Министерство  образования и науки Российской Федерации

федеральное государственное бюджетное образовательное  учреждение

высшего профессионального образования

Пермский  национальный исследовательский  политехнический  университет

Кафедра химии и биотехнологии 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

Реферат на тему: Постферментационное  выделение продуктов. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

Выполнила студентка гр.ХТБмП-06 Кетова Ю.

Проверила преподаватель

Портнова  А.. 
 
 
 
 
 
 

Пермь, 2011

Содержание:

Введение

    В сфере производства биотехнологические процессы резко отличаются от химических процессов. В первую очередь отличие  заключается в том, что в биотехнологии  используют более сложную организацию  материи – биологическую, в частности клетки микроорганизмов, тканевые культуры животных и растений, а так же ферменты и др [1].

    Основными элементами, слагающими биотехнологические процессы, являются: биологический  агент (например,микробная культура клеток, отобранная при соблюдении принципа технологичности штамма, т.е. способная сохранять свою морфологию и биохимические свойства в процессе ферментации), субстрат, аппаратура и продукт [2].

    Биотехнологические  процессы можно подразделить на биологические (основаны на использовании эукариот и прокариот), биохимические (использование ферментов) и биоаналогичные (химический синтез веществ близких по структуре к клеточным метаболитам).

    Цель  данной работы рассмотреть стадии биотехнологического  процесса, рассмотреть постферментативное выделение продуктов.

Стадии биотехнологического  процесса

      Любой биотехнологический процесс включает в себя три основных стадии: предферментационную, ферментационную и постферментационную. Схема реализации биотехнологических процессов представлена на рис.1.

     Предферментативная  стадия включает в себя все процессы связанные с хранением и подготовкой  культуры продуцента (инокулята), приготовлением питательных сред, ферментационной  аппаратуры, подготовка воды и воздуха. Большое внимание на этой стадии обращается поддержанию и подготовке чистой культуры. Промышленной штамм должен удовлетворять следующим основным характеристикам:

• стабильность морфологических признаков, физиологической активности при производстве;
• повышенная скорость роста и биосинтеза;
• широкий диапазон устойчивости к воздействию неблагоприятных внешних факторов (рН, температура, перемешивание);
• умеренная требовательность к источникам питания;

    При формировании иннокулята используют принцип  масштабирования, наращивая биомассу начиная с малых объемов колб и заканчивая серией последовательных ферментеров.

    Далее следует ферментационная стадия [1]. Процесс ферментации – процесс, осуществляемый с помощью культивирования микроорганизмов, в ходе которого происходит взаимодействие продуцента с субстратом и образование целевых продуктов.  Стадия осуществляется в биохимическом реакторе и может сопровождаться процессами:

• биотрансформации (изменение структурной формулы под действием ферментативной активности клеток микроорганизмов или готовых ферментов),
• биокатализа (химические превращения протекающие с использованием биокатализаторов-ферментов),
• биоокисление (потребление загрязняющих веществ или  ассоциации микроорганизмов в аробных условиях),
• брожение,
• биокомпостирование (снижение содержания вредных органических веществ ассоциацией микроорганизмов в твердых отходах,
• биосорбция (сорбция вредных примесей из газов или жидкостей с помощью микроорганизмов),
• бактериальное выщелачивание (процесс растворения нерастворимых в воде соединений металлов в растворенное состояние под действием специальных микроорганизмов),
• биодеградация (деструкция вредных соединений) [3].

    В ходе периодической ферментации  выращиваемая культура проходит ряд  последовательных стадий: лаг-фазу, экспоненциальную, замедления роста, стационарную и отмирания. Целевые продукты образуются в экспоненциальной фазе (первичные метаболиты – ферменты, аминокислоты, витамины) и стационарной (вторичные метаболиты – антибиотики, алкалоиды., гормоны, токсины). Для оптимизации процесса и получения максимального выхода используют принцип дифференцированных режимов культивирования.

    Непрерывная ферментация биообъектов осуществляется в условиях установившегося режима, когда микробная популяция и ее продукты жизнедеятельности однородны.

    В ходе ферментации образуются сложные смеси, содержащие клетки, внеклеточные метаболиты, остаточные концентрации исходного субстрата. При этом целевые продукты находятся в небольших концентрациях и многие из них являются неустойчивыми соединениями. Все это накладывает ограничения на последующие стации извлечения и очистки целевого продукта в постферментационной стадии [1].

Постферментационная стадия биотехнологического  процесса

    В постферментационную стадию осуществляется получение готовой товарной продукции, обехвредивание отходов и побочных продуктов [1].

    Культуральная жидкость,  образующаяся  в  процессе ферментации, представляет собой сложную многофазную систему: в водной фазе содержатся клетки продуцента, продукты их жизнедеятельности, непотребленные компоненты питательной среды, мельчайшие капельки жира пузырьки воздуха[1].

    Ассортимент продуктов, получаемых биотехнологическими  методами, разнообразен. По объемам  производства на первом месте стоят  продукты, получаемые с помощью микроорганизмов. Эти продукты подразделяются на три группы:

• биомасса, которая может являться целевым продуктом (белок одноклетчных) или использоваться в качестве биологического агента (биометаногенез, бактериальное вышелачивание металлов);
• первичные метаболиты – низкомолекулярные соединения, необходимые  для  роста  микроорганизмов  в качестве  строительных блоков макромолекул, коферментов (аминокислоты, витамины, органические кислоты);
• вторичные  метаболиты (идиолиты) –  это  соединения,  не требующиеся для роста микроорганизмов и не связанные с их ростом (антибиотики, алкалоиды, гормоны роста и токсины).

    В связи с развитием новейших методов  биотехнологии (инженерной энзимологии, клеточной и генной инженерии) спекктор целевых продуктов непрерывно дополняется. Среди  них  все  большее  место занимают  средства  диагностики  и  лечения (моноклональные антитела, вакцины и сыворотки, гормоны, модифицированные антибиотики) [2]. 

Разделение  фаз культуральной жидкости

     В зависимости  от целевого назначения конечного продукта (для здравоохранения, технических целей, сельского хозяйства и т. д.), локализации конечного продукта (клетка или культуральная жидкость) и его природы на постферментационной стадии применяют различную аппаратуру,  методы выделения и очистки (рис. 2).  Наиболее  трудоемко выделение продукта, накапливающегося в клетках [1]. 

    Чаще  всего целевой продукт находится  либо в самой биомассе, либо в  жидкости. В обоих случаях необходимо сначала разделить фазы. В зависимости  от свойств биомассы и жидкости для  этих целей могут бть использованы различные процессы.

• отстаивание (разделение под действием сил гравитации);
• фильтрация (пропускание суспензии через пористый материал, на котором задерживаются биомассы);
• сепарация, центрифугирование (разделение под действием центробежных сил);
• микрофильтрация, ультрафильтрация (пропускание суспензии через мембраны с малым размером пор, получение раствора, свободного от взвешенных частиц);
• коагуляция (добавление в суспензию реагентов, способствующие образованию клеточных агломератов, которые отделяют путем отстаивания);
• флотация (захват биомассы микроорганизмов пузырьками пены и выделение ее из пенной фракции) [3].

Методы  дезинтеграции биомассы

    Для извлечения целевых продуктов, находящихся  внутри клетки микроорганизма или при  получении из тканей животных или  растений, необходимо прежде всего  осуществить дезинтеграцию клеточной  биомассы. Эту процедуру осуществляют физическими, химическими и ферментативными методами.

    Среди физических методов часто используют:

• Баллистические методы. Суть метода заключается в том, что биомассу подвергают воздействию удара или истирания. Ее помещают в цилиндрический барабан,  вращающийся вокруг оси и наполненный шариками из тяжелого твердого материала (металл или фарфор). При вращении барабана шарики перекатываются и ударяют по агломератам биомассы, причем удары происходят достаточно часто и в разных направлениях. Это приводит к разрушению клеточных стенок и получению однородного вязкого раствора,  в  которомнаходится содержимое клеток.
• Экструзия.  Сущность этого метода заключается в том,  что суспензию клеточной массы под высоким давлением продавливают через узкое отверстие в камеру с нормальным давлением.  При  этом  из-за  большого перепада давления вода,  которая  попала  в  клетки,  быстро  выходит  из них и при этом разрушает клеточную стенку.
• Действие ультразвукового поля. При этом клетки испытывают попеременные сжатия и растяжения,  скручивание в различных направлениях, что, в конце концов, приводит к разрыву клеточной стенки и ее разрушению [1].

    К химическим методам разрушения клеток относят:

• Гидролиз (разрушение оболочек клеток под действием химических реагентов и температуры);

    Среди ферментативных методов разрушения клеток выделяют:

• Ферментолиз (разрушение клеточных оболочек под действием ферментов при повышенной температуре);
• Автолиз (использование собственных ферментов клетки для ее разрушения).

Выделение целевого продукта

    После проведения предварительной операции по разрушению клеток, необходимо выделить целевой продукт из полученного раствора. Сушествует несколько подходов к фракционированию смесей:

• Солевое фракционирование основано на различии растворимости продукта в солевых растворах различной концентрации.  Обычно  для этих целей применяют сульфаты, фосфаты натрия, калия и аммония.
• Фракционирование путем добавления органических растворителей, постепенно увеличивая их концентрацию. Чаще всего в качестве осадителей используют этанол и ацетон. Можно  также применять метанол, изопропанол, диоксан,  этилацетат и др.
• Фракционирование с использованием нейтральных высокомолекулярных соединений. Растворы полимеров обычно имеют повышенную вязкость, поэтому для целей фракционирования используют полимеры, образующие растворы с минимальной вязкостью.  Среди таковых наиболее удобными оказались полиэтиленгликоли. В случае полимеров определенные проблемы возникают при их отделении от целевых белков.  Обычно  это  осуществляется  с  помощью гель-фильтрации на молекулярных ситах либо путем осаждения белка из раствора солью так,  чтобы  полимер  при  этом остался в растворе [1].

    Кроме этого используют такие методы выделения  целевого продукта как:

• Адсорбция (перевод растворенного в жидкости продукта в твердую фазу путем его сорбции на твердых носителях);
• Ионный обмен (перевод в твердую фазу ионов и примесей путем сорбции на твердом носителе);
• Отгонка, ректификация (для легкокипящих компонентов смеси);
• Ультрафильтрация, нанофильтрация и обратный осмос (для выделения высокомолекулярных соединений – белом, полипептидов и полинуклеотидов);
• Центрифугирование, ультрацентрифугирование (используют для выделения вирусов, клеточных органелл, высокомолекулярных соединений) [3].

Очистка продукта

    Рассмотренными  методами можно получить относительно грубо очищенные препараты. Для многих целей такой очистки оказывается достаточно и этим следует пользоваться,  так как простые по  технологии процедуры с использованием дешевых реагентов приводят к получению препаратов с низкой себестоимостью. Однако иногда возникает необходимость получения высокоочищенных препаратов (например, получение продуктов для применения в медицине в качестве лекарственных или диагностических средств,  а также для исследовательских целей в области молекулярной биологии, биохимии, биоорганической химии и т. д.) [1].

    Процесс может быть разделен условно на три  фазы (рис.3): стадии 1 и 2 – грубое фракционирование, стадии 3 и 4 – основная очистка, стадия 5 – финишная очистка.

     Грубое фракционирование обычно включает разрушение клеточной массы и отделение целевого продукта (например,  белка)  от  остальных компонентов экстракта (нуклеиновых кислот, полисахаридов, липидов).

     Вторая фаза очистки обеспечивает отделение  целевого продукта от основной массы компонентов той же природы (в  нашем  случае –  белков).  Здесь используются наиболее существенные отличия в физико-химических свойствах целевого продукта от остальных белковых компонентов разделяемой смеси. За счет этих различий и достигается очистка.

    На  последней фазе, в которую вступает  зачастую почти индивидуальный в химическом смысле целевой продукт, осуществляется  его отделение от микропримесей других компонентов, близких по свойствам к целевому продукту. Очевидно, что и на этой стадии существенного обогащения продукта также не достигается, однако очень часто процедуры, используемые на этом этапе процесса самым существенным образом сказываются на качестве продукта [1].

    Эта задача решается с помощью разнообразных  процессов: экстракция, адсорбция, ионный обмен, ультрафильтрация, обратный осмос, ректификации. Помимо этого:

• Хроматография (процесс, при котором на твердом сорбенте собираются растворенные вещества, например, смеси белков, нуклеотидов, сахаров, антибиотиков, при хроматографии они входят из сорбента по очереди, что позволяет их разделять друг от друга);
• Диализ (процесс, при котором через полупроницаемую перегородку могут переходить низкомолекулярные  вещества, а высокомолекулярные остаются, таким способом чистят вакцины и ферментов от солей и низкомолекулярных примесей);
• Кристаллизация (движущая сила процесса – разная растворимость веществ при разных температурах, таким образом, получают кристаллы пенициллина при постепенном охлаждении раствора);

    После получения чистого целевого продукта, производят процесс его концентрирования путем выпаривания, сушки, осаждения, кристаллизации, ультрафильтрацией и др. Далее придают продукту товарную форму за счет проведения процессов гранулирования, дражжирования, таблитирования, розлива, фасовки, ампулирования. Продукт поступает на потребительский рынок [3].

Выводы

    В результате мы пришли к выводу, что биотехнологические процессы гораздо сложнее химических, они требуют широкого аппаратурного сопровождения, предполагают большой ряд производственных стадий (например, стадии очистки целевого продукта), требуют определенных условий проведения процесса в связи с использованием живых систем. Все это осложняет процесс производства.

    В то же время, биотехнологический процесс  позволяет быстро, легко и дешево получить такие продукты, которое  путем химического синтеза получить не возможно.

    В работе мы подробно рассмотрели постферментационную  стадию производства, остановились на этапах фракционирования культуральной  жидкости, процессах разрушения биомассы, очистки целевого продукта.

Список используемой литературы

1. Л.В. Тимощенко, М.В. Чубрик, Основы микробиологии и  биотехнологии: учебное пособие, изд.Томского политехнического университета, 2009, с.195
2. Т.Г. Волова, Биотехнология, Новосибирск: Изд-во Сибирского отделения РАН, 1999, с. 252
3. В.В. Бирюков, Основы промышленной биотехнологии. –М: КолосС, 2004, с. 296