Применение ферментов в народном хозяйстве

ПЛАН

Введение 2

I. Состав и особенности ферментов (энзимов) 4

II. Первый класс - гидролазы и фосфорилазы 6

III. Второй класс - ферменты расцепления 11

IV. Третий класс - окислительно-восстановительные ферменты 12

V. Обработка протеолитическими ферментными препаратами 16

Литература 19 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

     Введение

     Ферменты - биологические катализаторы белковой природы, обладающие высокой активностью  и специфичностью действия. Их применение значительно увеличивает скорость химических превращений, что позволяет  сократить продолжительность многих технологических процессов. С помощью ферментов может быть обеспечена также определенная направленность процессов при получении ценных компонентов продуктов питания.

     Экстракты ферментов находили свое применение, вероятно, еще до того, как стала  записываться история. Одним из примеров подобного применения является соложение  ячменя и использование полученного  экстракта для разжижения крахмала. В 1883 г. Рауеп и Persoz показали, что  агент, ответственный за разжижение крахмала, который они назвали  диастазой, подвергался разрушению под воздействием кипячения, действовал как катализатор и мог быть сконцентрирован и очищен путем  осаждения спиртом. В 1878 г. для наименования подобных агентов Kuhn ввел термин «фермент». Blurnenthal в 1885 г. описал один из первых крупномасштабных процессов экстракции и очистки  ферментов применительно к сычужному  ферментов. Еще в 1902 г. Emmerich, Low и Korschun предложили применение бактериальных  ферментов в клинической практике. В 1908 г. Wallenstein сообщил о стабилизации солодовой диастазы с помощью  сульфата кальция, а в 1915 г. Rohm установил, что белье, подвергаемое стирке, может  быть доведено до нужной степени чистоты  более легко и при более  низкой температуре воды, если его  предварительно обработать липазами и  протеазами. В 1926 г. впервые, фермент  уреаза был получен Sumner в кристаллическом  виде и была показана его белковая природа. К 1930 г. было охарактеризовано около 80 ферментов, к 1947 г. - примерно 200, а к 1968 г. т - свыше 1300. Большинство из известных ферментов подвергалось выделению лишь несколько раз" и то в незначительных количествах.

     Почти все ферменты, выделяемые в настоящее  время в промышленных масштабах, относятся к внеклеточным, т. е. к  таким, которые выделяются клетками в окружающую среду. Выделение таких  ферментов проще, чем внутриклеточных. Целевые ферменты, находящиеся внутри микробных клеток, не только имеют  свойства, которые весьма похожи на свойства многих других внутриклеточных  ферментов, но также сильно загрязнены различными контаминантами. У многих микроорганизмов внутриклеточные ферменты защищены исключительно плотной оболочкой. Однако, несмотря на это, за последние годы несколько внутриклеточных ферментов начали производиться в промышленных масштабах. К ним, в частности, относятся глюкозооксидаза для консервации пищевых продуктов, пенициллинацилаза для превращения антибиотиков и аспарагиназа для возможной терапии раковых заболеваний. Хотя процессы выделения внутриклеточных и внеклеточных ферментов существенно отличаются друг от друга, многие из применяемых для этого операций являются общими. Следует сделать особый акцент на указанной общности, поскольку именно в этом направлении усматриваются наибольшие надежды на то, что в будущем значительно больше ферментов станет производиться промышленностью на одних и тех же технологических линиях.

     Подавляющее большинство применяемых в настоящее  время ферментов относится к  внутриклеточным. До тех пор, пока не будут найдены штаммы микроорганизмов, способные к выделению таких  ферментов в культуральную жидкость, главная роль в прогрессе производства ферментов будет принадлежать технологической  стадии выделения их из клеток. Есть основания полагать, что в ближайшее  десятилетие многие из известных  ферментов смогут выделяться из микробных  клеток уже в промышленных масштабах, что создаст стимул для реализации на практике ряда процессов биосинтеза и биотрансформации в реакторах  с изолированными биокатализаторами-ферментами. 
 
 
 
 
 
 

1. Состав  и особенности  ферментов (энзимов)

     Наряду  с основными специфическими веществами (белки, липиды, углеводы) и минеральными солями в состав молока входят соединения, играющие важную роль в жизнедеятельности  человека. Их часто объединяют в  группу биологически активных веществ. К ним относят ферменты, витамины и гормоны.

     В молоке имеются нативные (истинные) ферменты, которые попадают в него из секреторных клеток молочной железы, или непосредственно переходят  из крови. Из молока, полученного от здоровых животных при нормальных условиях их содержания, выделено более 20 нативных ферментов различных классов. Кроме  нативных ферментов в молоке содержатся многочисленные ферменты микробного происхождения (внеклеточные и внутриклеточные), продуцируемые  микрофлорой молока и бактериальных  заквасок, используемых при производстве кисломолочных продуктов, а также  попадающей в молоко из воздуха и  других источников в процессе получения, хранения и транспортировки молока. Некоторые ферментные препараты (сычужный фермент, пепсин и др.) специально вносят в молоко при производстве молочных продуктов. Таким образом, ферменты имеют как нативное, так и бактериальное  происхождение, что обуславливает  различие их свойств и влияние  на качество молочных продуктов. Ферменты, встречающиеся в молоке и молочных продуктах, имеют большое практическое значение. Так, некоторые ферменты могут  вызвать глубокие изменения составных  частей молока во время хранения с  возникновением различных пороков  вкуса и запаха, что приводит к  снижению пищевой ценности. Распад липидов, белков и углеводов при  производстве молочных продуктов и  сыров происходит под воздействием целого ряда липолитических, протеолитических, окислительно-восстановительных и  других ферментов. В зависимости от химической структуры и специфического действия на различные субстраты ферменты подразделяются на классы (по Инихову):

• гидролазы и фосфорилазы;
• ферменты расшепления;
• окислительно-восстановительные.

     На  действии класса гидролаз и окислительно-восстановительных  ферментов основано производство кисломолочных  продуктов и сыров. Кроме того, по активнсти некоторых нативных бактериальных ферментов можно  судить о санитарно-гигиеническом  состоянии сырого молока (по редуктазе) и эффективности пастеризации (по фосфатазе и пероксидазе). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

2. Первый  класс - гидролазы и фосфорилазы

     К ним относятся липаза, фосфатаза, протеиназа, редуктаза, рибонуклиаза, лизоцим. Липаза – липолитический фермент. В молоке содержится нативная и бактериальная липаза, она катализирует гидролиз триглицеридов молочного жира, с выделе нием низкомолекулярных жирных кислот. Фермент связан с казеином и иммуноглобулином, и лишь небольшая часть адсорбируется оболочками жировых шариков. При распределении липазы с белков на оболочки шариков жира, в случае создания определённых условий, наступает гидролиз жира, т.е. разложение жира на глицерин и жирные кислоты, что приводит к омылению и прогорканию молока и молочных продуктов.

     Образующийся  при гидролизе молочного жира глицерин, путём отщепления двух атомов водорода, может превратиться в глицериновый альдегид и разлагаться дальше. Разложение жирных кислот идёт путём окисления  за счёт кислорода воды до образования  уксусной кислоты, углекислого газа. Разложение молочного жира, вызываемого  липазой в совокупности с другими  факторами, сопровождается образованием промежуточных и конечных продуктов. Например, липоиды, в частности лецитин, подвергаются разложению, как ферментами микроорганизмов, так и др. катализаторами, в частности железом, что придаёт  продуктам неприятный селёдочный привкус. 

     Липаза

     Липаза  истинная (нативная) инактивируется при  Т 74-80°С, бактериальная – 85-90°С. Нативная липаза теряет активность при температуре хранении молока от 0 до 5°С через 48 часов, но при повышении кислотности молока и молочного жира активность её возрастает.

     Как правило, прогорклый вкус молока и молочных продуктов вызывает липаза, выделяемая посторонней микрофлорой молока – микрококками.

     В то же время при производстве сыров  камамбер, рокфор и др. участвует  в формировании вкуса и запаха липаза, выделяемая специфической микрофлорой: молочнокислые палочки, лактококки и термофильный стерптококк. 

     Фосфатаза

     В свежевыдоенном молоке обнаружена щелочная фосфатаза, секретируемая клетками молочной железы, но может и микроорганизмами.

     Инактивируется  фосфатаза при температуре 63°С с выдержкой 30 мин или 72-74°С без выдержки. Это положено в основу метода контроля эффективности пастеризации молока и сливок при невысоких температурах тепловой обработки (проба на фосфатазу).

     В меньшем количестве содержится в  молоке кислой фосфатазы, которая устойчива  к температурам и инактивируется лишь при 97°С с выдержкой 6-4 сек. Лактаза катализирует реакцию гидролитического расщепления лактозы на моносахариды: глюкозу и галактозу. Клетки молочной железы лактазу практически не синтезируют, её вырабатывают молочнокислые бактерии и дрожжи некоторых форм. Оптимальное действие лактазы при рН 5,0. Фермент применяют при выработке гидролизованной сыворотки, используемой в хлебобулочной и кондитерской промышленности. В медицине фермент применяют при нарушении пищеварения, связанного с непереносимостью к лактозе. 
 
 

     Амилаза

     Амилаза в молоке содержится в форме a-амилаза, связана с b-лактоглобулиновой фракцией молока.

     α-Амилаза  является кальций-зависимым ферментом. К этому типу относятся амилаза  слюнных желез и амилаза поджелудочной  железы. Она способна гидролизовать  полисахаридную цепь крахмала и других длинноцепочечных углеводов в любом  месте. Таким образом, процесс гидролиза  ускоряется и приводит к образованию  олигосахаридов различной длины. У  животных α-амилаза является основным пищеварительным ферментом. Активность α-амилазы оптимальна при нейтральной pH 6,7-7,0. Фермент обнаружен также  у растений (например, в овсе), в  грибах (в аскомицетах и базидиомицетах) и бактериях (Bacillus).

     β-Амилаза  присутствует у бактерий, грибов и  растений, но отсутствует у животных. Она отщепляет вторую с конца  α-1,4-гликозидную связь, образуя, таким  образом, дисахарид мальтозу. При  созревании фруктов β-амилаза расщепляет плодовый крахмал на сахара, что  приводит к сладкому вкусу зрелых плодов. В семенах β-амилаза активна  на стадии предшествующей прорастанию, тогда как α-амилаза важна при  непосредственно прорастании семени. β-Амилаза пшеницы является ключевым компонентом при образовании  солода. Бактериальная β-амилаза  участвует в разложении внеклеточного  крахмала.

     Количество  амилазы в молоке повышается при  заболевании животных. Инактивируется при температуре пастеризации. Лизоцим катализирует гидролиз в полисахаридах клеточных стенок некоторых видов бактерий. Обладая, таким образом, антибактериальными факторами, лизоцим обуславливает бактерицидные свойства молока. Содержится лизоцим в молоке в небольших количествах (среднее значение 13мк/г в 100см₃). Он является основным белком, с молекулярной массой 18000, оптимум действия рН 7,9, термостабилен в кислой среде.

     Лизоцим

     Лизоцим принадлежит к группе иммуномодуляторов-пробиотиков, повседневное применение которых позволяет обеспечить безмедикоментозную коррекцию деятельности многих систем организма.

    Лизоцим молока обладает бактериостатическим  и бактерицидным действием. При  высокой концентрации его в молоке происходит более быстрое снижение числа патогенных бактерий, чем при  низкой. Концентрация лизоцима в молоке при мастите увеличивается в 3—7 раз. Выявлены межпородные и внутрипо-родные различия между животными по содержанию лизоцима.

    Бактериостатическая активность свойственна и лактофер-рину. Тяжесть заболевания маститом связана  с уровнем лакто-феррина (г = 0,27). Между  концентрацией Lf и числом соматических клеток в молоке, а также между Lf и лизоцимом существует положительная  связь (соответственно г = 0,35 и г = 0,39). Содержание лактоферрина при мастите  возрастает во много раз. Коэффициент  наследуемости концентрации лактоферрина колеблется от 0,15 до 0,44.

    Важную  роль в защите вымени от инфекции играют иммуноглобулины М, A, Gi, G2. Коровы с  иммунодефицитом IgOh имеют повышенную частоту пиогенных (гнойных) маститов. Между максимальным титром антител  против сывороточного альбумина  человека у молодых быков и  клиническим маститом их полусестер существует высокая положительная  корреляция (/•=0,9). 

     Протеиназа

     R₁- CO - NH – R₂ +H₂ O ® R₁ COOH + R₂ NH₂

     Протеиназа в молоке обнаружены нативные и бактериальные, которые отличаются строением каталитического центра. Все они вызывают гидролиз пептидных связей белков молока в основном a- и b- казеина, образуя пептоны, пептиды и аминокислоты.

     Нативная  протеиназа молока близка по строению к плазме крови и из неё попадает в молоко. Она вызывает гидролиз b- казеина с образованием g-казеина. Фермент инактивируется при 70°С 10 мин или 90°С – 5мин.

     Бактериальная протеиназа вырабатывается микрофлорой молока микрококками, гнилостными бактериями, которые выделяют активные протеиназы, вызывающие различные пороки вкуса и запаха (гнилостный и др.).

     Молочнокислые бактерии заквасок (лактококки и лактобациллы) выделяют активные протеиназы, которые  имеют большое значение при производстве кисломолочных продуктов и сыров. Они формируют специфический  вкус, консистенцию, рисунок сыров, повышая биологическую и пищевую  ценность продуктов. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

3. Второй  класс – Ферменты расщепления

     Рибонуклеазы  ферменты, катализирующие деградацию РНК. Рибонуклеазы классифицируют на эндорибонуклеазы и экзорибонуклеазы.

     Рибонуклеазы  различных классов обнаружены во всех живых организмах. Это указывает  на тот факт, что расщепление РНК  является древним и очень важным процессом. Рибонуклеазы играют важную роль в созревании молекул РНК  всех типов, и особенно мРНК и некодирующих РНК. Система деградации РНК также  является первым этапом защиты против РНК-содержащих вирусов, а также  более тонких клеточных систем иммунитета, например, РНК-интерференции.

     Некоторые эндорибонуклеазы распознают и разрезают  определенные последовательности нуклеотидов  одноцепочечных РНК, подобные свойства имеют рестриктазы — нуклеазы, разрезающие двухцепочечные ДНК.

     Рибонуклеазы  играют ключевую роль во многих биологических  процессах, например, при ангиогенезе, а также обуславливают невозможность  самоопыления у некоторых цветковых  растений.

     Рибонуклеаза  по аминокислотному составу и свойствам аналогична рибонуклеазе поджелудочной железы. В молоко фермент попадает из крови животного. Рибонуклеаза молока катализирует расщепление рибонуклеиновой кислоты на нуклеотиды. 
 
 
 
 
 
 
 

4. Третий  класс – окислительно-восстановительные  ферменты

     Окисление в организмах рассматривается как  процесс отнятия водорода, благодаря  чему вещество окисляется. Отнятый  водород передаётся другому веществу, в силу чего оно восстанавливается. Таким образом, при участии ферментов  микроорганизмов происходит одновременно окисление одного вещества и восстановление другого. Этот процесс и ферменты получили название окислительно-восстановительные. К ним относятся дегидрогеназы, оксидазы, в т.ч. ксантиоксидаза, пероксидаза, каталаза и др. лактодегидразы. 

     Дегидрогеназа

     Дегидрогеназы обнаружены в молоке в небольших количествах в виде нативных (истиных). Они являются катализаторами дегидрирования, при этом перенос атомов водорода осуществляют пиридиновые и проч. Коферменты.

     Дегидразы различают анаэробные и аэробные. Анаэробные передают отнятый водород  любому веществу, кроме кислорода  воздуха. Аэробные передают водород  непосредственно кислороду воздуха.

     Многочисленные  дегидрогеназы накапливаются в  сыром молоке при размножении  в нём бактерий. Они называются редуктазами бактериального происхождения. Активность редуктаз и, как следствие, бактериальную обсеменённость молока определяют по продолжительности восстановления, т.е. обесцвечивания добавленного к  молоку метиленового голубого или резазурина по редуктазной пробе. (ГОСТ 9225-84) 
 
 

     Редуктаза

     Редуктаза — фермент жизнедеятельности  бактерий. В свежевыдоенном молоке редуктаза отсутствует. Редуктазная  проба характеризует молоко по бактериальной  обсемененности. Чем сильнее редуктазная  проба, тем больше в молоке бактерий.

     Редуктаза относится к анаэробным ферментам, она активна до температуры нагревания молока 60°С, инактивируется при температуре 75°С с выдержкой 5 мин. Все дегидрогеназы, вырабатываемые молочно-кислыми бактериями и дрожжами бактериальных заквасок, принимают активное участие в молочнокислом и спиртовом брожении. 

     Оксидаза

     Оксидазы, ферменты класса оксидоредуктаз; широко распространены в природе, катализируют в живых клетках окислительно-восстановительные  реакции, в которых акцептором водорода служит кислород воздуха. При переносе на O₂ водорода от окисляемого субстрата образуется вода (H₂O) или перекись водорода (H₂O₂) По структуре одни оксидазы — металлоферменты (так, тирозиназа, аскорбинатоксидаза содержат медь), другие — флавопротеиды (например, глюкозооксидаза).

     К ним относится ксантиоксидаза из молочной железы и оксидазы, продуцируемые  микрофлорой молока. Ксантиоксидаза катализирует окисление молекулярным кислородом пуриновых оснований  до молочной кислоты, а также различных  альдегидов до карбоновых кислот. 

     Ксантиноксидаза

    Ксантиноксидаза – молибден-, железо- и медь- содержащий флавопротеин, катализирующий у животных конечную стадию окисления пуринов, а также окислительную трансформацию  птеридинов и некоторых алифатических  и ароматических альдегидов. Наибольшая активность КО у животных определяется в тканях печени и слизистой тонкого кишечника. Активность КО обнаpужена также в молоке, почках, сердце, мозге, скелетных мышцах, сыворотке крови и в плаценте (низкая). В сыворотке крови низкая активность КО у овцы, свиньи, козы, более высокая у коровы, собаки, лошади, морской свинки, кролика, крысы, мыши.

    КО  из грудного молока женщин имеет массу  субъединицы 160 кДа, КО молока коровы - 150 кДа. Очищенная КО из женского молока имела значительно ниже активность 10-20 Ед/мг белка, чем КО молока коровы 2000-5000 Ед/мг белка.

     КО  имеет широкую субстратную специфичность. Для КО из печени животных показано, что 2'-дезоксирибонуклеозиды более  эффективные субстраты, чем соответствующие  рибонуклеозиды или арабинонуклеозиды. КО человека и КО молока коровы имели  подобную субстратную специфичность  по отношению к пуринам, но отличались по специфичности к нуклеозидным субстратам. Наиболее высокая активность КО печени человека с гипоксантином (200%), высокая с ксантином (100%), ниже с 2- гидроксипурином (30%), низкая с гуанинарабинозидом (меньше 0,1%)

     Ксантиоксидаза  может передавать водород, отнятый  у субстрата как кислороду  воздуха, так и метиленовому голубому, т.е. происходит окисление. Этот фермент  содержит железо и молибден, его  содержание в молоке высокое. 

     Пероксидаза

     Пероксидаза. Нативная пероксидаза молока продуцируется клетками молочной железы. Часть её может высвобождаться из лейкоцитов. Фермент содержится в молоке в больших количествах, от 30 до 100мг/дм³. Он обладает антибактериальными свойствами. Пероксидаза термостабильна, инактивируется при 80 °С в течение 25 сек., катализирует окисление различных органических соединений перекисью водорода и может окислять некоторые неорганические соединения., например йодид калия.

     2КJ + Н₂ О₂ ® ^{пероксидаза} ® 2КОН + J₂

     Данную  реакцию используют в молочной промышленности для определения эффективности  высокотемпературной пастеризации по йодокрахмальной пробе. Если реакция  будет положительна, то в молоке присутствует пероксидаза и, следовательно, молоко либо не пастеризовано, либо подвергалось термообработке при температуре  ниже 80°С. 

     Каталаза

     Нативная  каталаза переходит в молоко из клеток молочной железы, а также продуцируется  микрофлорой молока и лейкоцитами. В молоке здоровых коров каталазы содержится мало, В молозиве и молоке больных животных её количество резко  увеличивается.

     Каталаза  катализирует окисление перекиси водорода до 2-х молекул воды и кислорода. Определение активности каталазы используется как метод обнаружения молока, полученных от больных коров (мастит или др. заболевания вымени).

     Каталаза  молока бывает двух видов: выделяемая клетками молочной железы и образуемая бактериями. При пастеризации молока ката-лаза первого вида разрушается. Каталаза вырабатывается большинством микроорганизмов, особенно гнилостных. По каталазной пробе судят о степени  загрязненности пастеризованных молочных продуктов. 
 
 
 

5. Обработка протеолитическими  ферментными препаратами

     Для гидролиза лактозы используют фермент b-галактозидазу. В результате гидролиза плохо растворимый и несладкий сахар-лактоза превращается в более сладкую и хорошо растворимую смесь моносахаров (глюкозы и галактозы), что позволяет широко использовать фермент для производства пищевых и кормовых продуктов.

     В результате гидролиза в моносахара превращается до 50-70% лактозы, увеличивается  сладость и усвояемость готового продукта. Во многих странах пользуются популярностью кисломолочные продукты и налитки, вырабатываемые из молока с гидролизованной лактозой. Проводятся исследования по производству сыра из гидролизованного молока. Сыр, по сравнению  с контрольными образцами, отличается более высокими вкусовыми качествами и ускоренным процессом созревания.

     Особый  интерес представляет возможность  выработки продуктов и полуфабрикатов из молочной сыворотки с гидролизованной  лактозой. Такие полуфабрикаты из сыворотки могут широко использоваться для приготовления различных  напитков, пищевых сиропов и подслащающих веществ для кондитерской промышленности. Использование этих полуфабрикатов в хлебопечении позволяет добиться хорошей сбраживаемости опары хлебопекарными дрожжами, улучшить качество хлеба.

     Сыворотку после гидролиза рекомендуется  сгущать при температуре 55-65°С до массовой доли сухих веществ 40%. Продукт  такой концентрации обладает сравнительно невысокой вязкостью, в нем не происходит кристаллизации лактозы.

     В нашей стране и за рубежом проводятся работы по созданию и использованию  иммобилизованных ферментов. Иммобилизованные ферменты - это нерастворимые вещества, в которых фермент связан с  каким-либо носителем силами адсорбции  или ковалентными связями, либо заключен в матрицы или микрокапсулы. Иммобилизованные ферменты сохраняют свою специфичность  и активность, они могут быть легко  удалены из конечного продукта, т.е. могут быть использованы многократно. Кроме того, иммобилизация повышает стабильность фермента, позволяет проводить  гидролиз в течение продолжительного времени и без добавления чужеродных материалов в готовый продукт. Такие ферменты как пепсин, протосубтилин попользуются для производства сывороточного концентрата КОМС. Сывороточный концентрат КОМС вырабатывается путем сгущения подсырной или творожной сыворотки, предварительно обогащенной растворимыми азотистыми веществами и витаминами. Концентрат предназначается для производства безалкогольных напитков или напитков брожения.

     Для обогащения сыворотки используют ее белковые вещества, оставшиеся после  операции осветления. Белковые вещества в сыворотке диспергируют, если пропустить сыворотку через центробежный насос  в течение 10 - 15 мин, ферментные препараты (пепсин, протосубтилин) готовят в  виде раствора. В качестве активатора протеолитических процессов используют автолизированные пивные дрожжи. Одновременно они обогащают сыворотку витаминами группы В и аминокислотами.