батохромному сдвигу полосы I на 80 нм (рисунок 1.17), а в артеметине, где возможность комплексообразования ограничена одним центром, поскольку имеется только одна свободная ОН-группа в положении 5, батохромный сдвиг в результате шифт-пробы с А1С1₃ составляет 32 нм (рисунок 1.15). Отсутствие в молекуле 5-ОН-группы и возможность участия в комплексообразовании только двух других центров, как это показано на рисунке 1.22 на примере физетина, приводит тем не менее к довольно большому батохромному сдвигу – на 96 нм.

Таблица 1.7 – Шифт-проба с хлоридом алюминия

Для дигидрофлавонолов в целом шифт-пробы с А1С1₃ характеризуются меньшими бахромными сдвигами. Например, в случае дигидрокемферола бахромный сдвиг равен 25 нм (рисунок 1.15), а дигидрофизетина – 31 нм (рисунок 1.22).

Наибольший батохромный  сдвиг соответствует комплексообразованию с одновременным участием всех трех потенциальных центров молекулы (рисунок 23). При этом более прочными считаются комплексы, образованные с участием карбонильной группы и 5-ОН- и/или 3-ОН-группами. Комплекс с 3',4'-дигидроксигруппировкой в кольце В нестабилен, легко разрушается в слабокислой среде и соответственно при этом уменьшается батохромный сдвиг, что, в свою очередь, служит тестом для обнаружения этой дигидроксигруппировки в молекуле. Так, для рамнетина шифт-проба с А1С1₃ + НС1 приводит к уменьшению батохромного сдвига на 28 нм по сравнению с шифт-пробой с А1С1₃ (рисунок 1.17).

Проблема состава комплексов флавоноидов с ионами металлов является предметом многочисленных научных исследований и нельзя сказать, что она решена и в настоящее время. Доказано, что хелатирование кверцетина с А1³⁺ происходит только по двум центрам: во-первых, с участием 4-оксогруппы и 3-ОН-группы и, во-вторых, с участием 3',4'-дигидрокси - группировки (рисунок 1.24 и 1.25) [ссылка].

Рисунок 1.24 – Центры хелатирования комплексов кверцетина с хлоридом алюминия

1 – кверцетин; 2 – кверцетин-А1С1₃ (2:1, моль); 3 – кверцетин-А1С1₃ (0,1:1, моль)

Рисунок 1.25 – УФ-спектр комплексов кверцетина с хлоридом алюминия:

Гидроксильная группа в положении 5 не участвует в хелатировании в силу своей низкой кислотности. Образование хелата с участием 5-ОН- и 4-оксогруппы стерически затруднено из-за возникновения в молекуле соседнего хелата.

В настоящее время происходит смена «приоритетов» и зачастую сложные структурные вопросы  решаются уже более «коротким», но более технически оснащенным путем за счет высокоразрешающих современных физико-химических методов [ссылка].

Спектрофотометрический метод позволяет оценить только суммарное содержание флавоноидов в экстрактах, так как максимумы поглощения родственных соединений располагаются в одной области (например, 408-420 нм для рутина, морин, кемпферол, гиперазид и др.). Поэтому данные спектрофотометрического анализа всегда пересчитывается на тот или иной флавоноид (чаще всего рутин).

Таким образом, спектрофотометрия не дает возможности проводить, наряду с количественным, качественный анализ биофлавоноидов и оценить реальное содержание исследуемого флавоноида в лекарственном растительном сырье.

Корулькин, Д.Ю. Природные флаваноиды /Д.Ю. Корулькин, Ж.А. Абилов, Г.А. Толстиков. – Новосибирск: Наука, 2007. – 296с.

Органическая  химия: учебник для вузов: В 2 кн. Кн.2: Специальный курс/ Н.А. Тюкавкина, С.Э. Зурабян, В.Л. Белобородов и др.; под ред. Н.А. Тюкавкиной. – М.: Дрофа, 2008. – 592с.

Основы  аналитической химии. В 2 кн. Кн. 2. Методы химического анализа/ Ю.А. Золотов, Е.Н. Дорохова, В.И. Фадеева и др. Под  ред. Ю.А. Золотова. – М.: Высшая школа, 2002. – 494 с.

Лобанова, А.А. Исследование биологически активных флавоноидов в экстрактах из растительного сырья / А.А. Лобанова, В.В. Будаева, Г.В. Сакович // Химия растительного сырья. – 2004. -№1. – С. 47-52.

Государственная фармакопея СССР./ М-во здравоохранения СССР. – 11 изд. – М.: Медицина, 1987. – 334с.

ГОСТ 24027.0-80. Правила приемки и методы отбора проб. – Введ. 1981 – 01 – 01. - М.: Изд-во стандартов. – 5с.

ГОСТ 24027.2-80. Сырье лекарственное растительное. Методы определения влажности, содержания золы, экстрактивных веществ, эфирного масла. – Введ. 1981 – 01 – 01. –М.: Изд-во стандартов. – 10с.

Костин, Н.В. Техника безопасности работы в  химических лабораториях [Текст]: учеб. пособие/ Н.В. Костин. – Изд.: Мос. Университет, 1966. – 270с.