Применение иммуногистохимических методов в медицине

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ

ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ  ВЫСШЕГО ОБРАЗОВАНИЯ

«ОРЕНБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ» МИНИСТЕРСТВА ЗДРАВООХРАНЕНИЯ

РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

КАФЕДРА ГИСТОЛОГИИ, ЦИТОЛОГИИ И ЭМБРИОЛОГИИ

 

 

 

 

 

РЕФЕРАТ

на тему: Применение иммуногистохимических методов в медицине

 

 

 

 

Выполнил: студентка 2 курса

лечебного факультета

Шамиданова К.В.

           Проверил: проф.Шевлюк Н.Н.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Оренбург,  2017

 

Содержание

 

Введение ………………………………………………… ………………. …….…..3

Глава 1. История развития метода….……………………………………………….3

Глава 2. Основные фундаментальные знания в области иммунохимии ….....…...5

Глава 3.Методические вопросы проведения иммуногистохимической реакции..7

Глава 4. Проведение иммуногистохимической реакции ………….…………….11

Глава 5. Иммуногистохимия ангиогенеза……………………………………….15

Заключение …………………………………………………………………………18

Литература………………………………………………..……  ……..……………20

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

ВВЕДЕНИЕ

 

Иммуногистохимия (ИГХ) - метод выявления точной локализации клеточного или тканевого компонента (антигена) с помощью иммунологических и гистохимических реакций; при этом иммунологический анализ срезов тканей или цитологического материала проводится в условиях сохранения морфологии клеток.

В диагностической практике можно выделить несколько основных областей применения ИГХ: во-первых, при исследовании опухолей человека с целью определения гистогенеза недифференцированных опухолевых образований, отдаленных метастазов, для дифференцировки различных тканевых компонентов, составляющих комплексные опухоли; во-вторых, с целью прогностической оценки дальнейшего течения заболевания и, наконец, при назначении терапии.

Особую ценность иммуногистохимия приобретает в том случае, когда имеются трудности в определении гистогенетической принадлежности опухолевой ткани на основании изучения рутинных срезов, окрашенных гематоксилин-зозином, при этом морфологи нередко используют термин «недифференцированные опухоли». Выявление гистогенеза опухоли необходимо для решения вопроса о тактике лечения заболевания и прогностической оценке. Наибольшее клиническое применение в настоящее время ИГХ получила при классификации лейкозов и лимфом. Определенные панели антител позволяют охарактеризовать острые и хронические лейкозы, лимфогранулематоз и различные типы неходжкинских лимфом. Так, используя антитела к общему лейкоцитарному антигену, выявляют лимфомы, а антитела к белкам S-100 и HMB-45 позволяют определить меланомы.

 

Глава 1. История развития метода

 

Основной принцип иммуногистохимии был предложен 70 лет назад J.R. Marrack (1934) и заключается в том, что в качестве гистохимических реагентов используют антитела, к которым присоединяют определенный флуоресцентный маркер. Авторами метода по праву считается группа исследователей под руководством A.H. Coons, которая в 1942 году впервые с помощью антител, меченных изоцианатом, выявила антигены пневмококков в инфицированных тканях (Coons A.H. et al., 1941; 1955). Затем ИГХ применяли в области эндокринологии для выявления мест синтеза различных гормонов. Однако эта методика не находила широкого применения из-за сложностей, связанных с использованием флуоресцентных микроскопов, трудностей выявления основных компонентов тканей и высокой чувствительности флуоресцентных маркеров к дегидратации.

Одним из важных открытий для дальнейшего широкого использования иммуногистохимии было выявление в 1951 году J.M. Marshall возможности локализовать in vitro молекулы адренокортикотропного гормона в гипофизе с помощью антител, меченных флуоресцентными маркерами. Локализация эндогенных антигенов in vivo была осуществлена через 4 года с помощью непрямого метода. В этих экспериментах кроличья антисыворотка против крысиного почечного антигена была введена крысам и на замороженных срезах почки крысы было выявлено наличие гамма-глобулинов с помощью меченных флуоресцентным маркером цыплячьих антител против кроличьих глобулинов.

В 1960 году для осуществления визуализации антител в электронной микроскопии было введено большое количество маркеров тяжелых металлов, таких как ферритин, коллоидное золото. Тяжелые металлы не являются идеальными маркерами для иммуногистохимии по самым различным техническим причинам, хотя сейчас применяются оригинальные методики с использованием коллоидного золота.

Методы использования конъюгированных ферментами антител были независимо разработаны P.K. Nakane, G.B. Pierce (1966) и S. Avrameas, J. Uriel (1966). Наибольшую популярность получил пероксидазно-антипероксидазный метод L.A. Sternberger с соавт. (1977). Для визуализации энзиматических маркеров в конце реакции антиген-антитело проводят гистохимическую реакцию, в результате которой фермент становится видимым на световом уровне. Дальнейшее усовершенствование этой реакции привело к тому, что продукты реакции были видны и на электронно-микроскопическом уровне, за счет взаимодействия с осмием они становились электронно-плотными.

В последние годы применение иммуногистохимии в морфологии широко развивалось в связи с разработкой новых методов конъюгации антител, фиксации тканей, демаскирования антигенов, а также использования новых ламп и фильтров для флуоресцентной микроскопии.

 

Глава 2. Основные фундаментальные знания в области иммунохимии

 

В основе любой иммунологической реакции лежит взаимодействие антигена с антителом, которое приводит к формированию комплекса «антиген-антитело».

Антигены - чужеродные вещества сложной органической природы, способные при попадании в организм вызывать иммунные реакции. Небольшой участок антигена, с которым будет связываться антитело, называется эпитопом.

Различают полные и неполные антигены. Полные антигены - это белки, полисахариды, нуклеиновые кислоты, синтетические высокополимерные соединения, вирусы, паразиты, бактерии. Неполные антигены, или гаптены, - низкомолекулярные соединения, которые сами по себе не могут вызывать иммунного ответа, однако, соединяясь с клетками и тканями организма, в комплексе становятся полными антигенами, способными вызывать иммунный ответ.

Антитела - вещества белковой природы, которые образуются в организме в ответ на антигены и, специфически взаимодействуя с ними, уничтожают их, обеспечивая гуморальный иммунитет. Антитела обладают специфичностью к антигенам, т.е. связываются только с тем антигеном, на который вырабатывались.

Антитела принадлежат к группе белков иммуноглобулинов - близкие по химическому строению и свойствам глобулярные белки, которые обладают способностью соединяться с антигенами. Антигены, попадая в организм, способствуют образованию антител. У человека и высших позвоночных известно 5 классов иммуноглобулинов (IgA, IgD, IgE, IgG и IgM). Молекулы иммуноглобулинов (Ig) построены из легких и тяжелых полипептидных цепей, расположенных симметрично (L- и H-цепи). Легкие и тяжелые цепи состоят из двух областей – вариабельной и постоянной. Вариабельные участки принимают участие в контакте с антигеном, это определяет специфичность антител. Антитела чувствительны к протеолитическим ферментам и распадаются на два идентичных Fab-фрагмента и один Fc-фрагмент. Fab-фрагменты сохраняют свою способность связываться с антигеном. Fc-фрагмент не способен связываться с антигеном, он определяет специфичность связывания молекулы Ig с клетками-эффекторами, несущими на своей поверхности рецепторы Fc-фрагмента; именно к этой части антитела можно присоединить различные вещества; в частности для проведения иммуногистохимических реакций к данному фрагменту присоединяют биотин, флуорохромы или ферменты.

Структурное разнообразие антител определяется последовательностью аминокислот в вариабельных областях тяжелых и легких цепей. Постоянные области иммуноглобулинов кодируются одним геном для каждого класса антител. И антитела, и антигены могут быть поливалентными (т.е. иметь множество участков связывания) в результате повторения эпитопов и в результате наличия многих эпитопов, с которыми будут связываться разные антитела.

Антитела, которые используются в иммунологических методиках, получают путем повторной иммунизации различных животных (чаще мышей, кроликов, крыс, овец, лошадей и др.) определенным антигеном. После выработки антител у иммунизированного животного берут сыворотку крови и очищают ее от других сывороточных протеинов.

Поскольку большие молекулы могут иметь несколько эпитопов, они стимулируют множество линий В-клеток, которые синтезируют несколько видов антител к разным эпитопам одного и того же антигена. Получаемые антитела называют «поликлональными», они являются смесью антител к различным эпитопам антигена.

Моноклональные антитела представляют собой продукт одного клеточного клона плазматических клеток, таким образом все антитела являются иммунологически идентичными и реагируют с одним эпитопом антигена, к которому они были получены. Получение моноклональных антител включает в себя следующие этапы: иммунизация животных; подготовка В-лимфоцитов селезенки к слиянию; слияние с клетками миеломы; отбор индуцирующих специфические антитела клонов; клонирование и наработка гибридомных клеток; получение культуральной жидкости или асцита, содержащих антитела; выделение антител.

Важнейшим этапом любого иммуногистохимического метода является визуализация результатов реакции «антиген - антитело». Антитела обладают свойством прочно связываться с тканевыми антигенами, при этом не связанные антитела можно удалить отмыванием срезов. Поскольку окрашенные продукты реакции являются нерастворимыми, они оседают в месте взаимодействия антител. Для выявления образовавшегося в процессе реакции комплекса «антиген - антитело», используют различные метки, связанные с Fc-фрагментом антител: ферменты, флуорохромы, биотин, металлы.

В настоящее время в качестве окрашенных меток широко используются пероксидаза хрена и щелочная фосфатаза. Окисление пероксидазы хрена с помощью 3-диаминобензидина тетрахлорида придает продуктам реакции коричневую окраску, в то время как щелочная фосфатаза после взаимодействия с различными субстратами (AS-MX фосфат, 5-бром-4-хлоро-3-индоксил фосфат и др.) формирует нерастворимые продукты, которые в зависимости от используемого красителя можно окрасить в синий (прочный синий ВВ) или красный (прочный красный TR) цвет.

Подобным образом осуществляется визуализация первоначально не видимых тканевых и клеточных антигенов с помощью иммуногистохимической методики.

 

Глава 3. Методические вопросы проведения иммуногистохимической реакции

 

Подготовка клеток и тканей. Выявление антигенов в клетках и тканях с помощью иммуногистохимии осуществляется в несколько этапов. Исследуемые образцы замораживаются или заключаются в парафин, режутся на микротоме и помещаются на предметные стекла. Затем срезы освобождаются от парафина, на них проводят демаскирование антигенов, блокируют неспецифическое связывание белков и эндогенную пероксидазную активность и затем проводят инкубацию с первичными антителами. Связавшиеся первичные антитела выявляют, добавляя вторичные антитела, конъюгированные при помощи полимера с пероксидазой хрена, и осуществляют визуализацию вторичных антител при помощи субстрата - диаминобензидина. После достижения максимальной интенсивности окрашивания, срезы промывают водой для прекращения реакции, докрашивают гематоксилином и заключают в заливочную среду.

Для ИГХ пригоден практически любой материал: цитологические мазки, свежезамороженная или фиксированная ткань. Выбор исследуемого материала должен определяться свойствами изучаемого антигена: так, большинство цитоплазматических антигенов выявляются на фиксированных формальдегидом и залитых в парафин срезах; поверхностные клеточные антигены, как правило, разрушаются или маскируются при обычной фиксации и могут быть выявлены только на свежезамороженных тканях либо в культуре клеток.

Фиксация. Основная часть гистологических и цитологических методик направлена на сохранение морфологической структуры клеток и тканей, для этого исследуемые образцы помещают в фиксирующие растворы. Фиксация необходима для предотвращения аутолиза антигенов; при этом блокируются лизосомные ферменты и предотвращается рост бактерий, которые вызывают разрушение клеточной структуры.

Положительный результат иммуногистохимической реакции во многом определяется адекватной фиксацией исследуемых антигенов в тканях. Выявляемый антиген должен быть нерастворимым в жидкостях за счет процесса фиксации его к тканевым компонентам. Особенностью антигена является доступность его первичной структуры для антител. С другой стороны, за счет денатурации белков, фиксация вызывает структурные изменения и инактивацию антигенного профиля клеток. Идеальный фиксатор должен сохранять морфологию исследуемого материала, закреплять исследуемый антиген в месте его распределения и не нарушать его антигенные свойства. До настоящего времени подобного фиксатора не описано.

Выбор специфического фиксатора для отдельных компонентов клетки имеет большое значение. Из этих компонентов важную роль играют белки клетки, а лучшим для них фиксатором является формалин; в тех случаях, когда формалин использовать нельзя, его обычно заменяют спиртом или ацетоном. В частности, антигены промежуточных филаментов лучше выявлять на свежезамороженных срезах или тканях, фиксированных в спиртах.

Фиксация мазков крови и цитологических препаратов. Перед фиксацией препараты высушивают 1-2 часа при комнатной температуре для предотвращения повреждения клеток. При высушивании клетки плотно прилипают к стеклу и не смываются при последующей фиксации. Высушивание не повреждает структуры поверхностных антигенов лейкоцитов. Мазки фиксируют либо в абсолютном ацетоне, либо в 96° этаноле 1-3 мин, с последующей окраской клеток.

Приготовление срезов тканей. Иммуногистохимия на криостатных срезах. Криостатные срезы подходят для выявления большинства антигенов. Срезы толщиной 5 мкм помещают на покрытые поли-L-лизином стекла и высушивают в течение 12 часов при комнатной температуре. Срезы фиксируют, погружая в холодный ацетон -20 °С, либо другой фиксатор (этиловый спирт, формалин и т.п.) на 2 мин. Стекла высушивают на воздухе и проводят регидратацию в 1% неиммунной бычьей сыворотке в солевом фосфатном буфере (PBS), затем осуществляют иммуногистохимическую реакцию.

Иммуногистохимия на парафиновых срезах. Современные методы демаскирования клеточных антигенов позволяют проводить ИГХ реакции на парафиновых срезах. При этом в качестве фиксатора может быть использован 10% раствор забуференного формальдегида.

Заливка в парафин:

1. Фиксация в забуференном формалине - сутки.
2. Промывка в проточной воде - 2 часа.
3. 70% этанол - 30 мин.
4. 80% этанол - 30 мин.
5. 90% этанол - 30 мин.
6. 100% этанол - 3 смены по 1 часу.
7. Ксилол/ этанол 1:1 - 15 мин.
8. Ксилол - 2 смены по 30 мин.
9. Ксилол/ парафин 1:1 при 56?С - 30 мин.
10. Парафин - 2 смены при 56?С 1 час.
11. Заливка.

Перед проведением ИГХ реакции на парафиновых срезах необходимо осуществить их регидратацию. Срезы толщиной 4-5 мкм режутся на покрытые поли-L-лизином стекла, затем высушиваются при 37?С в течение ночи и 1 час при 60 °С.

Регидратация:

1. Ксилол - 3 смены по 5 мин.
2. 100% этанол - 2 смены по 3 мин.
3. 96% этанол - 2 смены по 3 мин.
4. 80% этанол - 3 мин.
5. Дистиллированная вода - 2 смены по 3 мин.

Демаскирование антигенов. После фиксации в формалине и заливки в парафин тканевые антигены необходимо демаскировать. Эта процедура направлена на восстановление оригинальной структуры белка. Методы демаскирования антигенов, такие как обработка протеолитическими ферментами или нагревание в микроволновой печи после формалиновой фиксации и заключения в парафин способствуют обнаружению не выявляемых ранее антигенов.

Демаскирование клеточных антигенов ферментами (трипсин, протеиназа К, проназа) применяется, как правило, для цитокератинов и некоторых других клеточных антигенов. Другой способ «освобождения» антигенов осуществляется путем нагревания, при этом отмечается усиление иммуногистохимической реакции на срезах, фиксированных в формалине. Для нагревания можно использовать как водяную баню, так и микроволновую печь. Как правило, нагревание срезов проводят в 10 мМ цитратном буфере при рН 6,0.

Протокол обработки срезов ферментами:

1. Поместить срезы в дистиллированную воду.
2. Приготовить 0,1% раствор трипсина или протеиназы К в PBS (рН 7,6).
3. Инкубировать при 37 °С от 15 до 60 мин.
4. Остановить действие фермента ополаскиванием в холодной воде.
5. Перенести в PBS.

Протокол обработки срезов в микроволновой печи:

1. Поместить срезы в пластиковый контейнер с 10 мМ цитратным буфером (pH 6,0).
2. Нагревать срезы при мощности 700 Вт 7 мин.
3. Долить испарившуюся жидкость и нагревать срезы при мощности 350 Вт 20 мин.
4. Остудить срезы вне печи в течение 15 мин.
5. Перенести срезы в PBS.

Блокировка эндогенной активности ферментов

Эндогенная активность пероксидазы. Пероксидазная активность встречается во многих клетках организма: эритроцитах (гемоглобин), миоцитах (миоглобин), макрофагах и нейтрофилах (цитохромы), гепатоцитах и эпителии почек (каталаза). Для нейтрализации эндогенной пероксидазной активности на срезы на 10 мин наносят 1-3% раствор перекиси водорода.

Эндогенная активность щелочной фосфатазы. Блокирование щелочной фосфатазы осуществляют 5 мМ раствором левамизоля.

Биотин. Витамин Н - биотин - присутствует в печени, почках и др. органах. При использовании по время ИГХ реакции пероксидазно-авидинового комплекса для визуализации меченых биотином вторичных антител, возможно его неспецифическое связывание с клеточными компонентами, содержащими эндогенный биотин. Для предотвращения подобной неспецифической реакции перед осуществлением блокирования эндогенной пероксидазы проводят инкубацию срезов в 0,1% р-ре авидина, а затем в 0,01% растворе биотина в Трис-буфере (ТБС). Второй способ избежать неспецифической реакции с биотином - это использование современных безбиотиновых систем визуализации антигенов.

 

Глава 4. Проведение иммуногистохимической реакции

 

Существует множество различных методов иммуноферментной окраски, которые позволяют определить место локализации антигена: прямой метод, непрямые методы, методы с использованием ферментных иммунных комплексов, авидин-биотиновые методы и др.

Прямой метод. Эта методика была разработана A.H. Coons, M.H. Kaplan (1950). Меченые ФИТЦ (флуоресцеинизотиоцианатом) первичные антитела наносили непосредственно на срезы. После инкубации несвязанные антитела смывали фосфатным буфером и с помощью ультрафиолетового света выявляли места локализации антигенов по зеленоватой флюоресценции.

Непрямой метод. Был также описан A.H. Coons с соавт. (1955). Этот метод более чувствителен, чем прямой, т.е. то же количество первичных антител, присоединенных к тканевым антигенам, будет более интенсивно окрашиваться по сравнению с прямым методом либо то же количество антигенов можно локализовать за счет более низкой концентрации первичных антител. Первичные немеченые антитела наносят на срезы, а их избыток смывается буфером. Затем наносятся вторичные конъюгированные с ФИТЦ антитела, принадлежащие другому виду животных, полученные к гамма-глобулиновой фракции сыворотки крови животных, использовавшихся в качестве первичных антител. В этом случае первичные антитела, связавшиеся с антигенами исследуемой ткани являются антигенами для меченых вторичных антител, которые также распределяются в месте локализации тканевых антигенов. Другим преимуществом непрямого метода является возможность применения одних и тех же меченых вторичных антител, при использовании первичных антител от одного и того же вида животных. Маркеры для этого метода могут быть флуоресцентными (флуоресцин, родамин), ферментными (пероксидаза хрена), а также коллоидное золото.

Не конъюгированный антигенно-ферментный метод. Название связано с тем, что как первичные, так и вторичные антитела не конъюгируются с маркерами. В свою очередь, вторичные антитела используются как мостик между первичными антителами и конечными, которые также не конъюгируются, а получаются путем иммунизации животных того же вида, что и первичные антитела к пероксидазе хрена. За последним слоем антител наносится пероксидаза хрена, которая присоединяется путем реакции антиген-антитело и затем проявляется гистохимически. За счет отсутствия химической конъюгации, не повреждается иммунологическая реактивность всех антител.

Одиночный мост. Первым слоем может быть кроличья сыворотка, полученная против первичного антигена, второй слой - неконъюгированная сыворотка козы против кроличьих гаммаглобулинов и третий слой - кроличья сыворотка, полученная против пероксидазы хрена, которая затем проявляется гистохимическим методом, таким как диаминобензидин и перекись водорода по R.C. Graham и M.J. Karnovsky (1966).

Двойной мост. Он включает повторение второго слоя, сыворотки козы против кроличьих иммуноглобулинов после кроличьей антипероксидазной сыворотки и затем повторение кроличьей антипероксидазной сыворотки перед нанесением пероксидазы и её визуализацией, таким образом достигается увеличение числа мест, связывающих пероксидазу.

Пероксидазно-антипероксидазный метод. Развитие этого метода L.A. Sternberger (1979) оказало большое влияние на иммуногистохимию. Модификация Штейнбергом мостовой методики заключалась в проведении реакции антипероксидазных антител с пероксидазой перед нанесением их на ткани. Эта реакция приводила к образованию стабильного комплекса трех молекул пероксидазы хрена с двумя молекулами антител. Этот комплекс отделялся от непрореагировавших антител и пероксидазы перед использованием. Он реагирует как антиген третьего слоя. Первый слой составляют кроличьи антитела, реагирующие с тканевыми антигенами, второй слой образует неконъюгированная вторичная сыворотка козы против кроличьих антител в избытке, таким образом одно из парных соединительных мест антител (Fab-часть) является свободной для реагирования с третьим слоем кроличьего ПАП комплекса. Таким образом, обеспечивается высокое соотношение между количеством пероксидазного маркера и первичным антигеном. Кроличьи ПАП молекулы реагируют только с антикроличьими иммуноглобулинами козы второго слоя, и это обеспечивает отсутствие неспецифического связывания с тканью. Это специфичная и свободная от фона реакция. Для увеличения интенсивности, нанесение второго и третьего слоев можно повторить.

Авидин-биотиновый метод. Два новых вещества стали использовались в иммуногистохимии после исследований J.L. Guesdon с соавт. (1979) - биотин и авидин. Биотин (витамин Н) в большом количестве содержится в белках птичьих яиц, где он связан с большим гликопротеидом - авидином. Авидин имеет высокую аффинность к биотину, одна его молекула может присоединить 4 молекулы биотина. Биотин может связываться с Fc-иммуноглобулинами, каждая молекула биотина имеет одно место связывания, но с одной молекулой иммуноглобулина могут связываться несколько молекул биотина. Как биотин, так и авидин могут быть помечены флуоресцентной меткой, ферментом, ферритином или молекулой золота. Методика с использованием авидин-биотиновых комплексов считается соответствующей либо даже превышающей ПАП метод по чувствительности. В этой методике первый слой представляют первичные кроличьи антитела; второй слой составляют биотинилированные антикроличьи иммуноглобулины козы; третий слой представлен авидин-биотиновым комплексом. Авидин реагирует с биотинилированной пероксидазой хрена в такой пропорции, при которой три связывающих места авидина взаимодействуют с биотинилированной пероксидазой, оставшееся одно место на каждой молекуле является свободным для взаимодействия с биотином второго слоя антител. Метод блокирования неспецифического взаимодействия с тканевым биотином был предложен G.S. Wood и R. Warnke (1981). Неконъюгированный авидин наносится на ткани для связывания биотина и затем добавляется в избытке неконъюгированный биотин для предупреждения любого связывания авидин-биотинового комплекса.

В последнее время различными фирмами разработаны новые методы визуализации иммуногистохимической реакции с использованием конъюгатов полимеров. К длинной молекуле полимера присоединяется большое количество фермента. За счет увеличения концентрации фермента повышается чувствительность метода. При этом с полимером могут быть конъюгированы как первичные антитела, так и молекулы фермента EPOS (Enhanced Polymer One Stepstaining) фирмы Dako. Если с молекулой полимера конъюгируются вторичные антитела и фермент (EnVision, фирмы Dako), то иммуногистохимическая реакция проводится в два этапа, при этом достигается высокая чувствительность по сравнению с другими методами визуализации.

Наибольшую популярность в настоящее время получили иммуногистохимические методики, использующие для визуализации реакции ферменты пероксидазу хрена или щелочную фосфатазу, с использованием стрептовидинбиотинового комплекса. Эта методика проводится в три этапа: нанесение неокрашенных первичных антител, затем биотинилированных вторичных антител и добавление связанного с молекулами фермента стрептовидина (Dabbs D.J., 2002). Необходимо отметить, что чувствительность ИГХ методики во многом зависит от используемых реагентов и особенностей проведения реакции, в связи с чем, сложно сравнивать результаты ИГХ при использовании различных реактивов и методических приемов.

Важными условиями проведения иммуногистохимической реакции является подбор титра антител. Титром антител называют максимальное разведение сыворотки, при котором наблюдается выраженное специфическое окрашивание без неспецифического фонового окрашивания окружающих тканей. Все коммерческие антитела имеют инструкции с описанием оптимального разведения, однако часто подбирать титр антител приходится экспериментально, поскольку этот показатель зависит от таких причин, как длительность инкубации первичной сыворотки, окружающая температура, выбранная система визуализации распределения первичных антител и т.п.

Перед нанесением первичных антител срезы помещают на 1-2 мин в PBS, затем необходимо удалить избыток буфера вокруг среза и капнуть на срез небольшое количество первичной сыворотки от 30 до 50 мкл в зависимости от площади среза. Затем срезы помещают горизонтально во влажную герметичную камеру на подставку, под которой находится фильтровальная бумага, смоченная водой, для предотвращения неспецифического связывания антител с тканью за счет их высыхания. И проводят инкубацию при комнатной температуре в течение 15-30 мин в зависимости от рекомендаций производителя антител. Для ускорения процессов связывания антител с антигенами можно проводить инкубацию при температуре 37?С. Для повышения интенсивности ИГХ реакции и увеличения разведения используемой сыворотки можно проводить реакцию при 4 °С в холодильнике в течение ночи.

 

Глава 5. Иммуногистохимия ангиогенеза

 

Формирование кровеносных сосудов и/или кровеносной системы определяется двумя процессами: васкулогенезом и ангиогенезом.

Васкулогенез заключается в дифференцировке ангиобластов (предшественников эндотелиальных клеток) у эмбрионов в кровяных островках, которые после слияния формируют сердечно-сосудистую систему или васкуляризируют эндодермальные органы.

Ангиогенез включает в себя пролиферацию и миграцию эндотелиальных клеток в первичных васкулярных структурах и способствует васкуляризации эктодермальных и мезенхимных органов, реконструкции капиллярной сети.

Ангиогенез необходим для процессов заживления ран, развития многих эмбриональных тканей и плаценты, а также для циклических репродуктивных изменений в женском организме, связанных с формированием желтого тела, ростом эндометрия и лактацией.

Факторы, стимулирующие образование кровеносных сосудов, носят название ангиогенных. К ним относятся: фактор роста сосудов эндотелия (VEGF), фактор роста фибробластов (FGF), ангиогенин, трансформирующий фактор роста-α (TGF-α). Все ангиогенные факторы можно подразделить на 2 группы: первая непосредственно влияет на эндотелиальные клетки, вторая является группой факторов, осуществляющих свое действие опосредованно через макрофаги, которые выделяют факторы роста и цитокины. К факторам второй группы принадлежит ангиогенин.

В новообразованиях процессы неоваскуляризации составляют важный компонент инвазивной и метастатической активности. Данные, накопленные за последнее десятилетие, убедительно показывают необходимость ангиогенеза для роста подавляющего большинства злокачественных опухолей. Формирование сети капилляров из эндотелиальных клеток, выстилающих мелкие венулы, - необходимое условие для дальнейшего роста опухолевого узелка, достигшего в диаметре 2-4 мм. Процессы образования и роста кровеносных сосудов необходимы и для развития метастазов.

Капиллярная сеть сначала развивается в прилежащих к опухоли тканях, которые впоследствии замещаются неопластическими клетками. При этом, хотя капиллярная сеть, окружающая опухоль, формируется из клеток нормального эндотелия организма, однако заметно отличается от нормальной по морфологии, плотности и проницаемости сосудов. Плотная сеть капилляров снабжает развивающуюся опухоль кислородом, необходимыми питательными веществами и позволяет выводить токсичные продукты жизнедеятельности опухолевых клеток. Наличие капиллярной сети облегчает также внедрение и распространение клеток метастазирующих опухолей. Таким образом, для того чтобы злокачественное новообразование превысило в толщину несколько слоев живых клеток, необходима высокоспециализированная система капилляров.