Строение, свойства и применение в молекулярной биотехнологии дрожжей S.cerevisiae

МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РФ

ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ

УЧРЕЖДЕНИЕ

ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ

«САМАРСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ТЕХНИЧЕСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ»

 

 

Кафедра «Технология пищевых производств и парфюмерно-косметических продуктов» (ТППиПКП)

 

 

 

 

 

 

 

РЕФЕРАТ

Строение, свойства и применение в молекулярной биотехнологии дрожжей S.cerevisiae

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Выполнила: студентка III-ФПП-3

Барабанщикова Е.С.

                                                                                      Проверила: Борисова А.В.

 

 

 

Самара 2013

 

Cодержание

 

      Введение ………………………………………………………..................3

1. История использования дрожжей……………………………………..5
2. Строение дрожжевой клетки ……………………………………….....7
3. Физиологические свойства Saccharomyces cerevisiae………………..9
4. Половое размножение и жизненные циклы дрожжей……………...10

5. Современные достижения в биотехнологии………………………..12

Заключение…………………………………………………………..........15

Список литературы…………………………………………………….....16

Приложения……………………………………………………………….17

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Введение

 
Еще с древнейших времен человек научился использовать дрожжи в своих целях: печь хлеб, изготовлять вино и пиво. Люди «общались» с ними, не зная их природы и происхождения. Много веков человек использовал эти организмы в своих целях, даже не зная, что это - живые существа. И лишь несколько веков назад великий ученый Левенгук с помощью микроскопа увидел их. Началось изучение дрожжей, постоянно сообщалось о новых открытиях и исследованиях, которые продолжаются и по сей день.  
Начиная писать этот реферат, я задала себе такой вопрос: «Что мне известно о дрожжах?» И, подумав, поняла, что практически ничего. В природе нашей планеты много загадок, и, конечно, жизнь на Земле сложна и разнообразна. И мне стало интересно, почему дрожжи, так часто встречающиеся в хозяйстве, заслужили внимание многих ученых. Что особенного в этих организмах? 

Основное свойство дрожжей, которое всегда было привлекательно для человека- это способность к образованию сравнительно больших количеств спирта из сахара. Первое упоминание о получении спиртных напитков в Египте, так называемой «бузы» можно считать началом современного пивоварения (6000 год н.э.) Этот напиток получали в результате сбраживания пасты, получаемой при раздавливании и растирании проросшего ячменя. Из Египта эта технология попала в Грецию, а оттуда - в Древний Рим.  
Виноделие, хлебопечение и пивоварение существуют уже несколько тысячелетий. Естественно, было выделено множество видов заквасок и прочего, но мысль, что дрожжи - виновники брожения пришла в головы людям лишь в 19 веке. А 20 век вместе с сильным ростом промышленности увеличил область использования дрожжей. Они стали выращиваться в больших количествах в качестве источника витаминов и белка для сельскохозяйственных животных. Также, дрожжи - основной источник технического этанола. С помощью дрожжей сейчас получают большой спектр веществ, к ним относятся витамины, различные полисахариды, разнообразные ферменты, используемые в пищевой промышленности, глицерин.  
Благодаря этому реферату я хочу подробно изучить дрожжи, рассмотреть их жизненные циклы, узнать, познакомиться с историей развития знаний о этих организмах. Я считаю, что любое живое существо в этом мире по-своему интересно и каким-либо образом отличается от других организмов. Изучение биологии дрожжей поможет мне расширить свой кругозор, узнать что-то новое. 

    Актуальность: так как хлеб является неотъемлемой частью нашего ежедневного рациона, данная тема является очень актуальной в настоящее время.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

1.История использования дрожжей

 

Виноделие, пивоварение и хлебопечение существуют уже несколько тысячелетий. Естественно, что за это время были селекционированы сотни видов заквасок, которые используются для приготовления самых различных сортов вина и пива. Но лишь в начале XIX века были высказаны предположения, что за спиртовое брожение, вызываемое этими заквасками, ответственны присутствующие в них дрожжи, увиденные впервые в 1680 г. Антони ван Левенгуком. Эти дрожжи были описаны в 1837 г. Мейером, который дал им название Saccharomyces. Окончательным доказательством роли дрожжей в сбраживании сахаров считается работа Пастера, опубликованная им в 1866 г. К концу XIX века стало известно, что сахаромицеты, выделенные из различных заквасок и различных сортов вина и пива, различаются по физиологическим свойствам, например, по способности к сбраживанию различных сахаров. В дальнейшем на основании таких физиологических различий в роде Saccharomyces было описано несколько десятков видов. Однако в последние годы методами молекулярной и генетической таксономии было показано, что большинство этих «видов» на самом деле представляют собой различные физиологические расы нескольких близких биологических видов, главным образом Saccharomyces cerevisiae. Это такие виды, как, например, Saccharomyces vini, S. ellipsoides, S. oviformis, S. cheresiensis, S. chevalieri и десятки других, которые сейчас переведены в разряд синонимов S. cerevisiae. Большинство этих видов - это селекционированные веками расы, то есть такой же продукт человеческой деятельности, как сорта культурных растений.

В природе их найти иногда просто невозможно. Однако недавно Г.И. Наумов обнаружил, что на Дальнем Востоке распространены дикие популяции S. cerevisiae в сокотечениях дуба. Он предположил, что Дальний Восток - центр распространения этих дрожжей. На протяжении нескольких тысяч лет человечество совершенствовало технологию изготовления вина, пива и хлеба, доводя ее до уровня искусства и получая все более изысканные продукты. Новый этап в развитии бродильных процессов начался после работ Пастера, Коха и других корифеев микробиологии, которые ввели в практику метод чистых культур. Тем не менее до конца XIX века дрожжи применялись лишь в виноделии, пивоварении и хлебопечении. Двадцатый век, с его безудержным развитием промышленности, резко расширил и области применения дрожжей. Они стали выращиваться в больших масштабах в качестве источника белка и витаминов для сельскохозяйственных животных. Дрожжи - основной источник технического этанола. С помощью дрожжей сейчас получают большой спектр соединений, использующихся в разных областях человеческой деятельности.К ним относятся витамины, различные полисахариды, липиды, которые могут служить заменителями растительных масел, разнообразные ферменты, используемые в пищевой промышленности. Развитие генетической инженерии позволило использовать легко культивируемые дрожжи для получения многих полезных веществ животной и растительной природы, например инсулина.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

2.Строение дрожжевой клетки

Дожжевая клетка имеет все основные структуры, которые присущи любой эукариотической клетке, но в то же время она обладает особенностями, свойственными грибам, а именно, сочетанием признаков как растительной, так и животной клеток: клеточная стенка у них ригидная, как у растений, но в клетке отсутствуют хлоропласты и накапливается гликоген, как у животных (приложение 1).

Компоненты дрожжевой клетки:

Ядро

В дрожжевой клетке в фазе между делениями всегда имеется только одно ядро. В световом микроскопе его можно увидеть после специальной окраски или с помощью фазово-контрастного устройства при высоких разрешениях. На электронно-микроскопических снимках ультратонких срезов дрожжевых клеток ядро выглядит как более или менее округлая органелла, окруженная двойной мембраной. В ней есть поры в виде округлых сквозных отверстий, которые образуются в результате слияния двух ядерных мембран. Однако ядерные поры - не просто отверстия, они заполнены сложноорганизованными структурами, которые называют комплексом пор ядра. Считается, что основная функция ядерных пор - транспорт готовых рибосомных субъединиц в цитоплазму. Ядерная оболочка многофункциональна, но в основном играет роль барьера, отделяющего содержимое ядра и регулирующего транспорт макромолекул между ядром и цитоплазмой. Основные функциональные единицы ядра - молекулы ДНК, несущие основную генетическую информацию о клетке. ДНК составляет основную часть хроматина - основного компонента ядра. Число хромосом в ядре разных видов дрожжей может быть различным, оно колеблется от 2 до 16.

Митохондрии

В митохондриях имеется собственная митохондриальная ДНК (мДНК), а также весь аппарат белкового синтеза, включая матричную РНК и 70S рибосомы (в отличие от 80S рибосом в цитоплазме). мДНК у дрожжей составляет 5-20% от всей ДНК клетки. Число митохондрий в одной дрожжевой клетке варьирует в пределах 1-20 в разные периоды роста и в зависимости от условий. Как правило, 1-2 митохондрии в клетке более крупные, чем остальные и имеют разветвленную форму. Реконструкция ультратонких срезов клетки позволяет предположить, что в некоторых случаях (в подготовительный период почкования) клетка содержит всего одну вытянутую и сильно разветвленную митохондрию. Митохондрии способны к самовоспроизведению.

Цитоплазаматическая мембрана

На поперечном срезе под электронным микроскопом мембрана у дрожжей выглядит как трехслойная структура. Она представляет собой два слоя фосфолипидов, в которые погружены белковые молекулы, то есть построена по общему для всех клеточных мембран принципу. Однако, имеются различия, касающиеся химического состава. У Saccharomyces cerevisiae основными фосфолипидами мембран являются лецитин, фосфатидилэтаноламин и фосфатидилсерин. На их долю приходится около 90% всех липидов мембраны. В состав мембраны дрожжей входят стероиды - эргостерол, зимостерол и др. Белки представлены в основном ферментами, которые участвуют в трансмембранном переносе веществ, расщеплении полисахаридов и синтезе внеклеточных структур. . Функции цитоплазматической мембраны многообразны: регуляция биосинтеза клеточной стенки, активный транспорт транспорт в клетку специфических молекул органических веществ, транспорт ионов K+ и Na+и др.

Вакуоли

В фазово-контрастном микроскопе в клетках дрожжей хорошо видны светлые и прозрачные структуры круглой формы. Это вакуоли ( Обычно их 1-3 в клетке). Каждая вакуоль окружена одинарной мембраной и содержит различные ферменты, липиды, низкомолекулярные продукты метаболизма (аминокислоты), ионы металлов. В вакуолях сосредоточена большая часть ионов калия. Иногда в вакуоли видны «пляшущие» за счет броуновского движения плотные гранулы. Это так называемые метахроматические гранулы, «пляшущие тельца» (dancing bodies), или волютин. Гранулы эти состоят из полимеризованных остатков фосфатов, а по периферии они покрыты комплексными соединениями из РНК, белков и липидов. Волютин - это резерв полифосфатов в клетке. Основная функция вакуолей - разобщение процессов синтеза и распада белков и нуклеиновых кислот. Они выполняют также роль депо для хранения некоторых запасных веществ и ферментов, участвуют в регуляции тургорного давления. Также в клетке присутствуют: клеточная стенка, которая защищает протопласт от осмотического разрыва и придает клетке определенную форму; капсула (слизистый полисахаридный чехол вокруг клетки), цитоплазма и липиды. Дрожжевая клетка под электронным микроскопом: цм – цитоплазматическая мембрана, кс – клеточная стенка, к – капсула, я – ядро, ям – ядерная мембрана, мх – митохондрии, л – включения липидов. Снимок получен методом ультратонких срезов (приложение 2).

 

 

3.Физиологические свойства Saccharomyces cerevisiae

 

Известно, что дрожжи Saccharomyces cerevisiae обладают способностью сбраживать сахара при недостатке кислорода в среде и окислять те же сахара в цикле дыхания при достаточном количестве кислорода.

Они сбраживают и усваивают глюкозу, галактозу, сахарозу, мальтозу, частично рафинозу и простые декстрины солодового сусла, не сбраживают и не усваивают лактозу, пентозы (ксилозу и арабинозу), крахмал, клетчатку. Источником азотного питания для них служат аминокислоты и аммонийные соли.

Оптимальная температура развития 30°С, лишь некоторые культуры выдерживают температуру до 35-37°С. Дрожжи данного вида хорошо переносят кислотность среды до 10 -12°Н. Оптимальное значение рН для них лежит в зоне 4,5-5. Добавление в питательную среду сахара (свыше 15%) или соли (свыше 1 - 1,5%) отрицательно влияет на жизнедеятельность дрожжей. Угнетающе действует на них и этиловый спирт в концентрации 2-5% об. При содержании 12-14% спирта брожение в большинстве случаев прекращается. С повышением температуры угнетающее действие спирта возрастает.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

4.Половое размножение  и жизненные циклы дрожжей 

Половое размножение - это сложная цепь событий, включающая контакт двух гаплоидных клеток, их слияние (сначала слияние цитоплазмы - плазмогамия, а затем сразу же или со значительной задержкой слияние ядер - кариогамия), образование диплоидной зиготы, ядро которой затем либо делится мейотически с восстановлением гаплоидного состояния, либо дает начало диплоидному поколению клеток. Таким образом, половое размножение связано со сменой ядерных фаз. У дрожжей, как и у всех грибов, чередование ядерных фаз сопряжено с образованием половых гаплоидных спор - аскоспор или базидиоспор. 
Весь ход событий в развитии организма от одной стадии до этой же стадии в следующем поколении составляет жизненный цикл, или онтогенез (приложение 3). Полный жизненный цикл включает вегетативную стадию, в течение которой клетки размножаются при помощи митотического деления, и половой цикл, включающий мейотическое деление ядра. У мицелиальных грибов вегетативное размножение занимает обычно одну из стадий жизненного цикла: у аскомицетов - преимущественно гаплоидную, у базидиомицетов - дикариотическую. У дрожжей вегетативное размножение может происходить в любой фазе жизненного цикла. На этом основании различают гаплоидные виды, у которых вегетативное размножение происходит в гаплоидной фазе, диплоидные виды, размножающиеся вегетативно в диплофазе, а также гапло-диплоидные, образующие стабильные как гапло-, так и диплофазы, или же смешанные популяции гаплоидных и диплоидных клеток. У дрожжей встречаются различные типы полового процесса. У большинства видов в половом процессе у дрожжей участвуют обычные соматические, то есть неспециализированные клетки. Такой тип полового процесса называется соматогамией. Существуют разновидности соматогамии: гологамия - слияние (копуляция) двух морфологически сходных соматических клеток, педогамия - слияние материнской и дочерней клетки-почки, адельфогамия - слияние сестринских клеток-почек. У некоторых видов аскомицетовых дрожжеподобных грибов половой процесс представляет собой типичную для большинства аскомицетов гаметангиогамию - копуляцию специальных клеток мицелия - гаметангиев. Копулировать могут не любые две клетки, а лишь клетки, относящиеся к различным типам спаривания. Термин «тип спаривания» используется вместо термина «пол» в том случае, когда копулирующие клетки не имеют морфологических отличий, а различаются лишь физиологически. У одних дрожжей при вегетативном размножении происходит разделение клеток на различные типы спаривания и, следовательно, в потомстве одной клетки возможен половой процесс. Такие дрожжи называют гомоталличными. У других клетки не способны переключаться с одного типа спаривания на другой, и половой процесс в потомстве одной клетки невозможен. В этом случае дрожжи называют гетероталличными.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

5.Современные достижения в биотехнологии

Дрожжи как источник белка

 

Использование микробной биомассы для обогащения кормов белком и незаменимыми аминокислотами в условиях интенсивного животноводства - одна из важных проблем будущего, так как человечество развивается таким образом, что оно вряд ли сможет обеспечить себя пищей традиционными методами. Выращивание микроорганизмов не зависит от климатических и погодных условий, не требует посевных площадей, поддается автоматизации. Дрожжи - одна из наиболее перспективных групп микроорганизмов для получения белковых кормовых добавок. Содержание белка в клетках некоторых штаммов дрожжей составляет от половины до 2/3 сухой массы, на долю незаменимых аминокислот приходится до 10% (в белках сои, богатых лизином, его содержится не многим более 6%).

Производство этанола

 

Этанол широко применяется в химической промышленности как исходное соединение для синтеза многих веществ, как растворитель, экстрагент, антифриз и т.п. Вероятно, у этанола большое будущее и как топлива в двигателях внутреннего сгорания: этанол - гораздо более экологически чистое топливо, чем бензин.

В принципе этанол можно получать из любого источника углеводов, которые сбраживаются дрожжами. Разнообразие потенциальных продуцентов тоже велико: более 200 видов дрожжей способны сбраживать глюкозу.

Крупномасштабное получение этанола в качестве топлива осуществляется в основном в Бразилии и других странах Южной Америки. В качестве источника углеводов используется сахарный тростник и маниока, в качестве продуцента этанола - Saccharomyces cerevisiae.

Перспективным сырьем для получения спирта являются отходы целлюлозно-бумажной и деревообрабатывающей промышленности. Однако, гидролизаты древесины содержат большое количество пентоз. До середины 70-х годов XX в. вообще не были известны дрожжи, активно сбраживающие пентозы. Сейчас такие виды найдены: Pachysolen tannophilus и Pichia stipitis (анаморфа - Candida shehatae). Им прочат большое будущее в производстве спирта из гидролизатов древесных отходов, соломы, торфа и т.п.

В небольших масштабах этанол можно получать и из других субстратов, например из молочной сыворотки, используя сбраживающие лактозу дрожжи из рода Kluyveromyces.

Различные продукты, получаемые из дрожжей

В последние десятилетия разнообразие биотехнологических процессов, в которых используются дрожжи, резко увеличилось. Еще более разнообразны перспективы использования дрожжей: в различных разработках, патентах и т.п. упоминается более 200 видов. Сейчас дрожжи используются для получения различных ферментных препаратов, органических кислот, полисахаридов, многоатомных спиртов, витаминов и витаминных добавок, а также во множестве других мелкомасштабных процессах.

Промышленно важные органические кислоты, продуцируемые микроорганизмами, являются либо конечными продуктами (молочная, масляная, пропионовая кислоты у анаэробных бактерий), либо интермедиатами метаболизма. Последние можно получать с помощью дрожжей. В наибольших масштабах производится лимонная кислота, в основном с помощью Aspergillus niger, с использованием в качестве субстрата мелассы. Однако, ее можно получать и с помощью дрожжей на более дешевых субстратах, таких как парафины нефти или этанол. Сейчас разработаны технологии получения и многих других кислот, например, изолимонной из Candida catenulata, фумаровой из Candida hydrocarbofumarica, яблочной из Pichia membranaefaciens и др.

Из дрожжевых полисахаридов наиболее известен пуллулан, который получают из дрожжеподобного гриба Aureobasidium pullulans. Он представляет собой β-глюкан, в котором мальтотриозные остатки соединены между собой β (1→6) гликозидными связями. Пуллулан используется в основном в пищевой промышленности в качестве пленочного покрытия. Возможно получение разнообразных по строению и свойствам полисахаридов и из других видов дрожжей. Особенно много внеклеточных полисахаридов образуют дрожжи Cryptococcus, Rhodotorula, Lipomyces.

Многоатомные спирты (глицерин, ксилит, эритрит, арабит) - широко применяются в химической и пищевой промышленности. Перспективным считается способ получения сахароспиртов, таких как глицерин, эритрит и ксилит, с использованием ксеротолерантных дрожжей рода Zygosaccharomyces. Эти дрожжи способны расти в средах с высоким осмотическим давлением, синтезируя при этом большое количество внутриклеточных полиолов, которые служат осмопротекторами. Другой способ касается получения ксилита - важного полиола для пищевой промышленности. Ксилит накапливается как побочный продукт при сбраживании ксилозы дрожжами Pachysolen tannophilus.

Многие дрожжи служат источниками для получения ферментных препаратов, которые используются в современной пищевой и химической промышленности. Из дрожжевого осадка, образующегося как отход пивоварения, получают фермент β-фруктофуранозидазу (инвертазу), расщепляющий сахарозу на глюкозу и фруктозу. Препараты инвертазы широко применяются в кондитерской промышленности для предотвращения кристаллизации сахарозы, для приготовления инвертных сиропов. С помощью культур Kluyveromyces marxianus получают β-галактозидазу, которая применяется в молочной промышленности. Дрожжи Yarrowia lipolytica используются для получения липолитических ферментов, представляющих большой интерес для многих отраслей хозяйства. Липазы используются в сыроварении, в косметической промышленности, при выделке мехов и кож, в моющих средствах. В последние годы разработано множество способов получения самых различных ферментов из дрожжей: пектиназ из Saccharomycopsis fibuliger, амилаз из Schwanniomyces occidentalis, ксиланаз из Cryptococcus laurentii, гидролаз L-α-амино-ε-капролактама из криптококков, алкогольоксидазы из Pichia burtonii, оксидазы D-аминокислот из Trigonopsis variabilis, фенилаланинаммиаклиазы из Rhodotorula glutinis. Это лишь немногие примеры получения дрожжевых ферментных, спектр которых в последние годы постоянно расширяется.

Применение дрожжей как источников витаминов началось в 1930-е годы. Одним из первых промышленных процессов получения витаминов было выделение эргостерина из Saccharomyces cerevisiae с последующим облучением ультрафиолетом для перевода в витамин D. Затем у дрожжей была открыта способность к сверхсинтезу некоторых витаминов группы В, в частности рибофлавина. Некоторые красные дрожжи используются для получения каротиноидов, в частности β-каротина, служащего предшественником витамина A, астаксантина, используемого в качестве кормовой добавки в рыбоводстве. Кроме производства индивидуальных витаминов уже много лет в мире практикуется получение автолизатов и гидролизатов дрожжей, питьевых дрожжей, которые используются как источник витаминов и как вкусовые добавки.

Достижения современной биотехнологии создают реальные условия для наращивания высокими темпами микробиологического производства на основе индустриальных, а не сельскохозяйственных источников сырья.

К настоящему времени в микробиологической промышленности завершена проработка конкретной программы перспективного развития отрасли. В ней содержатся меры по дальнейшей интенсификации действующих предприятий, разработке и внедрению новых высокопродуктивных штаммов, более эффективному использованию основных производственных фондов, снижению норм расхода сырья, экономному потреблению топливно-энергетических ресурсов. Для выполнения напряженных заданий текущей пятилетки осуществляются меры по усилению капитального строительства. Большое внимание уделяется более полному использованию имеющихся внутренних резервов повышения эффективности производства и качества всей работы. Отрасль располагает необходимыми возможностями для того, чтобы успешно справиться с поставленными задачами.

Заключение

Дрожжи – воистину удивительные обитатели нашей планеты. Незаметные вооруженному глазу, они окружают нас везде, не говоря уже об огромном их значении в жизни человека. Много ученых посвящали жизнь этим организмам, благодаря чему были открыты новые виды дрожжей, расширено их применение. Мир дрожжей настолько разнообразен, что на данный момент не существует их общей систематики: есть только несколько относительных делений на определенные группы, но и они неидеальны. Ученые до сих пор работают над систематикой дрожжей. Работая над этим рефератом, я прочитала много интересных книг об этих организмах, изучила работы некоторых современных ученых. Благодаря своей работе я нашла полезную информацию о распространении дрожжей, что, несомненно, пригодится в жизни.. Наука о дрожжах еще очень молодая и она продолжает развиваться. Дрожжи не относятся к числу организмов, полностью изученных: в их биологии есть нераскрытые тайны. Я надеюсь, что мой реферат не останется незамеченным и поможет другим ученикам узнать больше об таких интересных и в какой-то степени таинственных организмах – дрожжах.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Список используемой литературы

1. Бабьева И.П., Чернов И.Ю. «Биология дрожжей» Москва:, 2004. 

2. Исламмагомедова Э.А., Исламова Ф.И. « О некоторых физиолого-биохимических свойствах дрожжей рода Saccharomyces в зависимости от состава питательной среды» // Вестник ДГИД РАН. 2001. – № 9. – С. 66–68.

3. http://bio-x.ru/articles/produkty-sinteza-gribov-i-perspektivy-ispolzovaniya-drozhzhey
4. http://www.owoman.ru/dom/dostizhenija_sovremennoi_biotehnologii.html

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Приложения

 

Приложение 1.

 

 

Приложение 2.

 

Приложение 3.