Определение АОА в различных пищевых продуктах амперометрическим методом

МИНОБРНАУКИ РОССИИ

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение

высшего профессионального образования

«Казанский национальный исследовательский технологический университет»

(ФГБОУ ВПО КНИТУ)

Кафедра пищевой биотехнологии

 

 

 

Учебно-исследовательская работа

по дисциплине « Физико-химические методы анализа биологически активных веществ»

на тему «Определение АОА в различных пищевых продуктах амперометрическим методом»

 

 

 

 

 

Выполнили:

студенты группы 621-111

Артамонов А.А.,

Левашова Л.Т.,

Муртазин А.Р.

Проверила:

канд. х. н.,  доц.

Хабибрахманова В.Р.

 

 

Казань 2013г.

 

 

 

 

Содержание

 

Введение………………………………………………………………………...3-4

1.Методы определения  антиоксидантной активности………………………5-7

2.Устройство и принцип работы прибора Цвет Яуза-01-АА………………7-11

3.Подготовка к выполнению измерений ………………………………………12

3.1.Подготовка посуды …………………………………………………………12

3.2.Приготовление растворов………….……………………………………….12

3.2.1.Получение бидистиллированной  воды…………………………………..12

3.2.2.Приготовление раствора гидроксида натрия……………………………12

3.2.3.Приготовление исходного раствора  кверцетина ……………………12-13

3.2.4.Приготовление раствора кверцетина…………………………………….13

3.2.5.Приготовление градуировочных  растворов кверцетина ……………....13

3.2.6. Приготовление раствора ортофосфорной кислоты …………………....13

3.3.Подготовка прибора и его градуировка ……………….……………….14-15

4.Пробоподготовка объектов исследования и определение в них АОА.........16

4.1.Определение АОА в чае…………..…………..…………..………...…...16-19

4.2.Определение АОА в БАДах…………..…………..…………..……...….19-21

4.3.Определение АОА в лекарственных препаратах…………..……….…21-23

5.Нормы потребления антиоксидантов………………………………….....23-26

6.Биодоступность АОА…………………………………………………...…26-28

Заключение………………………………………………………………...…29-30

Список использованной литературы………………………………………..….31

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Введение

   Исследования, выполненные  в разных странах в последние  десятилетия, подтверждают, что одной  из основных причин патологических  изменений в человеческом организме, приводящих к преждевременному  старению и развитию многих болезней (более 100), в том числе самых опасных, таких как сердечно-сосудистые и онкологические заболевания, является избыточное содержание в биологических жидкостях свободных кислородных радикалов (супероксид-анион, гидроксильный радикал, пергидроксильный радикал и др.).

   Постоянное повышенное  содержание в межклеточных и  внутриклеточных биологических  жидкостях свободных радикалов  создает условия для развития  оксидантного стресса, выражающегося  с биохимической точки зрения  в том, что свободные радикалы окисляют стенки сосудов, белки, ДНК, липиды. Радикалы особенно активно взаимодействуют с мембранными липидами, содержащими ненасыщенные связи, и изменяют свойства клеточных мембран.         Наиболее активные свободные радикалы способны разрывать связи в молекуле ДНК, повреждать генетический аппарат клеток, регулирующий их рост, что приводит к онкологическим заболеваниям. Липопротеиды низкой плотности после окисления могут откладываться на стенках сосудов, что вызывает развитие атеросклероза и сердечнососудистых заболеваний.

   От воздействия  свободных радикалов здоровый  организм защищает естественная  антиоксидантная система, содержащая  ферментные и неферментные вещества, способные полностью нейтрализовать  вредное воздействие радикальных  форм кислорода.

Снижение активности естественной антиоксидантной системы человека и, следовательно, возрастание концентрации свободных радикалов в организме связано со многими неблагоприятными факторами: это радиоактивное и ультрафиолетовое облучение, ухудшение экологической обстановки, широкое распространение социальных заболеваний (алкоголизм, курение, наркомания), постоянные стрессы, потребление загрязненной пищи, неконтролируемый прием некоторых лекарственных препаратов.

   Вредное воздействие  свободных радикалов в случае

оксидантного стресса можно уменьшить за счет регулярного употребления определенных пищевых продуктов и напитков, лекарственных препаратов, биологически активных добавок (БАД), обладающих антиоксидантной активностью.

   Основные природные  антиоксиданты — флавоноиды, ароматические гидрооксикислоты, антоцианы, витамины С и Е, каротиноиды и др.

Исключительное значение имеют антоцианы, так как благодаря заряду на атоме кислорода в кольце антоцианидины и антоцианины легче проникают через мембраны клеток.

   В последние десятилетие  на первый план выходят биофлавоноиды, обладающие антиканцерогенными, антисклеротическими, противовоспалительными и антиаллергическими  свойствами и по антиоксидантной  активности в десятки раз превосходящие  витамины Е, С

и β - каротин. Особенно эффективно сочетание биофлавоноидов, содержащихся в овощах, ягодах, фруктах, зернах, семенах, орехах и пр. Рекомендуемые уровни потребления некоторых флавоноидов приняты в РФ в 2004 году(суммарно в пределах 350—1300 мг/сут., рекомендуемые нормы в других странах 800— 1000 мг/сут.).

   Полезные свойства  природных антиоксидантов убедительно  подтверждаются особенностью питания  жителей Средиземноморского региона, употребляющих в пищу большое  количество продуктов с высокой  антиоксидантной активностью. Именно поэтому в странах этого региона отмечается сравнительно низкий уровень сердечнососудистых и онкологических заболеваний.

Отметим, что во многих странах разрабатываются программы антиоксидантной защиты населения, программы функционального питания, пищи как лекарства.

 

 

1.Методы определения антиоксидантной активности

   Природные антиоксиданты  широко используются для лечения  в клиниках и в оздоровительных  центрах, они включены в программы  диетического питания.

   В рекламе на  БАДы обычно указывается, что они обладают высокой антиоксидантной активностью, хотя в подавляющем большинстве случаев это утверждение ничем не подкрепляется. Содержание антиоксидантов в пищевых продуктах, напитках, БАДах, как правило, неизвестно. Поэтому измерение и контроль содержания антиоксидантов — актуальная аналитическая задача, имеющая социально-здравоохранительное значение.

   За прошедшее десятилетие  разработано много методов определения  антиоксидантной активности, предложены  новые реагенты, созданы модельные  системы и приборы аналитического контроля.

   В основе методов  определения антиоксидантной активности  чаще всего лежат принципы  прямого или косвенного измерения  скорости или полноты реакции  антиоксидантов с соответствующими  реагентами.

   Можно выделить  три типа методов в зависимости от того, какой регистрируется процесс:

— потребление кислорода;

— образование продуктов окисления;

— поглощение (или связывание) свободных радикалов.

   В первом и втором  случаях антиоксидантная активность  определяется по ингибированию скорости потребления реагента или образования продуктов реакции окисления. В этих методах антиоксидантная активность есть функция многих параметров, в частности, природы

исследуемого вещества, концентрации антиоксиданта и других соединений, времени, температуры и т.д. Поэтому данные одних методов обычно не коррелируют с данными других методов.

   Для количественного  определения антиоксидантов наиболее  надежным представляется амперометрический  метод. Амперометрический метод  анализа — единственный метод, который позволяет непосредственно измерить содержание всех антиоксидантов в пробе.

Другие методы — непрямые, в них оценивается ингибирование реакционных смесей (в частности, свободных радикалов), генерированных в ходе реакций.

   Амперометрический  метод основан на измерении

электрического тока, возникающего при электрохимическом окислении исследуемого вещества (или смеси веществ) на поверхности рабочего электрода при определенном его потенциале. В условиях амперометрического детектирования хорошо окисляются соединения, содержащие гидроксильные группы, предел их обнаружения лежит в интервале — г, в благоприятных

условиях некоторые соединения определяются на уровне  
г. Основные и наиболее активные природные антиоксиданты имеют фенольную природу (природные полифенолы, разные типы флавоноидов, фенольные гидрооксикислоты, витамины и др.). Таким образом, амперометрический метод наиболее пригоден для оценки антиоксидантной активности.

   Антиоксидантную  активность трудно измерить по отношению к свободным радикалам непосредственно in vivo(«внутри клетки»), поэтому действие антиоксидантов оценивается степенью их окисления in vitro(«вне живого организма»).

   Чувствительность  амперометрического метода определяется  природой рабочего электрода и приложенным к нему потенциалом. Материалом для рабочего электрода обычно служит стеклоуглерод.

   Электрохимическое  окисление может быть использовано  при измерении интенсивности  поглощения свободных радикалов, выделяющихся,например, в результате  следующих процессов :

флавоноид-О-Н ->флавоноид-О· + е– + Н+

(окисление при максимальном  потенциале)

флавоноид-О-Н ->флавоноид-О· + Н·

(улавливание свободным  радикалом)

Таким образом, способность к захвату свободных радикалов флавоноидами или другими полифенолами (т.е. их антиоксидантная активность) может измеряться величиной окисляемости этих соединений на рабочем электроде амперометрического детектора.

   Как известно, амперометрический  метод детектирования обладает  рядом преимуществ. Это низкий  предел обнаружения, высокая селективность (определяются только соединения, молекулы которых могут окисляться, другие соединения, присутствующие даже в больших концентрациях не определяются), малый объем электрохимической ячейки (0,1—5 мкл), простота обслуживания.

 

2.Прибор Цвет Яуза-01-АА для суммарного определения антиоксидантов

   Прибор Цвет Яуза-01-АА (первоначальное название Цвет Яуза-АА-01), предназначен для прямого количественного измерения содержания антиоксидантов в пробах анализируемых продуктов и напитков (рис. 1).

   Функциональная схема прибора (рис. 2) включает емкость для растворителя, насос, дозатор, выполненный в виде многоходового крана, амперометрический детектор, представляющий собой термостатируемую электрохимическую ячейку со сменными рабочими электродами, усилитель тока, аналого-цифровой преобразователь и устройство регистрации выходного сигнала.

Амперометрический детектор может функционировать в трех режимах: при постоянном потенциале, при импульсных потенциалах и при сканировании

потенциалов во всем диапазоне. Варьируя полярность электродов и величины приложенных потенциалов, можно определять не только суммарную антиоксидантную активность, но и активность отдельных классов биологических соединений.

   Прибор работает  следующим образом. Насос непрерывно прокачивает растворитель через всю систему. При положении крана-дозатора «Ввод пробы» исследуемый раствор с помощью стандартного шприца (1 см3) подается в дозируемую петлю. Поворотом ручки крана в положение «Анализ» поток растворителя направляет определенную дозу исследуемого вещества в ячейку детектора. В результате окисления исследуемого вещества на поверхности рабочего электрода возрастает электрический ток, протекающий между двумя электродами. Возникающие электрические токи очень малы, в пределах  
— А. Эти аналоговые сигналы усиливаются, а затем с помощью аналого-цифрового преобразователя преобразуются в цифровой сигнал, который регистрируется на дисплее компьютера (рис.3).

   Рабочий электрод выполнен из стеклоуглерода — наиболее универсального материала для определения полифенольных соединений. Потенциал на электродах можно варьировать от 0 до 2 В, потенциалы ионизации фенольных соединений изменяются в пределах 100—

1000 мВ.

   Перед началом  работ в день выполнения измерений проводят градуировку прибора. Для исключения случайных результатов и усреднения данных выполняют пять последовательных измерений для каждого из пяти градуировочных растворов кверцетина (природный антиоксидант из группы флавонолов). За результат принимают среднее арифметическое значение из пяти измерений (относительное среднее квадратичное отклонение не более 5%). По полученным данным строят градуировочную характеристику (рис. 4)

Y = aХ + b

где X — концентрация кверцетина, мг/л; Y — сигнал кверцетина (площадь пика).

В табл. 1—5 приведены результаты измерений содержания антиоксидантов в ягодах, фруктах, овощах, напитках, выполненных на приборе Цвет Яуза-01-АА (стандарт кверцетин).

 

 

3.Подготовка к выполнению измерений

При подготовке к выполнению измерений выполняются следующие работы: подготовка посуды, приготовление растворов, подготовка прибора «Цвет Яуза-01-АА» к работе и его градуировка.

3.1. Подготовка  посуды

Новую и загрязненную стеклянную посуду тщательно промываем растворов хромовой смеси, приготовленной по ГОСТу 4517-87. После этого многократно всполаскиваем посуду проточной водой, а затем дистиллированной водой. Окончательно посуду трижды ополаскиваем бидистиллированной водой. К (удельная электропроводность) промывной воды после последней пробы не должна превышать К более, чем на 5% исходной бидистиллированной воды.

3.2. Приготовление растворов

3.2.1.Получение бидистиллированной  воды

Бидистиллированную воду получают с помощью стеклянного бидистиллятора в соответствии с руководством по эксплуатации. Контроль качества бидистиллированной воды проводят с помощью кондуктометра. Удельная электропроводимость бидистиллированной воды должна быть не более 5 мкСм/см.

3.2.2.Приготовление раствора  гидроксида натрия с молярной  концентрацией 0,1 моль/дм3

На аналитических весах взвешивают 1,00г гидроксида натрия и количественно переносят с помощью свежекипяченой и охлажденной бидистилированной воды в мерную колбу вместимостью 250 см3. Доводят объем до метки бидистилированной водой и тщательно перемешивают.

Срок хранения - 3 месяца.

3.2.3.Приготовление исходного  раствора кверцетина с массовой  концентрацией 1 г/дм3

На аналитических весах в стаканчике взвешивают (0,0570± 0,0001) г кверцетина, добавляют туда приблизительно 30 см3 бидистиллированной воды и подщелачивают раствором гидроксида натрия с молярной концентрацией 0,1 моль/дм3 до растворения кверцетина (рН раствора 9,5±0,2). После растворения кверцетина содержимое стаканчика количественно переносят в мерную колбу вместимостью 50 см3, доводят объем до метки бидистиллированной водой и тщательно перемешивают.

Срок хранения раствора в холодильнике -1 месяц при температуре (4 ± 1) °С.

3.2.4.Приготовление раствора  кверцетина с массовой концентрацией 100мг/дм3

В мерную колбу вместимостью 10 см3 пипеточным дозатором вводят 1 см3 исходного раствора кверцетина, доводят объем до метки бидистиллированной водой и тщательно перемешивают.

Раствор готовят непосредственно перед градуировкой.

3.2.5.Приготовление градуировочных  растворов кверцетина с массовой  концентрацией 0,2; 0,5; 1,0; 2,0; 4,0 мг/дм3

В мерные колбы вместимостью 10 см3 пипеточным дозатором вводят 20, 50, 100, 200,400 мм3 раствора кверцетина с массовой концентрацией 100 мг/дм3, доводят объем до метки бидистиллированной водой и тщательно перемешивают.

/

Градуировочные растворы кверцетина готовят каждый раз при градуировке.

Погрешность приготовления градуировочных растворов не должна превышать (±2,5) %.

3.2.6. Приготовление раствора ортофосфорной кислоты с молярной концентрацией 0,0022 моль/дм3 (элюент)

В мерную колбу вместимостью 1000 см3 наливают приблизительно 700 см3 бидистиллированной воды, добавляют пипеточным дозатором 150 мм3 концентрированной ортофосфорной кислоты, доводят до метки бидистиллированной водой и тщательно перемешивают.

Раствор хранят в вытяжном шкафу в колбе с притертой пробкой, срок хранения 2 недели.

3.3.Подготовка прибора и его градуировка по кверцетину

Установку, включение и подготовку анализатора и регистрирующего устройства осуществляют в соответствии с руководством по эксплуатации.

Устанавливают следующие параметры работы прибора:

-постоянно-токовый режим - АДп.т.

-потенциал рабочего электрода (Up) - (+)1,3 В.

Скорость подачи элюента (раствор ортофосфорной кислоты с молярной концентрацией 0,0022 моль/дм3) перистальтическим насосом -1,2см3/ мин.

Включают перистальтический насос кнопкой «пуск» и прокачивают элюент через амперометрическую ячейку до установления постоянного фонового тока, который должен быть не выше 300 нА. При достижении постоянного фонового тока - прибор готов к работе.

В положении «ВВОД» крана дозатора с помощью шприца вместимостью 1 см3 промывают петлю дозатора бидистиллированной водой, а затем анализируемым раствором. После ввода 1 см3 анализируемого раствора в петлю дозатора кран поворачивают в положение «АНАЛИЗ».

Возникающие на электроде электрические токи преобразуются в цифровой сигнал, который регистрируется процессорным блоком и отображается в виде пиков на мониторе. При снижении тока до фонового значения, кран дозатора переводят в положение<<ВВОД» и вводят следующую пробу.

Для построения градуировочного графика кверцетина последовательно регистрируют сигналы градуировочных растворов кверцетина, приготовленных по 3.2.5, в порядке возрастания их концентрации.

Для построения градуировочного графика с целью исключения случайных результатов и усреднения данных проводят по 5  последовательных измерений каждого из пяти градуировочных растворов кверцетина. За результат принимают среднее арифметическое значение из 5 измерений (относительное СКО не более 5 %), По полученным данным строят градуировочный график, который описывается уравнением Y = аХ + b.

В координатах: X - массовая концентрация кверцетина, мг/дм3;

Y - сигнал кверцетина (площадь пика), нА С/

Градуировку выполняют перед началом работ в день выполнения измерений.

Таблица 3.3. Результаты измерений

№ колбы	Концентрация кверцетина, мг/л	Сигнал кверцетина, нА.с
1	0,2	802,8985
2	0,5	948,1523
3	1,0	1723,4886
4	2,0	3422,6976
5	4,0	6154,0043

По полученным значениям из таблица 3.3 строим градуировочный график в координатах: сигнал кверцетина, нА.с – концентрация кверцетина, мг/л ( рис.3.3).

Рис.3.3Градуировочный график 

 

4.Пробоподготовка объектов исследования и определение в них АОА.

Объекты исследования: чай «Акбар», БАД «Черника Форте», лекарственный препарат «Листья Шалфея».

4.1.Определение АОА в чае

В качестве объекта исследования мы выбрали чай «Аkbar», в его состав входят: дубильные вещества ( катехины, галловая кислота и др.), алкалоиды ( кофеин, теофиллин, теобромин, ксантин, аденин и др. органические основания), флавоноиды ( кверцетин, рутин, кемпферол и др.).

Для приготовления пробы чая  точную навеску сухого чая (около 1 г) помещаем в стаканчик вместимостью 100 см3, добавляем туда 100 см3 кипящей бидистиллированной воды, перемешиваем в течение 5 минут. После этого раствор фильтруем через бумажный фильтр, охлаждаем и разбавляем бидистиллированной водой. Затем делаем разведение: берем 10 мкл анализируемого раствора и переливаем в колбу емкостью 10 мл, объем доводим до метки бидистиллированной водой. Затем с помощью шприца берем полученный раствор и вводим в петлю дозатора, при этом возникающие токи усиливаются и отображаются на мониторе в виде следующих пиков (Рис.4.1).

 

 

 

 

 

 

Рис.4.1. Хроматограмма исследуемого образца

Полученные данные заносим в таблицу 4.1.

 

Таблица 4.1.Опытные значения

№колбы	Сигнал кверцетина, нА.с
1	2025,74358
2	2028,35547
3	2056,83480

Проводим статистическую обработку и вычисляем среднее значение сигнала кверцетина в данном образце, находим массовую долю антиоксидантов и сравниваем с табличным значением (ССА= 51,0 мг/г)

Si: 2025,74358; 2028,35547; 2056,83480,нА.с

Q1= =0,084         Qn= =0,916

Qтабл=0, 94 (при n=3 и P=0,90)

0,084‹0,94 и 0,916‹0,94, отсюда следует, что грубых промахов нет.

= (2025, 74358+2028, 35547+2056, 83480)/3=2036, 978

Таблица отклонений:

Si	Δ Si= Si-	Δ Si²
2025,74358	-11,23442	126,21
2028,35547	-8,62253	74,348
2056,83480	19,8568	394,2925

                     ∑ Δ Si²=126,21+74,348+394,2925=594,8505

s=  =17,246

Δ = =29,075

 ± Δ =2036, 978 ±29,075                             =  =0,846%

Итоговая таблица:

Si	2025,74358, 2028,35547; 2056,83480
n	3
	=2036, 978
s	17,246
Δ	29,075
± Δ	2036, 978 ±29,075
	0,846

По формуле y = 1317,7x - 1342,8 и используя среднее значение сигнала кверцетина находим массовую концентрацию антиоксидантов, эквивалентную кверцетину, полученного по градуировочному графику: 2036,978=1317,7х-1342,8 ;

х = (2036,978+1342,8)/1317,7=2,565мг/л – концентрация антиоксидантов, эквивалентная кверцетину, в анализируемом образце.

Расчет массовой доли антиоксидантов проводим по формуле: X= ,

где - массовая концентрация антиоксидантов, найденная по градуировочному графику, мг/л

- объем раствора анализируемой  пробы, мл

N- кратность разбавления анализируемого вещества

- навеска анализируемого  вещества, г

Х= =25,65мг/г - массовая доля антиоксидантов в исследуемом образце.

В нашем образце значение содержания антиоксидантов (ССА=25,65мг/г) оказалось  меньше, чем табличное (ССА=51,0 мг/г).  Это связано с тем, что наш образец чая был сделан из менее качественного сырья. Также на качество чая могли повлиять: нарушения в технологии переработки, хранения и упаковывания, а также природные факторы (влажность, температура, время сбора).

4.2.Определение АОА в БАДах

В качестве объекта исследования мы взяли БАД «Черника Форте», в состав которого входят: Цинка лактат (молочнокислая форма цинка), витамин С, экстракт черники, витамин Р (рутин, кверцетин), витамин В2, витамин В6, витамин В1.

Твердый образец БАД растираем в ступке.  Точную навеску измельченной пробы (1г) помещаем в коническую колбу вместимостью 100 см3, добавляем приблизительно 70 см3 бидистиллированной воды и встряхиваем в течение одного часа на перемешивающем устройстве. Пробу фильтруем  через бумажный фильтр в мерную колбу вместимостью 100 см3, промываем фильтр бидистиллированной водой и доводят объем фильтрата до метки бидистиллированной водой. В случае необходимости пробу разбавляем бидистиллированной водой. Затем делаем разведение: берем 10 мкл анализируемого раствора и переливаем в колбу емкостью 10 мл, объем доводим до метки бидистиллированной водой. Затем с помощью шприца берем полученный раствор и вводим в петлю дозатора, при этом возникающие токи усиливаются и отображаются на мониторе в виде следующих пиков (Рис.4.2).

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Рис.4.2. Хроматограмма исследуемого образца.

На хроматограмме видны пики разной высоты, это говорит о наличии в образце разных веществ (антоцианов), которые окисляются на поверхности рабочего электрода по-разному.

Полученные данные заносим в таблицу 4.2.

Таблица 4.2.Опытные значения

№колбы	Сигнал кверцетина, нА.с
1	758,68224
2	1271,23183