Газовая хроматография. 2

     Хроматография представляет собой один из видов современных физико-химических методов разделения и анализа сложных смесей различных веществ.

Создание хроматографии  как нового научного метода анализа  принадлежит русскому ученому М.С. Цвету, который в 1903 г. На основании своих работ по разделению растительных пигментов с использованием явления избирательной адсорбции веществ на различных адсорбентах в присутствии различных жидких сред изложил основные принципы и технику метода ,назвав его хроматографическим, а столб сорбента с разделившимся компонентами смеси – хроматограммой.

     В настоящее  время хроматография самостоятельно  или в сочетании с другими  методами находит все более  широкое применение. Основное назначение  хроматографических методов – количественное разделение сложных смесей веществ неизвестного состава, выделение ценных компонентов, установление индивидуальности веществ, весьма близких по своим свойствам, строению и составу. Помимо аналитических целей, хроматографию применяют в промышленности для умягчения и очистки води, для очистки лекарственных препаратов, минеральных масел и других продуктов.

Газо-жидкосная хроматография

    Метод газо-жидкосной хромотографии, предложенный в 1952г., получил в настоящее время широкое распространение при исследовании липидов. Быстрому распространению этого метода способствует высокая разрешающая способность его при разделении на компоненты сложных смесей близких по свойствам соединений, возможность более точного количественного определения их, простота препаративного выделения индивидуальных веществ и т. п.

     Газо-жидкостная  хроматография отличается от  других видов распределительной  хроматографии в основном тем,  что в качестве подвижной фазы  используется инертный газ (газ-носитель), а неподвижной фазой является  жидкость, нанесенная на твердый  носитель. Разделение смеси на  индивидуальные вещества производят  в специальных аппаратах-газовых храмотографах. Основными узлами газового хроматографа являются: хроматографическая колонка, детектор и самописец. Необходимым для работы является также источник газа – подвижной фазы.

     В настоящее  время и зарубежем изготавливаются удобные в работе газовые хроматографы различных конструкций. На рис.1 изображена принципиальная схема устройства газо-жидкостного хроматографа.

     Сущность метода  газо-жидкостной хроматографии состоит  в следующем. Хроматографическую колонку заполняют твердым порошкообразным носителем, пропитанным нелетучей жидкостью – неподвижной фазой. Колонку помещенную в термостат, нагревают, одновременно пропуская через нее инертный газ с постоянной скоростью. При достижении определенной температуры в колонку вводят с помощью микрошприца раствор анализируемой смеси веществ, которые под влиянием высокой температуры быстро превращаются в пар. Часть парообразных компонентов смеси, перемещаясь с непрерывно пропускаемым инертным газом вдоль колонки, растворяется в неподвижной фазе, другие увлекаются газом дальше вдоль колонки. Чем ниже растворимость парообразного компонента в жидкой фазе, тем быстрее он проходит через колонку.

     Скорость продвижения  отдельных компонентов смеси  определяется их коэффициентами  распределения между газообразной  и жидкой фазами.

К=С_ж/С_г=const

где  К- коэффициент распределения компонента

        С_ж- концентрация компонента в жидкой фазе

        С_г- концентрация компонента в газовой фазе

     Поток выходящего  из колонки газа-носителя последовательно  выносит отдельные компоненты  смеси, разделенные объемами чистого  газа-носителя. Изменение физических  или химических свойств выходящего  газа фиксируется детектором, сигнал  которого усиливается и записывается  на ленте самописца в виде  храматограммы.(рис.2)

В некоторый период времени  0 проба вводится в колонку. До выхода отдельных компонентов пробы  перо самописца вычерчивает прямую линию (ОА, АБ, ГД), называемую основной(рис.2)В  период времени А из колонки выходит газ-носитель. Объем газа, прошедший через колонку за время ОА, представляет собой объем задержки колонки.

     Раделяемые в колонке компоненты движутся медленнее газа-носителя, и первый компонент выходит из колонки в период времени от О до Б.Интервал времени между вводом пробы и появлением максимума пика (ОБ) называют временем удерживания данного компонента, а объем газа-носителя, прошедшего через колонку за это время, - удерживаемый объемом (V_R). Удерживаемый объем является специфической характеристикой данного компонента. Однако в практике чаще используют понятие относительного удерживаемого объемом (V_R⁰),который вычисляют по формуле:

V_R⁰=V_R/V_Rст.

где V_R- удерживаемый объем данного компонента;

V_Rст - удерживаемый объем вещества, принятого за стандарт,                                                                                                            измеренный при тех же условиях и на той же колонке.

     Разделение  смеси веществ определяется двумя  независимыми факторами: коэффициентом  разделения и эффективностью  колонки. Коэффициент разделения  определяет относительное положение  пиков на храматограмме, а эффективность колонки форму пиков.

Коэффициент разделения (α) вычисляют по формуле:

α=(V_R )₂/( V_R)₁

где (V_R )₂ и ( V_R)₁- удерживаемые объемы компонентов 1 и 2.

     При α=1 компоненты  образуют неразделенные пики. Коэффициент  разделения можно изменить соответствующим  подбором неподвижной фазы или  температуры  колонки. Хорошее  разделение компонентов получается  при коэффициенте разделения выше 1,2. Учитывая ширину пиков и величину удерживаемых объемов двух компонентов, можно рассчитать степень разделения этих компонентов по уравнению.

Ст.р.= 2∆y/y₁+y₂

где y₁+y₂  – ширина пиков компонентов 1 и 2;

∆y - разность удерживаемых объемов компонентов.

     Эффективность  колонки измеряется числом теоретических  тарелок. Согласно концепции «теоретических  тарелок» хроматографическую колонку мысленно рассматривают как аппарат, состоящий из ряда элементов, называемых теоретическими тарелками. В каждом таком элементе (тпрелке) при прохождении газа устанавливается полное равновесие между подвижной фазой – газом и неподвижной – жтдкостью, нанесенной на твердый носитель. Размер теоретической тарелки зависит от коэффициента распределения компонентов. В действительности, однако, хроматографический процесс протекает непрерывно во всех тарелках и полное равновесие в какой-либо точке не устанавливается. Поэтому практически можно рассчитать лишь высоту колонки, в которой происходит разделение, эквивалентное одной теоретической тарелке. Эта величина называется высотой эквивалентной теоретической тарелки (ВЭТТ).

     ВЭТТ вычесляют делением длины колонки на число теоретических тарелок (n), которое можно рассчитать по формуле: n=6*(х/у)²

где х – расстояние на основной линии между точкой ввода пробы и перпендикуляром, опущенным и точки максимума пика (рис.3).

у – ширина пика, определяемая касательными к точке перегиба (рис.3).

Число теоретических тарелок  указывает, сколько раз за время  продвижения газа через колонку  устанавливается равновесие  между  подвижной и неподвижной фазами. Чем больше число теоретичесих тарелок, тем выше эффективность колонки и острее пики на храматограмме.

     Эффективность  хроматографического анализа зависит от большого числа параметров. К числу таких параметров относятся: свойства растворителя – неподвижной фазы, температура опыта, длина колонки, ее форма и сечение, плотность заполнения колонки носителем, свойства газа-носителя, скорость и давление газового потока; количество нанесенного вещества и способ нанесения пробы, чувствительность детектора и стабильность его работы. При этом свойства и количества растворителя , длина и температура колонки определяют расстояние между пиками, а свойства, скорость и давление газа-носителя, плотность заполнения колонки, ее форма и сечение определяют размывание пика вещества, т. е. ширина пика.

     Хроматографические колонки. В зависимости от конструкции газового хроматографа колонки бывают различной формы (прямые V-образные, спиральные) и изготовляются из различного материала (стекло, медь, латунь и др.). диаметр колонки обычно равняется 4-8мм; колонки с большим диаметром 20мм применяют только для препаративных целей. Длину колонки подбирают эмпирическим путем в зависимости от состава анализируемой смеси. Обычно на колонках длиной 2-3 см можно достичь удовлетворительного разделения. Более длинные колонки используют для работы с трудноразделяемыми смесями.

     Неподвижная  фаза. Свойства неподвижной фазы  являются одним из важнейших  факторов, влияющих на разделение  смеси на компоненты. Выбор неподвижной  фазы определяется прежде всего  свойствами отдельных компонентов  исследуемой смеси, задачей исследования  и температурой опыта.Выбраная фаза должна обладать полной химической инертностью, малой вязкостью и быть практически нелетучей жидкостью при температуре опыта.Жидкие фазы, наиболее употребительные при анализе смесей жирных кислот, спиртов, глициридов и т. д.

     При анализе  очень сложной смеси используют  несколько жидких фаз, применяя  смесь жидкостей на одном носителе  или последовательно соединенные  колонки с различными жидкостями.

     Носители неподвижной  фазы. Выбранной жидкостью пропитывают  твердый носитель. Носитель должен  обладать большой удельной поверхностью  с широкими порами, быть инертным  по отношению к анализируемому  веществу и газу-носителю и  иметь достаточную механическую  прочность. В качестве носителя  чаще всего применяют целит545, огнеупорные кирпичи С-22 и стерхамол. Для этого отобранную фракцию носителя помещают в стакан и заливают концентрированной соляной кислотой в таком количестве, чтобы носитель был весь покрыт жидкостью. После перемешивания (вращательными движениями, чтобы не измельчить носитель) смесь отстаивают в течении 1 часа. Сливают избыток кислоты и промывают носитель вначале несколько раз водой (декантацией), затем раствором 1н. NaOH и еще водой до нейтральной реакции. После просушивания носителя в сушильном шкафу при 145° до полного удаления воды снова просеивают через сито с требуемым числом отверстий.

     Нанесение  неподвижной фазы на носитель. С целью равномерной пропитки  твердого носителя жидкостью  ее растворяют в летучем растворителе, заливают твердый носитель раствором  и растворитель медленно испаряют  на водяной бане при перемешивании.  Затем пропитанный жидкой фазой  носитель сушат в токе инертного  газа. Соотношение между жидкостью  и носителем зависит от цели  исследования, велечины пробы, а следовательно, от чувствительности детектора. Обычно количество жидкости составляет 5-30% от веса твердого носителя.

     Заполнение  колонок. Небольшую порцию высушенного  наполнителя вносят в колонку,  уплотняя его при помощи вибратора.  Колонку берут за концы двумя  руками и, прикасаясь к вращающемуся  валу вибратора, осторожно водят  ее вверх и вниз, уплотняя материал. Аналогичную операцию повторяют  с каждой порцией наполнителя,  при этом каждый рукав колонки  (если она имеет V-образную форму) заполняется отдельно. Когда весь материал введен в колонку, его закрывают кусочками стеклянной ваты.Нужно внимательно следить за тем, чтобы не было пустот при заполнении колонок. Излишняя плотность набивки затрудняет движение потока газа-носителя, а слишком рыхлая набивка уменьшает эффективность работы колонок. Заполненные колонки прогревают в течении суток при температуре 185-200° в токе газа-носителя. Заполненные колонки могут служить для очень большого числа анализов. Если со временем в колонке появятся разрывы, то высыпают наполнитель из колонки и заполняют ее вновь этой же порцией, если фаза сохранила еще свою активность.

     Газ-носитель (подвижная фаза). В качестве газа-носителя  используют водород, гелий, азот, аргон и углекислый газ, нерастворимые или весьма слабо растворимые в неподвижной фазе. Выбор газа в первую очередь определяется типом используемого детектора. Однако желательно применять газы с малыми вязкостью м коэффициентом диффузии, так как это позволяет работать с минимальным перепадом давления в колонке при оптимальной скорости газа. Снижение коэффициента диффузии газа уменьшает так называемые диффузионные эффекты, выражающиеся в уширении полос компонентов на хроматограмме. Детекторы в газожидкостной хроматографии используют различные типы детекторов. В зависимости от метода измерения они разделяются на интегральные и дифференциальные. Интегральные детекторы измеряют суммарное количество вещества, вышедшего из колонки за некоторый промежуток времени. Хроматограмма получается в виде ряда ступеней, каждая из которых соответствует появлению определенного компонента. Высота ступени пропорциональна количеству компонента в пробе. (рис.4).

     Дифференциальные  детекторы измеряют мгоновенное изменение концентрации вещества в газо-носителе. Так как компоненты пробы выходят из колонки постепенно, появление их записывается в виде кривой Гаусса (см рис.2). Площадь, ограниченная этой кривой и основной линией, пропорциональна концентрации компонента. В химии жиров используют в основном дифференциальные детекторы.

     В основу  определения состава выходящего  из колонки газа в наиболее  распространенных детекторах положено  измерение его физических свойств:  теплопроводности или электропроводности  при ионизации газа.

     Разделение  и определение высших жирных  кислот

Газо-жидкостная хроматография  обладает  высокой разрешающей  способностью, в следствии чего присутствие в жирнокислотной смеси незначительных количеств сопутствующих жирам веществ может затруднять идентификацию на хроматограмме малых пиков. Поэтому для определения жирнокислотного состава триглициридов, фосфолипидов и смеси свободных жирных кислот выделяют из общей фракции липидов указанные компоненты методом адсорбционной хроматографии

     Жирные кислоты  глициридов и фосфатидов получают путем их омыления одним из описанных выше методов. Выделенные жирные кислоты до хроматографирования хранят в виде разбавленных растворов в петролейном эфире в темноте и при низкой температуре (4°) во избежание окисления.

     Смеси жирных  кислот анализируют в виде  их метиловых эфиров, которые  имеют более низкую температуру  кипения по сравнению с температурой  кипения жирных кислот. По этой  причине разделение эфиров жирных  кислот можно вести при более  низких температурах и устранить  нежелательные изменения в процессе  хроматографирования. Кроме того, при разделении эфиров исключается димеризация жирных кислот и облегчается отделение насыщенных жирных кислот от ненасыщенных с тем, же числом углеродных атомов.

     Получение  метиловых эфиров . Метиловые эфиры жирных кислот можно получить несколькими методами.

     Метилирование жирных кислот в присутствии хлористого водорода в качестве катализатора

     Навеску жирных  кислот (1г) растворяют в 5-10 мл  сухого диэтилового эфира. Добавляют 5 мл 5%-ного раствора хлористого водорода в абсолютном метаноле и прогревают 3 ч. С обратным холодильником в глицириновой бане при температуре 80° в токе азота. После охлаждения в колбу добавляют 8мл воды и переносят содержимое колбы количественно в делительную воронку диэтиловым эфиром. Метиловые эфиры жирных кислот экстрагируют три раза эфиром порциями по 15 мл Эфирные вытяжки объединяют и промывают сначала 2%-ным раствором   Na₂CO₃  порциями по 5 мл до нейтральной реакции по метилоранжу и затем два раза водой (по 10 мл). Нейтральный экстракт метиловых эфиров медленно фильтруют через небольшой слой безводного Na₂SO₄. Растворитель отгоняют под вакуумом и метиловые эфры сохраняют в темноте при 4-5°.

     Метилирование жирных кислот диазометаном. Диазометан получают непосредственно перед метилированием из н-толилсульфонил-метилнитрозамида (МНСА). Прибор для метилирования состоит из трех соединенных последовательно пробирок с боковыми отводами.

     Получение  метиловых эфиров метанолизом глицеридов. В тех случаях, когда количеством неомыляемых веществ, содержащихся в смеси липидов, можно пренебречь, метиловые эфиры удобно получать метанолизом в присутствии метилата натрия.

Литература

1.Берчфилд Г.,Сторрс Э. Газовая хроматография в биохимии. М., «Мир,»1964.

2. Верещагин А.Г. Успехи химии т.23.1964,№11,с1349-1370

3. Кейлеманс А. Хромотография газов. М. ил,1959

4.Рудаков О.Б., Пономарев А.Н., Полянский К.К., Любарь А.В.                       Жиры.Химический состав и экспертиза качества-М.:ДеЛипринт.2005.-312с.

5. Филменс К. Хромотография газов. М.,ил,1958

Министерство образования  и науки Украины

Государственное высшее учебное  заведение

«Украинский государственный  химико-технологический университет»

Кафедра ХТВМС

Реферат

на тему: «Пиролитическая газовая хромотография»

Выполнила: ст. гр. 4-ТЖ-51

Мамаева Ирина

                                                                                          Проверила: Кушнир М.Л.

г.Днепропетровск

2013