Микроскопия
Міністерство освіти і науки України
Національний технічний університет України
“Київський політехнічний інститут”
Видавничо-поліграфічний
інститут
Кафедра
технології поліграфічного виробництва
Р
Е Ф Е Р А Т
З дисципліни “Фізико-хімічні методи
аналізу ”
на тему
Мікроскопія
Студента
ІV курс
Перевірив
Київ 2011
Зміст
Втуп
Оптична мікроскопія
Ультрамікроскопія
Електронна мікроскопія
Трансмісійна мікроскопія
Растрова мікроскопія
Скануюча тунельна мікроскопія
Атомно-силова мікроскопія
Література
Втуп
Протягом тривалого часу людина жила в оточенні невидимих істот, використовувла продукти їх життєдіяльності (наприклад, при випічці хліба з кислого тесту, приготуванні вина й оцту), страждала, коли ці істоти були причинами хвороб або псували запаси їжі, але не підозрювала про їх присутність . Не підозрювала тому, що не бачила, а не бачила тому, що розміри цих мікро істот лежали багато нижче тієї межі видимості, на що здатний людське око. Відомо, що людина з нормальним зором на оптимальній відстані (25-30 см) може розрізнити у вигляді точки предмет розміром 0,07-0,08 мм. Менші об'єкти людина помітити не може. Це визначається особливостями будови його органу зору.
Приблизно в той же час, коли почалося дослідження космосу за допомогою телескопів, були зроблені перші спроби розкрити, за допомогою лінз таємниці мікросвіту. Так, при археологічних розкопках в Стародавньому Вавилоні знаходили двоопуклі лінзи - найпростіші оптичні прилади. Лінзи були виготовлені з відшліфованого гірського кришталю. Можна вважати, що з їх винаходом людина зробила перший крок на шляху в мікросвіт.
Найпростіший спосіб збільшити зображення невеликого предмета - це спостерігати його за допомогою лупи. Лупою називають лінзу з малим фокусною відстанню (як правило, не більше 10 см), вставлену в рукоятку.
Творець телескопа Галілей в 1610 році виявив, що в сильно розсунутому стан його зорова труба дозволяє сильно збільшити дрібні предмети. Його можна вважати винахідником мікроскопа, що складається з позитивної і негативної лінз.
Більш досконалим інструментом для спостереження мікроскопічних предметів є простий мікроскоп. Коли з'явилися ці прилади, в точності невідомо. На самому початку XVII століття кілька таких мікроскопів виготовив очковий майстер Захарія Янсен з Міддельбурга.
У творі А. Кирхера, що вийшов в 1646 році, міститься опис найпростішого мікроскопа, названого ним "блошиних склом". Він складався з лупи, вправленої в мідну основу, на якій зміцнювали предметний столик, який служив для приміщення розглянутого об'єкта; внизу знаходилося плоске або увігнуте дзеркало, що відбиває сонячні промені на предмет і таким чином висвітлює його знизу. Лупу пересували допомогою гвинта до предметного столика, поки зображення не ставало виразним і ясним.
Перші видатні відкриття були зроблені саме з допомогою простого мікроскопа. У середині XVII століття блискучих успіхів домігся голландський натураліст Антоні Ван Левенгук. Протягом багатьох років Левенгук вдосконалювався у виготовленні крихітних (іноді менше 1 мм в діаметрі) двоопуклих лінз, які він виготовляв з маленьких скляних кульок, в свою чергу отримує в результаті розплавлення скляної палички в полум'я. Потім цю скляну кульку піддавав шліфовці на примітивному шліфувальному верстаті. Протягом свого життя Левенгук виготовив не менше 400 подібних мікроскопів. Один з них, що зберігається в університетському музеї в Утрехті, дає більш ніж 300-кратне збільшення, що для XVII століття було величезним успіхом.
На початку XVII століття з'явилися більш складні мікроскопи, які складались з двох лінз. Винахідник такого складного мікроскопа точно не відомий, але багато фактів говорять про те, що їм був голландець Корнелій Дребель, що жив у Лондоні і перебував на службі в англійського короля Якова I. У складному мікроскопі було два скла: одне - об'єктив - звернене до предмета, інше - окуляр - звернене до ока спостерігача. У перших мікроскопах об'єктивом служило двоопуклою скло, що давало дійсне, збільшене, але дзеркальне зображення. Це зображення і розглядалося за допомогою окуляра, який грав, таким чином, роль лупи, але тільки лупа служила для збільшення не самого предмета, а його зображення. У 1663 році мікроскоп Дребеля був удосконалений англійським фізиком Робертом Гуком, який ввів в нього третє лінзу. Цей тип мікроскопа придбав велику популярність, і більшість мікроскопів кінця XVII-першої половини XVIII століття будувалися за його схемою.
Мікроскоп - прилад для отримання збільшеного зображення об'єктів або деталей їх структури, не видимих неозброєним оком. Око здатне розрізняти деталі об'єкта, віддалені один від одного не менше ніж на 0,08 мм; за допомогою світлового мікроскопа можна бачити деталі, відстань між якими становить до 0,2мкм; електронний мікроскоп дозволяє отримати розширення до 0,1-0,01 нм.
Швидке
поширення і вдосконалення
У 1625 р. членом Римської «Академії пильних» («Akudemia dei lincei») І. Фабер був запропонований термін «мікроскоп». Перші успіхи, пов'язані із застосуванням мікроскопа в наукових біологічних дослідженнях, були досягнуті Гуком (R. Hooke), який першим описав рослинну клітину (близько 1665 р.).
Оптична мікроскопія
Розвиток оптичних методів у мікроскопії привело до теперішнього часу до появи величезної кількості методик, багато з яких слід було б віднести до класичних. Введення цих основних понять ми виконаємо на прикладі мікроскопа з широким полем зору (рис.1 )
Рис. 1. Схема "класичного" оптичного мікроскопа з широким полем зору.
У
такому мікроскопі певне поле зору
рівномірно висвітлюється світловим
пучком, потім оптична система
проектує зображення об'єкта, що знаходиться
у полі зору на сітківку ока або на площину
фотоприймача. При цьому в фотоприймач
потрапляє світло, і спущений з різних
областей зразка: як перебувають у фокусі
об'єктивної лінзи, так і поза фокусом
(рис. 2).
Рис. 2. У мікроскопі з широким полем зору одночасно видні різні точки зразка, при цьому точки з площин відмінних від предметної створюватимуть фонове засвічення, що знижує контрастність.
У флуоресцентній мікроскопії об'єкт стає видимим не завдяки світлу від первинного джерела, який він пропускає або відбиває як у звичайній мікроскопії, а завдяки флуоресценції, що збуджується в ньому світлом або ж катодними або рентгенівськими променями. Сам мікроскоп не відрізняється від інших типів мікроскопів.
Кварцові лінзи не потрібні, якщо спостерігається видима флуоресценція. Так само як і у звичайній мікроскопії, об'єкти розглядаються в минаючому світлі (світло падає знизу, якщо мікроскоп перебуває у вертикальному положенні) або у відбитому світлі (світло падає зверху). Для непрозорих об'єктів застосуємо тільки другий спосіб. Він має те достоїнство, що не вимагає тонких зрізів об'єкта що спостерігається.
Отже, для фіолетової й близької ультрафіолетової області більше підходящою є вугільна дуга, а для далекої ультрафіолетової області - ртутна дуга високого тиску. Хайтингер, спеціаліст у флуоресцентній мікроскопії, рекомендує дугу між залізними електродами, що горить при 5А и 40V у закритій металевій камері, що має невеликий отвір для виходу пучка збудливого світла.
Якщо дозволяє фокусна відстань об'єктива мікроскопа, світло може бути спрямований на об'єкт зверху під кутом в 45° за допомогою ввігнутого дзеркала. Однак при великому збільшенні й, особливо, при імерсійних системах це нездійсненно. Для цієї мети у звичайних мікроскопах існують різні типи вертикальних освітлювачів. Для флуоресцентної мікроскопії був сконструйований спеціальний пристрій, що сполучить велике збільшення й більшу світлосилу. Потрібно мати на увазі, що всі дзеркала й відбивачі для збудливого світла повинні мати поверхню покриту алюмінієм, а не посріблену.
Об'єктив мікроскопа повинен бути по можливості захищений від відбитого світла фільтром, що не пропускає ультрафіолетові промені. Об'єкти, розглянуті під флуоресцентним мікроскопом, бувають двох різних типів.
Вони або проводять люмінісценцію самі по собі, або повинні бути пофарбовані флюоpиcцентним розчином точно так само, як при звичайному мікроскопічному дослідженні. Хайтингер приводить довгий перелік барвників і інших органічних сполук,. які можуть бути застосовані для цієї мети.
До відомого ступеня вибір "флуорохрома" визначається природою речовини, його кислотністю, властивим йому кольором, природною флуоресценцією окремих частин об'єкта й т.д. Для порушення катодними променями мінеральних фосфорів під мікроскопом Геллап розробив простий пристрій.
Катодні
промені він одержував
Прилад служив для вибору мікрокристалічного матеріалу для флуоресціюючих екранів, порушуваних катодними променями, в умовах порушення, подібних з тими, які є в осцилографах і інших катодних трубках. Та обставина, що у флуоресцентних мікроскопах розглядаються об'єкти, видимі завдяки власному світінню, а не за допомогою відбитого або минаючого світла, не вносить істотної різниці в змісті теоретичної роздільної здатності, що в обох випадках визначається довжиною хвилі видимого світла й апертурою об'єктива.
Однак,
якщо інтенсивність флуоресценції досить
велика, цей метод може бути застосований
для ультрамікроскопії як метод темного
поля. Тут можна буде виявляти об'єкти
з діаметром, менше роздільної здатності
мікроскопа, причому, звичайно, в об'єктів
не можна буде розрізняти їхню форму й
будову.
Ультрамікроскопія
Ультрамікроскопа (від лат. Ultra, грец. Mikros - маленький і skopeo - дивлюся), оптичний метод спостереження та аналізу колоїдних частинок в рідкому або газовій фазі за допомогою ультрамікроскопа (УМ). Розроблено та реалізовано P. Зігмонді і Г. Зідентопфом (1903), який створив перший УМ (рис.3). У ньому досліджувана система нерухома. Містить досліджувану речовину яка висвітлюється через прямокутну щілину, зображення якої проектується в зону спостереження. У окуляр спостерігача мікроскопа видно крапки, що світяться, що знаходяться в площині зображення щілини. Вище і нижче освітленої зони присутність частинок не виявляється.
Рис. 3. Схема щілинного ультрамікроскопа: 1 - джерело світла; 2 - конденсор; 3 - оптич. щілину, 4 - освітить, об'єктив, 5 - кювета; 6 - наблюдатеся. мікроскоп.
В основі ультрамікроскопії лежить дифракція світла на колоїдних частках, розмір яких менше половини довжини світлової хвилі, в результаті чого система починає світитися. Частинки можна спостерігати в УМ як яскраві дифракції плям, вивчати їх природу, оцінювати концентрацію, однак зображень частинок мікроскоп не створює. Яскравість світіння, а отже, і видимість частинок залежать від різниці показників заломлення частки і дисперсійного середовища. Якщо вони великі, то чітко фіксуються частки розмірами 2-4 нм (тобто значно менше межі розширення звичайних мікроскопів).
Мінім. розмір виявляються частинок залежить також від інтенсивності освітлення, тому в УМ застосовують сильні джерела світла (ртутні лампи високого тиску).
У 1950-х рр.. Б. В. Дерягин і Г. Я. Власенко розробили потоковий УМ, в к-ром потік рідкого золю або аерозолю рухається по скляній трубці назустріч спостерігачеві. Перетинаючи зону освітлення, що формується сильним джерелом світла з щілинною діафрагмою, частки дають яскраві спалахи, які реєструються візуально або за допомогою фотометричної апаратури
У сучасних потокових УМ (рис. 4) джерелами світла служать лазери. Такі прилади дозволяють досліджувати колоїдні системи кількісно з великою точністю, напр. будувати діаграми розподілу мікрочастинок за розмірами, а також використовуються в гідродинамічних дослідженнях (для спостереження характеру руху рідини чи газу в складних трубопровідних системах). У цих випадках мікрочастинки стандартного розміру спеціально вносять у струмінь рідини або газу, відстежують їх траєкторії, вимірюють швидкість руху на різних ділянках, після чого комп'ютери обробляють результати і будують мат. модель гідродинамічної системи.
Рис. 4. Схема поточного ультрамікроскопа-аналізатора: 1 - лазерний освітлювач; 2 - конденсор; 3 - коліматор; 4 - об'єктив, 5 - проточна кювета; 6-наблюдатеся. мікроскоп; 7 - світловод, 8 - фотоелектронний помножувач; 9-підсилювач-формувач імпульсів; 10 - комп'ютерний аналізатор; 11-графич. дисплей, 12 – пристрій друку; 13 - Графобудівник.
Електронна мікроскопія
Електронні мікроскопи, сукупність електронно-зондових методів дослідження мікроструктури твердих тіл, їх локального складу і мікрополів (електричних, магнітних і ін) за допомогою електронних мікроскопів (ЕМ) - приладів, в яких для отримання збільшення зображень використовують електронний пучок. Електронна мікроскопія включає також методики підготовки досліджуваних об'єктів, обробки та аналізу результуючої інформації. Розрізняють два головні напрями електронної мікроскопії: трансмісійну (просвічує) і растрову (скануючу), заснованих на використанні відповідних типів електронних мікроскопів. Вони дають якісно різну інформацію про об'єкт дослідження і часто застосовуються спільно. Відомі також відбивна, емісійна, оже-електронна, лоренцова та інші види електронної мікроскопії, що реалізуються, як правило, за допомогою приставок до трансмісійних та растрових ЕМ.
Електронний
промінь-направлений пучок
Хроматична аберація - зниження швидкості електронів після просвічування об'єкта, що приводить до погіршення розширення; посилюється зі збільшенням товщини об'єкту і зменшенням напруги. Контрастування (хімічне і фізичне) - обробка досліджуваних зразків для підвищення загального контрасту зображення і (або) виявлення окремих елементів їх структури. Негативне контрастування-обробка мікрочастинок або макромолекул на плівці-підкладці розчинами важких металів (U та ін), в результаті чого частинки будуть видні як світлі плями на темному тлі (на відміну від позитивного контрастування, що робить темними самі частинки). Репліка-тонка, прозора для електронів плівка з полімерного матеріалу або аморфного вуглецю, що повторює мікрорельєф масивного об'єкта або його відколу. Растр - система ліній сканування на поверхні зразка і на екрані ЕПТ.
Трансмісійна мікроскопія
Трансмісійна мікроскопія реалізується за допомогою трансмісійних (просвічують) електронних мікроскопів (ТЕМ; рис. 5), в яких тонкоплівковий об'єкт просвічується пучком прискорених електронів з енергією 50-200 кВ. Електрони потрапляють в систему магнітних лінз, які формують на люмінесцентному екрані (і на фотоплівці) світлопольні зображення внутрішньої структури. При цьому вдається досягти розширення порядку 0,1 нм, що відповідає збільшенням до 1,5 х 106 разів.
Розширення та інформативність ТЕМ-зображень багато в чому визначаються характеристиками об'єкта та у способом його підготовки. При дослідженні тонких плівок і зрізів полімерних матеріалів і біол. тканин контраст зростає пропорційно їх товщині, але одночасно знижується розширення. Тому застосовують дуже тонкі (не більше 0,01 мкм) плівки і зрізи, підвищуючи їх контраст обробкою важких металів (Os, U, Pb тощо), які вибірково взаємодіють. з компонентами мікроструктури. Ультратонкі зрізи полімерних матеріалів (10-100 нм) отримують за допомогою ультрамікротомів, а пористі і волокнисті матеріали попередньо просочують і заливають в епоксидні компаунди. Метали досліджують ультратонкої фольги. Для вивчення форми і розмірів мікрочастинок (мікрокристали, аерозолі, віруси, макромолекули) їх наносять у вигляді суспензій або аерозолів на плівки-підкладки з формвара (полівінілформаль) або аморфного С, проникні для електронного променя, і контрастують методом відтінення або негативного контрастування.
Рис. 5. Схема пристрою трансмісійного електронного мікроскопа: 1 - електронна гармата; 2 - конденсор; 3-зразок; 4, 5 - об'єктив і його діафрагма; 6, 7 - проміжна і проекційна лінзи; 8-оглядове вікно; 9 - люмінесцентний екран; 10 - фотокамера з затвором; 11 - вакуумна система.
Структура гелів, суспензій, емульсій і біол. тканин з великим вмістом води досліджується методами кріореплікаціі: зразки піддають надшвидкому заморожуванню і поміщають у вакуумну установку, де відбувається розколювання об'єкта і осадження на поверхню свіжого відколу плівки. Отримана репліка, що повторює мікрорельєф поверхні відколу, аналізується в ТЕМ. Розроблені також методи, що дозволяють робити ультратонкі зрізи заморожених об'єктів і переносити їх, не розморожуючи, в ТЕМ на кріостолік, який зберігає температуру об'єкта в ході спостереження на рівні -150 °.
Растрова мікроскопія.
У
растрових електронних
Рис. 6. Схема пристрою растрового електронного мікроскопа: 1 - електронна гармата; 2 - конденсор; 3 - відхиляє; 4 - кінцева лінза з коректором астигматизму, 5 - об'єктний столик, 6 - зразок; 7 - вакуумна система, 8 - генератор розгорток; 9 - блок управління збільшенням; 10-селектор сигналів (для вибору реєстрованого вторинного випромінювання); 11-видеоусилитель; 12,13 - ЕЛТ і її відхиляє; BІ1-BІ3 - потоки вторинних випромінювань; C1 - C3 - електричні. сигнали; Д1-Д3 - детектори; ЕЛ1, ЕЛ2 - електронні промені; X, Y - напрямки сканування (рядкова і кадрова розгортки).
Вибір реєстрованого вторинного випромінювання обумовлене завданням дослідження. Основний режим роботи РЕМ - реєстрація вторинних електронів (ВЕ). Оскільки інтенсивність емісії ВЕ сильно залежить від кута падіння електронного променя на поверхню, одержуване зображення дуже близька до звичайного макроскопічного зображення рельєфу об'єкту, що освітлюється з усіх боків розсіяним світлом, інакше кажучи, формується топографічний контраст. Емісія ВЕ відрізняється наиб. інтенсивністю в порівнянні з вторинними випромінюваннями. Крім того, в цьому режимі досягається максимальне розширення.
У технологічних дослідженнях використовується також реєстрація поглинених електронів в поєднанні з додатком робочих напруг до досліджуваного транзистору або інтегральною схемою. Це дозволяє отримувати зображення, що відповідає розподілу елект. потенціалів. При цьому можна переривати первинний електронний промінь з високою частотою і візуалізувати проходження по схемі високочастотних сигналів.
За
допомогою відповідних
Для вивчення структури поверхні за допомогою РЕМ до зразка пред'являється ряд вимог. Перш за все, його поверхня повинна бути електропровідного, щоб виключити перешкоди за рахунок накопичення поверхневого заряду при скануванні. Крім того, потрібно всіляко підвищувати відношення сигнал / шум. Тому перед дослідженням на діелектричну поверхню шляхом вакуумного випаровування або іонного розпилення наносять тонку (15-20 нм) однорідну плівку металу з високим коефіцієнтом вторинної електронної емісії (Au, Au-Pd, Pt-Pd). Біол. об'єкти, що містять, як правило, велика кількість води, перед нанесенням покриття необхідно зафіксувати спец. хім. обробкою і висушити, зберігши природний мікрорельєф поверхне.
Скануюча тунельна мікроскопія
Скануючий тунельний мікроскоп (СТМ, англ. STM - scanning tunneling microscope) - варіант скануючого зондового мікроскопа, призначений для вимірювання рельєфу провідних поверхонь з високим просторовим розширенням. В СТМ гостра металева голка підводиться до зразка на відстань кількох ангстрем. При подачі на голку невеликого потенціалу виникає тунельний струм. Величина цього струму експоненціально залежить від відстані зразок-голка. Типові значення 1-1000 пА при відстанях близько 1 Å. Скануючий тунельний мікроскоп перший з класу скануючих зондових мікроскопів.
У процесі сканування голка рухається уздовж поверхні зразка, тунельний струм підтримується стабільним за рахунок дії зворотного зв'язку, і система змінюється в залежності від топографії поверхні. Такі зміни фіксуються, і на їх основі будується карта висот. Інша методика передбачає рух голки на фіксованій висоті над поверхнею зразка. У цьому випадку фіксується зміна величини тунельного струму і на основі цієї інформації йде побудова топографії поверхні.
Таким
чином скануючий тунельний
зонд (голку),
систему переміщення зонда щодо зразка по 2-м (XY) або 3-м (XYZ) координатах,
реєструючу систему.
Реєструюча система фіксує значення функції, що залежить від величини струму між голкою і зразком, або переміщення голки по осі Z. Зазвичай реєстроване значення обробляється системою негативного зворотного зв'язку, яка керує положенням зразка або зонда по одній з координат (Z). В якості системи зворотного зв'язку найчастіше використовується ПІД-регулятор. Обмеження на використання методу накладаються, по-перше, умовою провідності зразка, по-друге, умовою «глибина канавки повинна бути менше її ширини», тому що в іншому випадку може спостерігатися тунелювання з бічних поверхонь. Але це тільки основні обмеження. Насправді їх набагато більше. Наприклад, технологія заточування голки не може гарантувати одного вістря на кінці голки, а це може призводити до паралельного сканування двох різновисотних ділянок. Технологія грубого зближення також має колосальний вплив на дійсність отриманих результатів.
Атомно-силова мікроскопія
Атомно-силовий мікроскоп був винайдений в 1986 році Герхардом Бінніг, Калвіном Куейтом і Крістофером Гербером на основі ідей, закладених Герхардом Бінніг і Хайнріхом Рорером (Нобелівська премія з фізики, 1986 рік). За допомогою атомно-силового мікроскопа можна одержувати зображення як фізичних об'єктів (поверхні твердих тіл, рис.7), так і біологічних і хімічних об'єктів (вірусів і бактерій, атомів і молекул). Розширення таких мікроскопів досягає частки нанометрів, що дозволяє спостерігати атоми. Отриманням зображень не обмежуються можливості цього приладу. За допомогою атомно-силового мікроскопа можна вивчати взаємодію двох об'єктів: вимірювати сили тертя, пружності, адгезії, а також переміщати окремі атоми, осаджувати і видаляти їх з будь-якої поверхні.
Рис.7 Атомна структура поверхні високоорієнтивані пиролитического графіту. Розмір зображення 17х17х2 Å3
Атомно-силова мікроскопія - вид зондової мікроскопії, в основі якого лежить силове взаємодія атомів (строго кажучи обмінна взаємодія атомів зонда і досліджуваного зразка).
Розглянемо докладніше, які сили діють між зондом і досліджуваною поверхнею. Для початку звернемося до взаємодії двох атомів (молекул).
На
невеликих відстанях всі атоми
і молекули притягуються. Це тяжіння
має чисто квантову природу. Воно
пов'язане з корельованим, тобто
узгодженими коливаннями
Силу
взаємодії зонда із зразком можна
отримати, якщо підсумувати всі такі
елементарні взаємодії для
Рис. 8 Зонд і зразок
Для того, щоб "відчути" дану взаємодія атома з атомом, необхідно, щоб зонд був атомних розмірів. Реальні зонди мають розміри від десятка нанометрів до розміру одного атома. Їх довжина становить 1-2 мкм.

- Микроскопия. Методы микроскопии
- Микроследы и микрочастицы в расследовании преступлений
- Микросоциологические парадигмы
- Микросоциологические теории
- Микросреда фирмы
- Микроструктура металлов
- Микроструктура нервной ткани. Виды нервных клеток, их строение и функции
- Микрорайон Иртышский
- Микросклимат
- Микроскоп
- Микроскоп
- Микроскопические грибы как продуценты БАВ
- Микроскопический анализ металла
- Микроскопический подкожный клещ Demodex folliculorum