Содержание:

1. Современные представления о тканевом дыхании………………………..
2. Спиртовое и молочнокислое брожение…………………………………….
3. Бета-окисление высших жирных  кислот…………………………………..
4. Протеолитические ферменты……………………………………………….

Современные представления о тканевом дыхании

      Первые представления о тканевом дыхании связаны с именем А.Л. Лавуазье (XVIII в.), который первым указал на то, что жизнь воз- можна только в присутствии кислорода, и отметил сходство между процессами горения угля и тка- невым дыханием. Но уже тогда было очевидно, что биологическое окисление во многом отличается от процессов горения, а именно: оно протекает в необычных, очень «мягких» условиях: при сравни- тельно низкой температуре (37⁰С), без образования пламени и в присутствии воды как главного ком- понента человеческого организма. Поэтому важной задачей, стоявшей перед учеными, являлось ус- тановление причин такого своеобразного течения окислительных процессов в живых организмах.

      В разработку теоретических представлений о биологическом окислении большой вклад вне- сли русские ученые А.Н. Бах (1897 г.), В.И. Палладин (1907 г.), а также немецкий ученый К.О. Энг- лер (1897 г.). В результате обработки данных многочисленных исследований они предположили, что в процессе тканевого дыхания происходит активация молекул кислорода за счет энергии самоокис- ляющихся веществ с образованием пероксидов, которые затем разлагаются с участием других суб- стратов. Схему данного процесса можно записать в виде:

S⁽¹⁾ + О₂ → S⁽¹⁾О₂

S⁽¹⁾О₂ + S⁽²⁾ → S⁽¹⁾О + S⁽²⁾О

   _S⁽¹⁾_{О + S}⁽²⁾ _{→ S}⁽²⁾_{О + S}⁽¹⁾

S⁽¹⁾ + О₂ + 2S⁽²⁾ → S⁽¹⁾О₂ + 2S⁽²⁾О,

где S⁽¹⁾ и S⁽²⁾ – субстраты 1 и 2 соответственно.

     А.Н. Бах впервые сформулировал идею о сопряжении окислительно-восстановительных про- цессов при тканевом дыхании. По А.Н. Баху в процессе тканевого дыхания окисление с участием пероксидных соединений происходит под действием ферментов пероксидаз. В целом его идеи полу- чили название пероксидной теории дыхания Баха.

      В.И. Палладин развил теорию о дыхании как о системе ферментативных реакций, в которой особое значение уделяется окислению дыхательных субстратов путем дегидрирования.

      В последующих работах была исследована взаимосвязь тканевого дыхания с другими процес- сами обмена веществ, ферментная обеспеченность дыхательных процессов, механизмы аккумуляции и превращения энергии и т.д. Большой вклад в изучение этих вопросов внесли В.А. Энгельгардт, В.А. Белицер, С.Е. Северин, В.П. Скулачев, Г. Кребс, А. Ленинджер, П. Митчелл и ряд других из- вестных ученых. 
 

      На современном этапе развития биохимии тканевое дыхание представляется в виде полифер- ментной цепи (дыхательная цепь) переноса электронов и ионов водорода от биологического суб- страта к кислороду. Дыхательная цепь образована окислительно-восстановительными ферментами, расположенными в липидном слое внутренней мембраны митохондрий клеток (рис. 10.2).

     Митохондрии обычно имеют форму цилиндра с закругленными концами, длиной 1–4 мкм и диаметром 0,3–0,7 мкм. Они состоят из внешней и внутренней мембран, которые различаются по со- ставу, свойствам и функциям. Внешняя мембрана легко проницаема для молекул с молекулярной массой до 5 000, в то время как проницаемость внутренней мембраны строго ограничена и избира- тельна, что определяется наличием специфических транспортных систем. На долю ферментов дыха- тельной цепи приходится 30–40% всех белков внутренней мембраны. Дыхательную цепь нередко называют редокс-цепью (окислительно-восстановительная цепь), поскольку в ней многократно про- текают процессы окисления – восстановления, а также цепью переноса электронов, электро- нотранспортной или электронопереносящей цепью. Это более широкие понятия, чем «дыхатель- ная цепь», поскольку подобные системы функционируют в мембранах хлоропластов, ядер, микросом клеток.

SH₂ + ½O₂ → S + H₂O. 

Этот  процесс включает большое число стадий, в которых участвуют входящие в дыхательную цепь промежуточные переносчики электронов и ионов водорода. Основными компонентами дыха- тельной цепи являются: никотинзависимые дегидрогеназы, флавинзависимые дегидрогеназы, цито- хромы, убихинон и некоторые металлопротеины (железосерные белки). Все перечисленные перенос- чики электронов и ионов водорода рассматриваются в главах 3 и 5.

      Водород от первичных доноров вводится в дыхательную цепь с участием НАД-зависимых и ФАД-зависимых дегидрогеназ. НАД-зависимые дегидрогеназы переносят водород с субстрата (SH₂) на НАД⁺, при этом образуется их восстановленная форма (НАДН + Н⁺):

SH₂ +  НАД⁺ →  S  + НАДН  +  H⁺.

      Далее два электрона и два протона переносятся от восстановленного (НАДН + Н⁺) к ФМН, входящему в состав флавопротеина (ФлПр), встроенного в митохондриальную мембрану и пронизы- вающего ее от внешней до внутренней поверхности (рис. 10.3):

^{НАДН  +  Н+ +  ФМН → ФМНН}₂ ^{+ НАД+.}

^{Благодаря этому восстановленный ФМНН}₂ ^{переносит протоны от внутренней поверхности}

мембраны к внешней. На этом участке дыхательной цепи пути электронов и протонов расходятся:

протоны выделяются в межмембранное пространство, а два электрона переносятся от ФМНН₂ к свя-

^{занному с ним железосерному белку FeSПр}₁^{, а затем через цитохром b}₅₆₂ ^{– на убихинон (КоQ):}

_2e 2e 2e 

^ФМНН₂ 
 

_{- 2Н}⁺ 

^FeSПр₁ ^b562 ^КоQ 

      Убихинон присоединяет два протона из внешнего пространства митохондрий с образованием восстановленного КоQH₂:

^{КоQ +  2H+   +  2ē → КоQН}₂^.

Таким образом, замыкается первая петля (1-й участок) митохондриальной цепи. Необходимо

отметить, что благодаря хорошей растворимости убихинона в липидном слое мембран он может мигрировать от одной стороны мембраны к другой, перенося на себе водород. Далее разделение во- дорода на протоны и электроны повторяется (2-й участок), при этом два электрона через цитохром b₅₆₆   и железосерный белок FeSПр₂ возвращаются на внешнюю сторону мембраны и акцептируются окисленным КоQ совместно с двумя протонами из окружающей среды. Новый восстановленный КоQH₂ опять участвует в переносе водорода через мембрану. При этом возврат пары электронов на внешнюю сторону мембраны осуществляется через систему последовательно сопряженных цито- хромов (3-й участок). Напомним, что ион железа в геме цитохромов может попеременно менять свою степень окисления, присоединяя или отдавая электрон.

^{Комплекс цитохромов a и a}₃ ^{действует как цитохромоксидаза, содержащая, помимо гема, ио-}

ны меди, которые тоже участвуют в переносе электронов, меняя при этом степень окисления:

Cu²⁺ +  ē Cu⁺.

      Комплекс цитохромов переносит электроны на молекулу кислорода. Кислород, поступающий в митохондрии из крови, связывается с ионом железа в геме цитохрома а₃  в молекулярной форме О₂ (подобно тому, как он связывается с гемоглобином в процессе своего транспорта). Затем каждый из атомов молекулы О₂ последовательно присоединяет по два электрона и два протона, восстанавлива- ясь при этом до молекулы воды:

^О₂   ^{+ 4ē + 4Н+ →  2Н}₂^О.

Таким путем через дыхательную цепь электроны от субстрата достигают конечного акцепто-

ра –  атмосферного кислорода. Образующаяся в результате такого процесса вода называется метабо- лической. Некоторые насекомые, например жуки-чернотелки, получают воду только в результате тканевого дыхания, поскольку их пищевой рацион практически не содержит воды.

     Таким образом, разделение водорода на протоны и электроны в мембране митохондрий на- поминает работу переправы с помощью двух типов транспортных средств, т.е. цепь переноса элек- тронов работает как протонный насос, перекачивающий ионы водорода из межклеточного простран- ства на наружную сторону мембраны.

Направление переноса электронов и ионов водорода в дыхательной цепи определяется окис-

лительно-восстановительными потенциалами основных ее компонентов (табл. 10.5).

_{Следует пояснить, что при физиологических условиях (рН 7,4) стандартный окислительно-}

^{восстановительный потенциал системы Н}₂^{/2Н+ + 2ē равен –0,42 В. Поэтому в дыхательной цепи пе-}

ренос электронов и протонов от биосубстрата к кислороду (E⁰ = +0,82 В) начинает НАДН (E⁰ = –0,32

В).

Спиртовое брожение осуществляется так называемыми  дрожжеподобными организмами, а  также некоторыми плесневыми грибками. Суммарную реакцию спиртового брожения можно изобразить следующим образом:

Механизм реакции спиртового брожения чрезвычайно близок к гликолизу. Расхождение начинается лишь после этапа образования пирувата. При гликолизе пируват при участии фермента ЛДГ и кофермента НАДН восстанавливается в лактат. При спиртовом брожении этот конечный этап заменен двумя другими ферментативными реакциями – пируватдекарбо-ксилазной и алкогольдегидрогеназной.

В дрожжевых  клетках (спиртовое брожение) пируват  вначале подвергается декарбоксилированию, в результате чего образуется ацетальдегид. Данная реакция катализируется ферментом пируватдекарбоксилазой, который требует наличия ионов Mg и кофермента (ТПФ):

Образовавшийся  ацетальдегид присоединяет к себе водород, отщепляемый от НАДН, восстанавливаясь при этом в этанол. Реакция катализируется ферментом алкогольдегидрогеназой:

Таким образом, конечными продуктами спиртового брожения являются этанол и СО2, а  не молочная кислота, как при гликолизе.

Процесс молочнокислого брожения имеет большое  сходство со спиртовым брожением. Отличие  заключается лишь в том, что при молочнокислом брожении пировиноградная кислота не декарбоксилируется, а, как и при гликолизе в животных тканях, восстанавливается при участии ЛДГ за счет водорода НАДН.

Бета-окисление  высших жирных кислот

Процесс бета-окисления высших жирных кислот (ВЖК) складывается из следующих этапов:

1.Активация жирной кислоты

Этот этап протекает  в цитоплазме клетки при участии  ферментоа ацил-КоА-синтетазы . Он связан с использованием энергии АТФ:

CH3-(CH2)14-COOH+ ATФ- КоА-SH= CH3-(CH2)14-CO-S-KoA+ AMФ+H4P2O7

В результате ацил-КоА-синтетазной  реакции образуется ацил-КоА  (пальмитиол-КоА), представляющий собой активную форму  жирной (пальмитионовой) кислоты.

2. Транспорт ацил-КоА  в митохондрии.

Процесс окисления  жирных кислот в клетках эукариот происходит внутри митохондрий.  Однако внутренняя митохондиальная мембрана  для них непроницаема. Однако  внутренняя митохондриальная мембрана для них  непроницаема. Пэтому  в процессе эволюции  была сформирована особая система транспорта активной формы жирных кислот  из  цитозоля в митохондриальный матрикс. Важным компонентом этой системы  является витаминоподобное вещество карнитин. Будучи гидрофобным соединением , он находится в липидном бислое  внутренней митохондриальной мембраны.

Рассмотрим механизм транспорта активной формы пальмитионовой кислоты(пальмитоил-коэнзима А) в митохондрии. Из цитоплазмы пальмитоил-КоА путем  диффузии проникает  через наружную митохондриальную мембрану в межмембральное пространство.  Здесь он получает возможность взаимодействовать с молекулой  карнитина, находящиейся  во внутренней митохондриальной мембране. Эта реакция протекает на внешней поверхности мембраны, где располгается фермент карнитинацилтрансфераза I

Молекула пальмитоилкарнитина  имеет положительный заряд в  виду присутствия в ней  черещ липидный бислой  мембраны на материнскую сторону и попадает на активный центр карнитинацитилтрансферазы II. Этот изофермент располагается на внутренней поверхности мембраны. При его участии пальмитоилкарнитин подвергается распаду на карнитин и пальмитоил-КоА. Пальмитоил-КоА при этом попадает в матрикс , а освободившийся карнитин может вновь использоваться для переноса жирной кислоты в митохондрию.

 Ацитил- карнитин+ КоА-SH=карнитин+ ацитил-S-КоА

Реакция , катализируемая  карнитинацетил-трансферазой II 

Карнитинацетилтрансфераза I является регулярным ферментом , активность которого определяет  скорость процесса бета-окисления.

3. Внутримитохондриальное  окисление жирных  кислот.

В процессе окисления  жирных кислот в митохондриях происходит их распад на двухуглеродные фрагменты- остатки уксусной кислоты, связанные с коэнзимом А (ацетил-КоА) . Каждый двухуглеродный фрагмент отщепляется от молекулы жирной кислоты  (ацил-коэнзима А) . В результате одного цикла ферментативных реакций. Для полного распада 16-углеродной молекулы пальмитионовой кислоты требуется семь таких  повторяющих циклов.

Цикл распада  жирной кислоты в процессе бета-окисления  представляет собой последовательность  ферментативных реаций , в результате которой от ацил-коэнзима А отщепляется молекула ацетил-коэнзима А. 

Рассмотрим процесс  бета-окисления пальмитоил коэнзима А .В первой реакции цикла бета-окисления , пальмитоил-КоА подвергается окислению  с помощью ФАД-зависимого фермента-ацил-КоА-дегидрогеназы. Продуктом реакции является ненасыщенное производное жирной кислоты- еноил-КоА . Заместители по месту двойной связи в этом промежуточном продукте находятся в trans-положении. В тоже время природные ненасыщенные жирные кислоты представляют собой cis-изомеры.

 В  следующей реакции  еноильное производное коэнзима  А подвергается гидратации под действием фермента еноил-КоА-гидратазы. В качестве продукта реакции приэтом образуется 3-гидроксиацил-КоА. Этот метаболит далее подвергается окислению под действием НАД-зависимого фермента-3-гидроксиацил-КоА-дегидрогеназы с образованием следующего промежуточного продукта -3-кетоацил-КоА. В заключительной реакции первого цикла бета-окисления пальмитиновой кислоты 3-кетоацитил-КоА под действием фермента тиолазы распадается на два продукта –ацетил-КоА и миристоил-КоА.

Далее в аналогичный цикл превращений  вступает миристоил-КоА. В результате О распадается с образованием в качестве продуктов  реакции  молекулы ацетил-КоА и тиоэфира лауриновой кислотоы с коэнзимом А (лаурил-КоА). 
 

Процесс продолжается до техпор,пока углеводородная цепь остатка теперь уже лауриновой кислоты окончательно  не распадается на 6 молекул ацетил-КоА. Таким образом, в результате  распада пальмитиновой кислоты в процессе ее бета окисления, в качестве продукта реакции образуется 8 молекул ацетил-коэнзима-А

Образующиеся  в процессе бета-окисления в митохондриальном матриксе молекулы ацетил-КоА, далее  подвергаются распаду до конечных продуктов  в цикле трикарбоновых кислот. Учитывая это, можно рассчитывать энергетический баланс распада жирных кислот в митохондриях(на примере пальмитиновой кислоты):

В процессе 7 циклов бета-окисления  из пальмовой кислоты  образуется 7 молекул восстановленного НАД и ФАД.При их окислении  в дыхательной цепи образуются соответственно по 21 и 14 молекул АТФ.Окисление ЦТК 8 молекул ацетил-КоА сопровождается образованием еще 8*12=96 молекул АТФ.Оксление ЦТК молекул ацетил-КоА сопровождается образованием 21+14+96=131АТФ.

Учитывая, что активация жирной кислоты связана с использованием 1 молекулы АТФ в ацил-КоА синтезной реакции, общий энергетический выход при полном окислении молекулы пальмитиновой кислоты составляет 130АТФ. 

Протеолитические  ферменты

ПРОТЕОЛИТИЧЕСКИЕ  ФЕРМЕНТЫ (протеазы), ферменты класса гидролаз, катализирующие гидролиз (протео-лиз) пептидных связей. Место расщепления пептидной связи в полипептидной цепи определяется позиционной и субстратной специфичностью фермента и пространств. структурой гидролизуемого субстрата (белка или пептида).

Различают экзопептидазы, расщепляющие связи вблизи С- или N-конца цепи (соотв. карбоксипептидазы и аминопеп-тидазы)и эндопептидазы (протеиназы), гидролизующие связи, удаленные от концевых остатков (напр., трипсин). Лишь ограниченное число протеолитических ферментов обладает строгой субстратной специфичностью. К ним относят, напр., ренин, гидроли-зующий связь между остатками лейцина в положениях 10 и 11 в ангиотензиногене (предшественник ангиотензина пептида, участвующего в регуляции кровяного давления), или энтеропептидазу отщепляющую N-концевой гексапептид в трипсиногене (предшественник трипсина). Специфичность большинства протеолитических ферментов определяется в осн. структурой аминокислотного остатка, расположенного рядом с расщепляемой связью. Ферменты трипсинового типа катализируют гидролиз связей, образованных карбоксильной группой основных аминокислот (остатками лизина и аргинина). Для мн. ферментов (химотрипсин, пепсин, субтилизины и др.) важно наличие вблизи расщепляемой связи объемистых гидрофобных остатков (фенилаланина, тирозина, триптофана и лейцина). Протеолитические ферменты типа эластазы (фермент поджелудочной железы) гидролизуют связи, образованные аминокислотными остатками с небольшой боковой группой (напр., остатками аланина и серина). Место расщепления зависит от расположения пептидной связи в пространств. структуре субстрата-легче всего гидролизуются связи на р-изгибах цепи, к-рые расположены на пов-сти молекулы. Углеводные цепи в гликопротеинах могут препятствовать доступу фермента к данной связи.

Многие протеолитические ферменты прочно ассоциированы с клеточными мембранами и поэтому действуют только на определенные белки (т. наз. компартментализация). К ним относят, напр., сигнальные протеазы, участвующие в транспорте белков во внеклеточное пространство. В зависимости от локализации фермента протеолиз происходит при разл. рН. Так, протеолитические ферменты желудка (напр., пепсин, гастриксин) функционируют при рН 1,5-2, лизосомные ферменты-при рН 4-5, а протеолитические ферменты сыворотки крови, тонкого кишечника и др.-при нейтральных или слабощелочных значениях рН. Нек-рые протеолитические ферменты используют в качестве кофактора ионы металлов-Са2+, Mg2+ и др.

Дефектные и  чужеродные белки деградируют в  клетке при участии АТФ-зависимой  системы протеолиза. У эукариот (все  организмы, кроме бактерий и синезеленых водорослей) эта система включает низкомол. белок убикитин, образующий с белками-субстратами конъюгат, и протеазы, расщепляющие этот конъюгат.

Протеолитические  ферменты играют важную роль во мн. процессах, происходящих в организме, напр. при оплодотворении, биосинтезе белка, свертывании крови и фибринолизе, иммунном ответе (активации системы комплемента), гормональной регуляции. Во мн. этих случаях фермент расщепляет в субстрате лишь одну или неск. связей (ограниченный протеолиз). Активность протеолитических ферментов регулируется на посттрансляц. стадии путем активации их неактивных предшественников (зи-могенов), а также действием прир. ингибиторов ферментов (a2-макроглобулина, a1антитрипсина, секреторного панк-реатич. ингибитора и др.). Нарушения механизмов регуляции активности протеолитических ферментов-причина мн. тяжелых заболеваний (мышечной дистрофии, аутоиммунных заболеваний, эмфиземы легких, панкреатитов и др.). 

Протеолитические  ферменты применяют в медицине, напр. для коррекции нарушений пищеварения, заживления ран и ожогов и др. Их также используют для получения смесей аминокислот, применяемых для парэнтерального питания, в произ-ве гормональных препаратов и нек-рых антибиотиков, в пищ. и кожевенной пром-сти, произ-ве моющих ср-в 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

Литература:

1. Основи біохімії:Посібник для вузів/ Давидов В.В., Божков А.І.
2. Антонов В. К., Химия протеолиза, 1983
3. Орлова М. А., "Успехи химии", 1993.