Генетическая инженерия на уровне клеток. Соматическая гибридизация отдаленных видов растений

Содержание

Введение

         Бурное развитие новых методов исследований в генетике, расширение и углубление наших представлений о структуре и законах организации наследственного аппарата клетки обусловили создание и разработку принципиально новых методов. Раньше генетическое разнообразие форм растений и животных – исходного материала для селекции – экспериментально создавалось в селекции методами гибридизации, полиплоидии, мутагенеза и др. Теперь ученые могут достигать еще большего разнообразия благодаря манипулированию отдельными клетками живого организма, и отдельными генами. Родились новые понятия и направления современной генетики как: клеточная и генная инженерия. При этом принципиальное отличие данных методов от традиционно используемых в селекции, например мутагенеза, состоит в целенаправленном, а не случайном расширении границ изменчивости генотипа, в планируемом разнообразии исходного материала для селекции.

         Клеточная  инженерия – это использование комплекса генетических, клеточных или молекулярно-генетических методов при создании организмов с нужными человеку свойствами. В том случае, когда манипуляции осуществляют на уровне отдельных генов или их фрагментов, говорят о генной инженерии.

         В зависимости от целей исследования работу ведут на следующих уровнях приложения биотехнологических и генетико-инженерных методов: 1) молекулярном, когда дело касается отдельных частей генов, 2) генном, 3) хромосомном, 4) плазмидном, 5) клеточном, 6) тканевом, 7) организменном, 8) популяционном.

Цель: Целью данной работы является изучение генной и клеточной инженерии и ее значение в селекции растений, а также соматическую гибридизацию отдаленных видов растений.

Задачи: Задачей данной работы является понять и установить на основе примеров каким образом  применяют генную и клеточную инженерию для получение новых устойчивых видов сельскохозяйственных растений.

1. Генетическая инженерия на уровне клеток. Соматическая гибридизация отдаленных видов растений

        Начало клеточной инженерии относят к 1960-м гг. Развитие ряда новых методических приемов привело к расширению возможностей генетической инженерии на клеточном уровне. Определяющую роль сыграл метод гибридизации соматических клеток путем слияния изолированных протопластов (содержимого растительной клетки, освобожденной ферментативным путем от жесткой оболочки). Соматическую гибридизацию, т. е. получение гибридов без участия полового процесса, проводят, культивируя совместно клетки различных линий одного вида или клетки различных видов. При определённых условиях происходит слияние двух разных клеток в одну гибридную, содержащую оба генома объединившихся клеток. Такие протопласты от различных растений, в том числе и относящихся к разным видам, легко сливаются, объединяя в гибридной клетке генетическую информацию родительских форм. Например, можно получить слившиеся клетки ячменя и моркови, сои и кукурузы и т. д. Но такое слияние имеет смысл, только если оно приводит в результате к развитию полноценного организма. Затем из этой гибридной клетки можно вырастить целое растение. Данный метод позволяет создавать новые формы растений, не существующие в природе.

         Получение протопластов клеток растений оказалось возможным путем обработки в гипертонической среде клеток мезофилла ферментами пектиназой и целлюлазой, действующими на соединительные ткани листа и клеточные оболочки. В этой среде протопласты представляют собой сферические образования зеленого цвета, отделенные от окружающей среды только цитоплазматической мембраной. Для обеспечения слияния протопластов растительных клеток в качестве индуктора используют нитрат натрия, полиэтиленгликоль и другие вещества. После слияния двух протопластов в единый протопласт появляется возможность клонирования целого растения с суммой признаков родительских форм. При слиянии клеток разных видов удается получать соматические, или парасексуальные, гибриды. Этот способ открывает большие перспективы для генетической инженерии растительных клеток, особенно для создания таких геномов, которые вследствие строгой половой несовместимости родительских растений нельзя получить генеративным путем.

        Методика соматической гибридизации предусматривает последовательное осуществление следующих этапов:

1) препарирование в стерильных условиях нужной ткани;

2) приготовление суспензии клеток из ткани, например из мезофилла листа выбранных родительских растений;

3) ферментативное растворение оболочек клеток и получение оголенных протопластов;

4) стимуляции клеток;

5) обеспечение слияния ядер;

6) отбор слившихся гетерокарионтов;

7) обеспечение начала деления клеток;

8) регенерация гибридных растении.

        Даже упрощенное изображение этого процесса ясно показывает сложность создания соматических гибридов. Тем не менее гибридные растения путем слияния соматических клеток уже на 1.01.1985 г. были получены в 104 случаях, из них 35 внутривидовых, 48 межвидовых, 9 межродовых, 12 межтрибных и 16 межсемейственных гибридов. С практической точки зрения наибольший интерес представляет соматическая гибридизация различных видов одного рода.

        При гибридизации  соматических клеток растений  их предварительно освобождают  от плотной клеточной оболочки, а затем проводят слияние изолированных  протопластов. В этом случае, как  и при гибридизации клеток  животных, также удаётся преодолевать  барьеры нескрещиваемости, которые существуют при обычной (половой) гибридизации растений разных видов и родов. Из гибридной растительной клетки на специальной среде можно вырастить клеточную массу – каллус, дифференцирующуюся в нормальное целое растение с корнями, стеблями и т. д. Такое гибридное растение можно высадить в землю и выращивать и размножать обычными способами. Эти методы, в отличие от традиционных, позволяют сравнительно легко и быстро получать достаточное количество генетически разнообразного исходного материала для селекции. Их применение привело, напр., к увеличению урожайности ряда культур – картофеля, цитрусовых и др.

         Слияние протопластов открывает и другие возможности, более реальные на ближайшее время. Если основная доля генетической информации в клетке высших растений содержится в ядре, то часть ее, как известно, заключена в органеллах цитоплазмы: хлоропластах (обеспечивающих фотосинтез) и митохондриях (обусловливающих клеточное дыхание). Например, генетическая информация об устойчивости к гербицидам хранится в хлоропластах, а о мужской стерильности— в митохондриях. Мужская стерильность растений позволяет организовать массовое производство гибридных семян без кастрации материнских форм. В последние годы выявилась генетическая новизна соматических гибридов относительно сочетания ядерной и внехромосомной наследственности, они принципиально отличаются от половых: первые наследуют внеядерные гены от обоих родительских растений, вторые — только по материнской линии. Полагают, что при соматической гибридизации можно получить 12 жизнеспособных ядерно-цитоплазматических комбинаций, в то время как при половом процессе — только две.

         Получение различных ядерно-цитоплазматических комбинаций открывает совершенно новые возможности для селекций. В качестве примера практического использования этого метода можно привести работы с рапсом в Национальном институте агрономических исследований Франции. Была поставлена задача получить растения рапса с мужской стерильностью. В первой серии опытов путем классической межвидовой гибридизации рапса и редиса получили мужскистерильные растения рапса, в клетках которых ядро происходило от рапса, а цитоплазма от редиса. Мужская стерильность таких растений обусловлена митохондриями редиса, что очень удачно с агрономической точки зрения. Однако из-за присутствия в клетках хлоропластов редиса данные растения желтеют и не имеют нектарников, которые очень важны для привлечения пчел - опылителей. Для устранения этих недостатков осуществили слияние протопластов стерильного рапса с протопластами нормального рапса, в результате чего сформировались растения с ядром и хлоропластами нормального рапса и лишь с митохондриями редиса в клетках. Такие растения сохранили мужскую стерильность, но уже не желтеют, а цветки их имеют нектарники. Полагают, что последнее связано с рекомбинацией митохондриальной ДНК.

        Таким образом, с помощью соматической гибридизации можно получить многие отдаленные гибриды высших растений, чего нельзя добиться традиционными методами. С другой стороны, становится все более очевидным, что наибольшая результативность практической селекции зависит от разумного сочетания классических методов, возможности которых далеко не исчерпаны, с новыми методами генетической инженерии.

         Параллельно с разработкой методов гибридизации соматических клеток определилось и другое направление — клонирование протопластов для использования в практической селекции. У некоторых видов (табак, томат, морковь и др.) возможно формирование целого растения из отдельного протопласта после регенерации клеточной оболочки и образования каллуса. За последние 7—8 лет в этом направлении получены обнадеживающие практические результаты. Протопласты могут быть хорошими реципиентами для введения чужеродной генетической информации и как исходный материал для соматической гибридизации.

2. Генная инженерия

        Генная инженерия зародилась в недрах молекулярной генетики. Это новая генетическая технология, позволяющая экспериментировать с отдельными генами и их частями. Однако словосочетание «генная инженерия» все же несколько необычно: термин «инженерия» далек от биологии и предопределяет инженерные методы, а «генная» — передачу генетически обусловленных признаков. И действительно, генная инженерия на основе тщательного анализа материального носителя наследственной информации позволяет реконструировать наследственность. Использование методов генной инженерии дало возможность наладить промышленное производство ряда важных биологически активных веществ для лечения и диагностики наследственных заболеваний. В их числе прежде всего следует назвать инсулин: в ряде стран уже налажен его промышленный выпуск. Суть метода заключается в том, что гены одних организмов вводят в геномы других видов, порой очень отдаленных, чего нельзя добиться традиционным методом гибридизации. С помощью генной инженерии считается принципиально возможным включать в геном избранной клетки гены от практически любых организмов и даже гены, синтезированные химическими методами. Пока успехи в этой области достигнуты лишь на уровне микроорганизмов — на бактериях и фагах.

         А какова же все-таки роль генной инженерии в селекции растений? Ряд исследователей на основании накопленного в данной области опыта приходили к выводу, что в прикладных областях генная инженерия не даст чего-либо сверхзначительного. В то же время ее перспективность в решении некоторых конкретных вопросов бесспорна. Тем более, что с начала 80-х гг. введение в клетки растения чужеродных генов стало свершившимся фактом.

        Для улучшения сортов нужный ген вводят в растительную клетку с помощью специальных векторов (рекомбинантных плазмид Agrobacterium tumefaciens или A. rhizogenes). Затем из трансформированной клетки методом культуры тканей регенерируют полноценное растение с новыми биологическими свойствами, дающее семена нового сорта. Здесь представлены генно-инженерные манипуляции с растениями при участии этих бактерий. Agrobacterium tumefaciens вызывает у растений рак. Бактерия содержит плазмиду Ti, сегмент которой (Т-ДНК) способен встраиваться в хромосомную ДНК растительной клетки. Инфекция индуцирует синтез соединений — опинов, которые служат бактерии пищей. Этот механизм инфекции используют для введения в растения чужеродных генов. Идея, проиллюстрированная на рисунке, сводится к включению нужного гена в сайт Т-ДНК и к трансформации клетки растения такой рекомбинантной плазмидой. Клетка должна регенерировать в полноценное растение, причем встроенный ген лишает  Т-ДНК ее опухолевых свойств.

        Используя данный метод, удалось выделить ген устойчивости к гербицидам, который был перенесен в клетки табака, чтобы попытаться регенерировать из них устойчивые растения. Группа исследователей из США трансформировала клетки подсолнечника геном фазеолина (резервного белка фасоли), который хорошо экспрессировался в регенерировавших растениях и передавался потомству. Другая группа ученых успешно пересадила ген одного из ферментов фотосинтеза (точнее, малой его субъединицы),  который экспрессируется у полученного потомства.

         Использование в качестве вектора рекомбинантной плазмиды бактерии Agrobacterium rhizogenes имеет некоторую специфику. Она обладает плазмидой Ri, в которой также содержится т-ДНК, способная встраиваться в хромосомную ДНК растительных клеток. В данном случае Т-ДНК вызывает обильное корнеобразование — синдром hairy-root. Эта Т-ДНК функциональна, поскольку трансформированные клетки корней синтезируют опины. Преимущества данного вектора (в сравнении  с плазмидой Ti) состоят в том, что регенерация из корней представляется намного более простой и быстрой, чем из клеток раковой  опухоли.

        Проблем, связанных с применением генно-инженерных методов в селекции растений, много. Рассмотрим проблему обеспечения их питательными элементами. Растения окружены азотом атмосферы, но не могут им воспользоваться без посредников. К сожалению, в природе таких посредников мало — это азотфиксирующие бактерии. Уже давно пропагандируется смелая идея передать зерновым культурам группы генов nif из бактерий, фиксирующих атмосферный азот, и тем самым избавиться от необходимости вносить под указанные культуры азотные удобрения. Но, к сожалению, эта идея может навсегда остаться мечтой. Переносить придется 17 генов. И если предположить, что это удастся и все гены будут «работать», например, в геноме пшеницы, то, по оценкам специалистов, урожайность такого растения снизится на 20—30% (в пересчете на сухое вещество) вследствие энергозатрат на фиксацию азота.

        Некоторые растения, в частности бобовые, вступают в симбиоз с азотфиксирующими бактериями, что позволяет снижать дозы удобрений при их возделывании. Однако основная масса сельскохозяйственных культур, в том числе и зерновые, не способна к симбиозу, обеспечивающему фиксацию азота. По мнению ученых, один из путей создания «самоудобряющихся» растений — придание им с помощью генной инженерии способности вступать в симбиоз с азотфиксирующими бактериями.

        Кажется перспективным также преобразование самих бактерий. Наиболее реальной задачей ближайшего будущего считают внесение генов из азотфиксирующих бактерий в другую почвенную микрофлору, не способную фиксировать атмосферный азот и не вступающую в симбиоз с корнями растений. Необходимо расширить круг почвенных азотфиксирующих микроорганизмов. Этого можно добиться путем создания новых типов клубеньковых бактерий.

        Решение проблемы фиксации атмосферного азота с помощью генной инженерии поистине преобразило бы современное сельское хозяйство, позволило бы сэкономить миллиарды рублей, расходуемые на производство азотных удобрений, обеспечило бы сохранение окружающей среды. Возможные пути решения проблемы фиксации атмосферного азота показаны на рисунке XIV.

        Однако реконструкция растений на основе генной инженерии не ограничивается только проблемой азотфиксации. По мнению ряда ученых, может оказаться эффективным и полезным перенос генов, придающих растениям устойчивость к гербицидам и пестицидам. Но сделать это не так просто — такие гены еще предстоит найти, выделить и добиться их экспрессии.

        Вполне реален перенос в растения генов устойчивости к патогенам.

        Селекция новых сортов затрагивает свойства, контролируемые очень многими генами одновременно, и невозможно все их подвергнуть генно-инженерным манипуляциям. Поэтому большинство свойств растений останется вне досягаемости генной инженерии.

         Полагают, что генная инженерия особенно перспективна при изучении процессов развития и дифференциации растений, что поможет в будущем правильнее организовать селекционный процесс. Молекулярная биология предложила несколько интересных вспомогательных методов. Так, Р. Оуэнс и Т. Динер (R. A. Owens, Т. О. Diener, 1981) в США использовали фрагменты ДНК (зонды) для выявления вируса крайне опасной болезни картофеля — веретеновидности клубней, показав тем самым простой метод диагностики. Исследователи из Института растениеводства в Кембридже (Великобритания) смогли таким способом идентифицировать в геноме пшеницы фрагменты хромосом ржи после скрещивания этих видов.

         Попытки использования генной инженерии не ограничиваются приведенными примерами. Одним из перспективных направлений ее применения считают придание растениям устойчивости к поздним весенним и ранним осенним заморозкам, которые причиняют огромный ущерб сельскому хозяйству. Установлено, что имеются два вида бактерий, обитающих на поверхности растений, а именно Pseudomonas syringaе и Erwіnia herbіcola, которые служат центрами образования кристаллов льда. При отсутствии на поверхности листьев этих бактерий вода в тканях растений при снижении температуры до нескольких градусов ниже 0°С не замерзает, а становится сверхохлажденной. Растения могут выдержать температуру до - 8°С.

          Поэтому предпринимаются попытки освободить сельскохозяйственные культуры от этих бактерий как традиционными способами, так и основанными на методах генной инженерии. Одно из таких направлений – получение вирусов – бактериофагов, которые действуют изобретательно на бактерии, обитающие на поверхности растений, чтобы с их помощью уничтожить два упомянутых вида.

         Другое  направление работы по обеспечению  морозоустойчивости растений –  видоизменение с помощью методов  генной инженерии вызывающих  кристаллизацию бактерий таким  образом, чтобы они больше не  стимулировали этот процесс.

3. Практическое применение генной инженерии растений с использованием Ti – плазмид

         Для более наглядного представления рассмотрим пример, в котором ученым из разных стран, в том числе и нашей, удалось с помощью генно-инженерных методов создать ценные для селекции новые формы растений. (Рис.1). В природе существует бактерия Bacillus thuringiensis, которая нарабатывает белок, называемый эндотоксином. Свое название он получил потому, что при попадании этой бактерии в желудок насекомых – вредителей сельскохозяйственных растений этот белок вызывает лизис (разрушение) стенки желудка и гибель насекомого – вредителя. Это свойство белка генные инженеры решили использовать для создания форм полезных сельскохозяйственных растений, устойчивых к насекомым – вредителям. Они выделили из бактериальной ДНК ген, кодирующий белок эндотоксин. Далее ген был встроен в состав природных генетических векторов – Ti-плазмид, присутствующих в клетках почвенной бактерии Acrobacterium tumefaciens. Этой бактерией были заражены кусочки растительной ткани, выращиваемой на питательной среде. Через некоторое время плазмиды, несущие ген белка-токсина, внедрились в растительные клетки, а затем ген встроился в ДНК растений. О том, что этот процесс прошел успешно, сообщил специальный ген-«репортер», также искусственным путем введенный в состав Ti-плазмид. Затем кусочки растительной ткани перенесли на питательную среду другого состава, которая обеспечивает рост и развитие полноценных растений. В конце концов такие растения были выращены, и оказалось, что если на их листья посадить гусениц насекомых-вредителей, то, попробовав растительной ткани с белком-токсином, гусеницы погибают. Важно, что белок-токсин оказался гибельным только для насекомых и совершенно безвреден для человека и сельскохозяйственных животных. Описанным выше путем к настоящему моменту удалось получить формы картофеля, томатов, табака, рапса, устойчивые к разнообразным сельскохозяйственным вредителям. Это одно из первых и самых значительных достижений генной инженерии растений в практической селекции.

Рис.1. Бактерия Bacillus thuringiensis, которая нарабатывает белок, называемый эндотоксином

          Известно, что растения, так же как и животные, способны вырабатывать иммунитет. Этим замечательным свойством обладают только устойчивые растения, у которых при атаке патогенов сильно меняется метаболизм. Например, у устойчивых растений накапливаются такие химические соединения, как перекись водорода (Н2О2), салициловая кислота (SA), фитоалексины (соединения, выполняющие защитную функцию в растении). Повышенное содержание этих соединений способствует противостоянию растения в борьбе с патогенами. Вот один из примеров, доказывающий роль салициловой кислоты в иммунном ответе растений. Трансгенные растения табака, которые содержат бактериальный ген, контролирующий синтез салицилат гидролазы (этот фермент разрушает SA), были неспособны к иммунному ответу. Поэтому изменение генно-инженерным путем уровня салициловой кислоты или выработки в растениях в ответ на патоген H2O2 может быть перспективным для создания устойчивых трансгенных растений.

        В последние годы ученые используют новый подход для получения трансгенных растений с "antisense RNA" (перевернутой или антисмысловой РНК), который позволяет управлять работой интересуемого гена. В этом случае при конструировании вектора копию ДНК (к-ДНК) встраиваемого гена переворачивают на 180˚. В результате в трансгенном растении образуется нормальная молекула мРНК и перевернутая, которая в силу комплементарности нормальной мРНК образует с ней комплекс и закодированный белок не синтезируется. Такой подход использован для получения трансгенных растений томатов с улучшенным качеством плодов.    Вектор включал к-ДНК гена PG, контролирующего синтез полигалактуроназы (polygalacturonase) - фермента, участвующего в разрушении пектина, основного компонента межклеточного пространства растительных тканей. Продукт гена PG синтезируется в период созревания плодов томатов, а увеличение его количества приводит к тому, что томаты становятся более мягкими, что значительно сокращает срок их хранения. Отключение этого гена в трансгенах позволило получить растения томатов с новыми свойствами плодов, которые не только значительно дольше сохранялись, но и сами растения были более устойчивы к грибным заболеваниям. Такой же подход можно применить для регулирования сроков созревания томатов, а в качестве мишени в этом случае используют ген EFE (ethylene-forming enzyme), продуктом которого является фермент, участвующий в биосинтезе этилена. Этилен - это газообразный гормон, одной из функций которого является контроль за процессом созревания плодов.

        Таким образом, стратегия антисмысловых конструкций широко применима для модификации экспрессии генов. Эта стратегия используется не только для получения растений с новыми качествами, но и для фундаментальных исследований в генетике растений.

        Следует упомянуть еще об одном направлении в генной инженерии растений, которое до недавнего времени в основном использовали в фундаментальных исследованиях - для изучения роли гормонов в развитии растений. Суть экспериментов заключалась в получении трансгенных растений с комбинацией определенных бактериальных гормональных генов, например только iaaM или ipt и т.д. Эти эксперименты внесли существенный вклад в доказательство роли ауксинов и цитокининов в дифференцировке растений.

        В последние годы этот подход стали использовать в практической селекции. Оказалось, что плоды трансгенных растений с геном iaaM, находящимся под промотором гена Def (ген, который экспрессируется только в плодах), являются партенокарпическими, то есть сформировавшимися без опыления. Партенокарпические плоды характеризуются либо полным отсутствием семян, либо очень небольшим их количеством, что позволяет решить проблему "лишних косточек", например в арбузе, цитрусовых и т.д. Уже получены трансгенные растения кабачков, которые в целом не отличаются от контрольных, но практически не содержат семян.

        Остается добавить несколько слов еще об одном аспекте возможностей использования Ti-плазмиды агробактерии. Обезоруженную, лишенную онкогенов Ti-плазмиду ученые активно используют для получения мутаций. Этот метод носит название Т-ДНК-инсерционного мутагенеза. Т-ДНК, встраиваясь в геном растения, выключает ген, в который она встроилась, а по утрате функции можно легко отбирать мутанты. Этот метод замечателен также тем, что позволяет сразу обнаружить и клонировать соответствующий ген. В настоящее время таким способом получено множество новых мутаций растений и соответствующие гены клонированы. В лаборатории М.А. Раменской на основе Т-ДНК мутагенеза получены растения томатов с неспецифической устойчивостью к фитофторозу.

Заключение:

         В ходе выполнения данной работы, я выяснила, что генная и клеточная инженерия очень важны для развития огромного количества направлений..

         В сельском хозяйстве вклад генной и клеточной инженерии заключается в облегчении традиционных методов селекции растений и разработке новых технологий, позволяющих повысить эффективность сельского хозяйства. Во многих странах методами генетической и клеточной инженерии созданы высокопродуктивные и устойчивые к вредителям, болезням, гербицидам сорта сельскохозяйственных растений. Разработана техника оздоровления растений от накопленных инфекций, что особенно важно для вегетативно размножаемых культур (картофель и др.). Ведутся исследования по улучшению аминокислотного состава растительных белков. Разрабатываются новые регуляторы роста растений, микробиологические средства защиты растений от болезней и вредителей, бактериальные удобрения и т.д.

         Также генная и клеточная инженерия вносят огромный вклад не только в селекцию растений, но и имеет широкое применение в медицине и селекции животных.

Список использованной литературы:

1. «Селекция и семеноводство культурных растений»,  Ю.Л. Гужов, А. Фукс, П. Валичек;  Под ред. Ю.Л. Гужова, М.: Агропромиздат, 1991 г., с 306  по 313с.

2. «Селекция и семеноводство сельскохозяйственных культур», Нургасенов Т.Н., 2009 г., с  232 по 240 с.