Методы исследования биологических мембран

Для прогресса гистологии, цитологии и эмбриологии большое  значение имеет внедрение достижений физики и химии, новых методов  смежных наук — биохимии, молекулярной биологии, генной инженерии.

Современные методы исследования позволяют изучать ткани не только как единое целое, но и выделять из них отдельные типы клеток для  изучения их жизнедеятельности в  течение длительного времени, выделять отдельные клеточные органеллы  и составляющие их макромолекулы (например, ДНК), исследовать их функциональные особенности.

Такие возможности открылись  в связи с созданием новых  приборов и технологий — различных  типов микроскопов, компьютерной техники, рентгеноструктурного анализа, применения метода ядерно-магнитного резонанса (ЯМР), радиоактивных изотопов и авторадиографии, электрофореза и хроматографии, фракционирования клеточного содержимого  с помощью ультрацентрифугирования, разделения и культивирования клеток, получения гибридов; использования  биотехнологических методов — получения  гибридом и моноклональных антител, рекомбинантных ДНК и др.

Основными методами изучения биологических микрообъектов являются световая и электронная микроскопия, которые широко используются в экспериментальной  и клинической практике.

Микроскопирование — основной метод изучения микрообъектов, используемый в биологии более 300 лет. С момента  создания и применения первых микроскопов  они постоянно совершенствовались. Современные микроскопы представляют собой разнообразные сложные  оптические системы, обладающие высокой  разрешающей способностью. Размер самой  маленькой структуры, которую можно  видеть в микроскопе, определяется наименьшим разрешаемым расстоянием (d_o), которое в основном зависит от длины волны света (λ) и длины волн электромагнитных колебаний потока электронов и др. Эта зависимость приближенно определяется формулой d_o = 1/2λ Таким образом, чем меньше длина волны, тем меньше разрешаемое расстояние и тем меньшие по размерам микроструктуры можно видеть в препарате. Для изучения гистологических препаратов применяют разнообразные виды световых микроскопов и электронные микроскопы.

                                     Электронная микроскопия.

      Большим шагом вперед в развитии техники микроскопии были создание и применение электронного микроскопа (см. рис. 1, Б). В электронном микроскопе используется поток электронов с более короткими, чем в световом микроскопе, длинами волн. При напряжении 50000 В длина волны электромагнитных колебаний, возникающих при движении потока электронов в вакууме, равна 0,0056 нм. Теоретически рассчитано, что разрешаемое расстояние в этих условиях может быть около 0,002 нм, или 0,000002 мкм, т.е. в 100 000 раз меньше, чем в световом микроскопе. Практически в современных электронных микроскопах разрешаемое расстояние составляет около 0,1—0,7 нм.

В настоящее время широко используются трансмиссионные (просвечивающие) электронные микроскопы (ТЭМ) и сканирующие (растровые) электронные микроскопы (СЭМ). С помощью ТЭМ можно получить лишь плоскостное изображение изучаемого микрообъекта. Для получения пространственного  представления о структурах применяют  СЭМ, способные создавать трехмерное изображение. Растровый электронный  микроскоп работает по принципу сканирования электронным микрозондом исследуемого объекта, т. е. последовательно «ощупывает»  остро сфокусированным электронным  пучком отдельные точки поверхности. Для исследования выбранного участка  микрозонд двигается по его поверхности  под действием отклоняющих катушек (принцип телевизионной развертки). Такое исследование объекта называется сканированием (считыванием), а рисунок, по которому движется микрозонд, —  растром. Полученное изображение выводится на телевизионный экран, электронный луч которого движется синхронно с микрозондом.

Главными достоинствами  растровой электронной микроскопии  являются большая глубина резкости, широкий диапазон непрерывного изменения  увеличения (от десятков до десятков тысяч  раз) и высокая разрешающая способность.

Электронная микроскопия  по методу замораживания — скалывания применяется для изучения деталей  строения мембран и межклеточных соединений. Для изготовления сколов клетки замораживают при низкой температуре (—160°С). При исследовании мембраны плоскость скола проходит через  середину бислоя липидов. Далее на внутренние поверхности полученных половинок  мембран напыляют металлы (платина, палладий, уран), изучают их с помощью  ТЭМ и микрофотографии.

Метод криоэлектронной микроскопии. Быстро замороженный тонкий слой (около 100 нм) образца ткани помещают на микроскопическую решетку и исследуют  в вакууме микроскопа при -160°С.

Метод электронной микроскопии  «замораживание — травление» применяют  для изучения внешней поверхности  мембран клеток. После быстрого замораживания  клеток при очень низкой температуре  блок раскалывают лезвием ножа. Образующиеся кристаллы льда удаляют путем  возгонки воды в вакууме. Затем участки  клеток оттеняют, напыляя тонкую пленку тяжелого металла (например, платины). Метод позволяет выявлять трехмерную организацию структур.

Таким образом, методы замораживания  — скалывания и замораживания  — травления позволяют изучать  нефиксированные клетки без образования  в них артефактов, вызываемых фиксацией.

Методы контрастирования солями тяжелых металлов позволяют  исследовать в электронном микроскопе отдельные макромолекулы — ДНК, крупных белков (например, миозин). При  негативном контрастировании изучают  агрегаты макромолекул (рибосомы, вирусы) либо белковые филаменты (актиновые  нити).

Электронная микроскопия  ультратонких срезов, полученных методом  криоулътра-микротомии. При этом методе кусочки тканей без фиксации и  заливки в твердые среды быстро охлаждают в жидком азоте при  температуре —196 °С. Это обеспечивает торможение метаболических процессов  клеток и переход воды из жидкой фазы в твердую. Далее блоки режут  на ультрамикротоме при низкой температуре. Такой метод приготовления срезов обычно используют для определения  активности ферментов, а также для  проведения иммунохимических реакций. Для выявления антигенов применяют  антитела, связанные с частицами  коллоидного золота, локализацию  которого легко выявить на препаратах.

Методы сверхвысоковольтной  микроскопии. Используют электронные  микроскопы с ускоряющим напряжением  до 3 000 000 В. Преимущество этих микроскопов  в том, что они позволяют исследовать  объекты большой толщины (1—10 мкм), так как при высокой энергии  электронов они меньше поглощаются  объектом. Стереоскопическая съемка позволяет получать информацию о  трехмерной организации внутриклеточных  структур с высоким разрешением (около 0,5 нм).

Требования к  препарату:

Должен быть тонким, так  как электроны быстро поглощаются  и рассеивают вещество. С другой  стороны  исследуемые объекты  должны  быть устойчивы к электронной  бомбардировке.

В электронном  микроскопе  носителями являются электроны. Источник  электронов- подогреваемый  катод-1. 2-электронная пушка- это система  из фокусированного электрода и анода, которые  ускоряют электроны, и  образуют пучок. АВ- предмет  с  которым взаимодействует поток  электронов. Затем поток электронов  преобразуется  и содержит информацию о предмете. Формирование  потока  электронов  происходит под  воздействием электрополя (это система электронов и конденсаторов).

Электронные линзы:

3- конденсаторная

4-электронная

5-проекционная

Изображение регистрируется на чувствительной фотопластинке.

                              Электронный парамагнитный резонанс.

         ЭПР — это очень ценный метод изучения мембран. Обычно в качестве меток используются стабильные парамагнитные соединения, содержащие нитроксидный радикал. Неспаренный электрон при наложении сильного магнитного поля переходит с одного энергетического уровня на другой под действием микроволнового излучения. Метод очень чувствителен: обычно спектр регистрируется при концентрации спиновых меток около 10"*М в 50 мкл образца. Спектр ЭПР, как правило, представляют в виде первой производной от спектра поглощения.

В спектре  нитроксидного радикала имеются  три пика, отвечающие спин-спиновым взаимодействиям неспаренного электрона  и ядра атома азота. И положение  спектра, и расщепление, обусловленное  спином ядра, зависят от ориентации молекулы относительно внешнего поля. Как мы уже говорили в предыдущем разделе, это означает, что характер спектра зависит от характера  вращения молекулы. На рис. 5.3 приведены  спектры для самых разных случаев  — от свободного вращения до полной неподвижности. Для того чтобы найти  т_к в предположении, что вращательное движение молекулы изотропно, можно использовать простое уравнение, в которое входит высота пиков. Этот подход наиболее применим для такой метки, как TEMPO.

Спиновые  метки — производные жирных кислот или фосфолипидов, — конечно, не вращаются изотропно, и в этом случае для нахождения параметра  упорядоченности S из величины расщепления между линиями спектра используется вторая простая формула. Предположив, что такие метки имеют форму жесткого стержня, можно из величины параметра S оценить максимальное отклонение зонда от нормали к поверхности мембраны.

Многие  предположения, которые делаются при  нахождении из спектров ЭПР времен вращательной корреляции или параметра  S, снижают ценность этого метода для определения количественных характеристик молекул. Эти параметры тем не менее позволяют получить качественное представление о поведении мембраны. Результаты измерения степени упорядоченности спиновых меток, фиксированных в мембране на разной глубине, свидетельствуют об увеличении неупорядоченности в направлении от поверхности мембраны к ее центральной области. Качественно такая же картина получена с помощью ²Н-ЯМР. Во многих исследованиях проводилось сравнение текучести мембран, которую определяли по данным о величинах т_к и S для спиновых меток, при различных возмущающих воздействиях.

                     Дифференциальная сканирующая калориметрия.

В биологических мембранах  липидный слой по всем имеющимся данным представляет собой жидкое тело с  вязкостью, близкой к вязкости подсолнечного  масла. Строго говоря текучесть мембраны ограничена внутренней гидрофобной  фазой, которая состоит из углеводородных цепей жирных кислот. Эта фаза, однако, не всегда бывает жидкой. При охлаждении до температур ниже 10^оС мембраны замерзают, т.е. жидкая фаза затвердевает, приобретая свойства двумерного кристалла.

В мембранах, образованныых  синтетическими липидами, фазовый переход  из жидкого в твёрдое состояние  может происходить при более  высоких температурах, в зависимости от химического состава фосфолипида. В таблице 1 приведены температуры фазовых переходов некоторых синтетических фосфатидилхолинов (лецитинов).

Таблица 1. Температуры плавления некоторых синтетических фосфолипидов

Полное название фосфолипидов: ДМЛ - 1,2-димиристоилфосфатидилхолин (ещё одно возможное сокращение - ДМФХ) и так далее.

Для изучения фазовых переходов  при нагревании используют метод  дифференциальной сканирующей микрокалориметрии (сокращённо - ДСК). Не останавливаясь на конструкции прибора, отметим только, что в конечном счёте с его  помощью записывается кривая теплоёмкости, т.е. зависимость теплоёмкости липидов  или мембран в суспензии от температуры

Рисунок 1. Фазовые переходы в суспензии фосфолипидных везикул (липосом) по данным дифференциальной сканирующей микрокалориметрии (ДСК)

Перед приготовлением липосом  к фосфолипидам было дабавлено разное количество холестерина; его содержание в молярных процентах указано  у кривых.

По оси ординат отложена теплоёмкость, по оси абсцисс - температура, K.

Метод называется дифференциальным, потому что измеряется только теплоёмкость суспендированного материала на фоне гораздо большей теплоёмкости раствора сравнения. Примеры таких  кривых даны на рис.1, где приведены  кривые ДСК для дистеароилфосфатидилхолина (ДСЛ). На этих кривых, в частности, видно  увеличение температурного интервала  фазового перехода при добавлении к  липиду в мембране холестерина.

Параметры кривых теплоемкости

На рисунке 2 слева более  подробно обозначены параметры кривой ДСК. На первом этапе нас будут  интерессовать три из них:

1 - Температура фазового  перехода ("плавления") T_c.

2 - Температурный интервал ("ширина") фазового перехода.

3 - Общее количество тепла  Q, поглощённого при плавлении. Оно представляет собой площадь под кривой ДСК, т.е. функции C=f(T)

Рисунок 2. Характеристик фазовых переходов в липидах по данным дифференциальной сканирующей микрокалориметрии

Кривые плавления

Кривой плавления называется зависимость доли жидкой фазы в общем  количестве изучаемого вещества, в  данном случае - липидов мембран.                   

Рисунок 3. Кривая плавления липидов в липосомах, приготовленных из ДПЛ

Обозначим количество липидов  в жидкой фазе через m_l, а количество липидов в твёрдой фазе через m_s. Тогда доля жидких липидов будет равна

 (2)

На рис. 3. приведена кривая плавления дистеароил-фосфатидил холина (или дипальмитоил-лецитина, ДПЛ).

Методы измерения кривых плавления

Для определения  доли жидкой фазы в общем объёме изучаемого материала, в нашем случае, - в липидной слое мембран, можно использовать разные методы.

Анализ кривых ДСК

Один из них основан  на анализе кривых, полученных методом  дифференциальной сканирующей калориметрии. Обратимся снова к рисунку 2.

Пусть удельная теплота плавления  липида равна Q_m, а количество липодов в образце составляет m кмолей. Общее количество энергии, поглощённой образцом в интервале температур плавления T₁-T₂ равно очевидно площади под кривой C=f(T), т.е.

 (3)

В интервале температур от T₁ до текущей температуры T расплавится количество молей липида  m_д , и при этом поглотится количество тепла, равное

 (4)

(заштрихованная площадь  на рис.2).

При темпаратуре T молярная доля липидов, находящихся в жидкой фазе равна

 (5)

Таким образом, измеряя по отношению площадей под кривой C=f(T) при разных темпраратурах, мы строим кривую плавления =f(T).

                                       Ядерный магнитный резонанс.

Одна из основных особенностей живых организмов – огромное число  связей и взаимодействий как внутри них, так и с внешним миром. Видный советский биофизик М.В. Волькенштейн подчеркивал:“Живая природа, живые  организмы представляют собой многоуровневые сложные системы. Большие и малые  молекулы, клеточные органоиды, клетки, ткани, органы, организмы, популяции, биоценозы, биосфера...”. Он определял живой  организм “...как открытую, саморегулируемую, самовоспроизводящуюся и развивающуюся  гетерогенную систему...”.

Таким образом, живые организмы  – это, во-первых, открытые системы, которые обмениваются с внешней  средой веществом и энергией. Во-вторых, это – неоднородные, гетерогенные структуры, на поддержание определенного  строения в которых необходимы энергетические затраты.

Магнитные моменты ядер “чувствуют”  поля ближайшего окружения и “передают” информацию о структуре исследуемых  веществ. Поэтому, спектры ЯМР, отражая  многокомпонентную структуру биологических  объектов, характеризуются сложным  строением.

Среди спектроскопических методов  ЯМР отличается тем, что наряду со структурной информацией об исследуемом  объекте, он позволяет получать динамические характеристики изучаемой системы: трансляционную и вращательную подвижность  ядер, атомов и молекул.

Следовательно, применение метода ЯМР в биологии позволяет  получить больше информации по сравнению  с другими методами.

Как показывает эксперимент, суспензии клеток представляют собой  простейшие гетерогенные системы: двухкомпонентную или трехкомпонентную с обменом (переносом) молекул веществ (ядерных  спинов) через клеточные мембраны. Модель двухкомпонентной системы ядерных  спинов с обменом намагниченности  между компонентами широко используется для интерпретации экспериментальных  данных при исследовании различных  физико-химических и биологических  систем, например, рабочее вещество ЯМР-магнитометров и тесламетров  с динамической поляризацией ядеp представляет собой бинарную систему ядерных  спинов.

Нами проведено моделирование  и детальное изучение свойств  двухкомпонентной системы, дано решение  обратной задачи ЯМР-релаксации – определение  параметров компонент по измеряемым в эксперименте параметрам: амплитудам и временам релаксации компонент  сигнала ЯМР. Показано, что при  изменении экспериментальных условий, например, температуры, возможен сдвиг  “рабочей точки”, т.е. происходит изменение  условий, в результате чего первоначальное приближение уже не работает. Игнорирование  этого обстоятельства при использовании  приближенных выражений приводит к  неверной интерпретации опытных  данных, которая, например, описана  в литературе при изучении температурной  зависимости переноса молекул воды через эритроцитарную мембрану, или  при исследовании энергии активации  диффузии воды.

Предложен метод определения  осмотических свойств клеточных  мембран – изменения внутриклеточного объема при одновременном контроле водной проницаемости мембраны.

Этим методом были исследованы  различные клетки (эритроциты, E. Coli, и т.д.) и выявлены особенности  осмотического поведения в зависимости  от строения клеточной стенки. Предложен  способ определения внутриклеточного осмотического давления.

Логическим продолжением данного метода стал предложенный нами способ исследования свойств мембран  клеток при замораживании.

При исследовании в зоне отрицательных температур изменяется ряд параметров: температура, концентрация раствора, ионная сила и т.д. Сюда же добавляется механическое действие льда.

В ходе криобиологических  экспериментов на клетки одновременно воздействует комплекс повреждающих факторов: происходит образование и рекристаллизация льда, изменяются температура, концентрация раствора, осмотические и ионные силы и т.д. Существующие способы исследования свойств клеток в области отрицательных  температур измеряют интегральное действие повреждающих факторов после всего  цикла замораживание-отогрев. Предложенный нами метод позволяет дифференцированно  определять действие повреждающих факторов и изменения их водной проницаемости  от различных физических факторов в  условиях льдообразования.

Согласно разработанному способу различают отдельно повреждения  мембран в результате: увеличения осмотического давления внеклеточной среды и воздействий кристаллами  льда, а также при рекристаллизации льда на этапе размораживания. Способ позволяет различать изменения  проницаемости мембран вследствие: изменения осмотического давления в цикле замораживание-отогрев, воздействия  кристаллами льда при замораживании, а также воздействия кристаллами  льда при замораживании-отогреве. Предложенным способом определяют изменение водной проницаемости в замороженном состоянии  в результате увеличения осмотического  давления внеклеточной среды, если в  процессе замораживания клетки не повреждаются.

Дифференцировка причин повреждений  клеток и изменений барьерных  свойств мембран в ходе эксперимента позволяют судить о динамике процессов, происходящих в зоне отрицательных  температур, выделять как повреждающие факторы, так и этап повреждения, на котором эти факторы воздействуют.

Проведено исследование терморезистентности (термоустойчивости) клеток. Показано,что  у жизнеспособных клеток в осмотически  активных средах возрастает устойчивость к нагреву.

При измерении кривой продольной намагниченности суспензия клеток должна рассматриваться уже как  трехкомпонентная система. Нами проведено  моделирование процессов в трехкомпонентной системе и показано согласие с  экспериментальными данными.  

Литература 

1. Скрыпин В.И., Волкова  Л.А., Рыжов В.Г., Сахаров Б.В., Волков  В.Я.

Исследование повреждений  модельных и биологических мембран  при замораживании-оттаивании радиоспектроскопическими методами. - Всесоюзный симпозиум “Магнитный резонанс в биологии и медицине”, Тезисы докладов, Звенигород, 1981. 

2. Исангалин Ф.Ш., Рыжов  В.Г., Волков В.Я. 

Изучение эффектов осмотического  сжатия клеток методом импульсного  ЯМР. - I Всесоюзный биофизический съезд, Тезисы докладов, Т.2, с.9, 1982.

3. Рыжов В.Г.

Применение метода ЯМР-релаксации для исследования реакции клеток на образование внеклеточного льда. - Вторая Всесоюзная конференция по теоретическим и прикладным вопросам криобиологии, Тезисы докладов, Т.1, с.892, Харьков, 1984. 

4. Гулевский А.К., Волкова  Л.А., Рыжов В.Г., Волков В.Я.

О температурном диапазоне  нарушения проницаемости плазматических мембран эритроцитов для катионов и воды при медленном замораживании. - Биофизика, N 3, 1984, с. 502, Полностью депон. В ВИНИТИ 29.02.1984 N 1150-84. 

5. Рыжов В.Г., Исангалин  Ф.Ш., Волков В.Я.

ЯМР-релаксация в двухфазной системе. Применение парамагнитных  ионов для определения осмотических свойств эритроцитарной мембраны. - Деп. ВНИИСЭНТИ Главмикробиопром, 1985, 42с. 

6. Рыжов В.Г., Исангалин  Ф.Ш., Волков В.Я.

Способ определения осмотических свойств клеточных мембран. (Методом  ЯМР). - А.С. N1224693, Приоритет от 06.07.84.

7. Рубин А.Б. Биофизика.  Книга 2. Биофизика клеточных процессов.  М.: Высшая школа, 1987.

8. Современные достижения  физики (в помощь школьнику). М.: Наука, 1990.

9. Ивков В.Г., Берестовский  Г.Н. Динамическая структура липидного  бислоя. М.: Наука, 1978.

10. Антонов В.Ф., Смирнова  Е.Ю., Шевченко Е.В. Липидные мембраны  при фазовых превращениях. М.: Наука, 1992.

12. Беркинблит М.Б., Глаголева  Е.Г. Электричество в живых  организмах. Библиотечка "Квант", вып. 69. М.: Наука, 1988.

13. Биофизика сложных систем  и радиационных нарушений. М.: Наука, 1977.

14. Ходжкин А. Нервный  импульс. М.: Мир, 1965.