Федеральное агентство по образованию 

   ГОУ ВПО «САРАТОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ  УНИВЕРСИТЕТ ИМЕНИ Н.Г.ЧЕРНЫШЕВСКОГО» 
 
 
 

   Кафедра аналитической химии

   и химической экологии 
 
 

   Массивы потенциометрических сенсоров

   для раздельного определения  антибиотиков пенициллинового ряда

   КУРСОВАЯ  РАБОТА

   студента  4  курса   Института химии 

   Снесарева Сергея Владимировича 
 
 

   Научный руководитель

   д. х. н., проф.           ____________  Е.Г. Кулапина 
 
 

   Зав. кафедрой

   д. х. н., проф., засл. деят. науки        ___________   Р.К. Чернова 
 
 
 
 
 

   Саратов  2009

   Содержание  работы

Дата выдачи ______________________________________________________

Срок выполнения __________________________________________________

   Преподаватель д.х.н., проф.                       ___________      Е.Г. Кулапина 

   Список  сокращений:

   ИСЭ – ионоселективный электрод;

   ПВХ – поливинилхлорид;

   ДБФ – дибутилфталат;

   ТDA – тетрадециламмоний бромид;

   КПАВ  – катионные поверхностно-активные вещества;

   ТАА – тетраалкиламмоний;

   Hal - галоген

   Pen – бензилпенициллина натриевая соль;

   Am – ампициллина натриевая соль;

   Ox – оксациллина натриевая соль;

   ЭАК – электродно-активная компонента;

   ЭАС – электродно-активное соединение;

   ЖК  – жидкоконтактный электрод;

   ИНС – искусственная нейронная сеть; 
 
 

   Введение

   Достижение высокой селективности к определяемому компоненту — одна из главных задач, решаемых при разработке новых методов анализа и аналитических приборов. В рамках выполнения этой задачи разработано большое число электрохимических сенсоров, в частности потенциометрических, таких как ионоселективные электроды, ионоселективные полевые транзисторы и т.д. Уже десятилетия назад прогресс в области ионоселективных электродов начал существенно замедляться, что связано с объективными трудностями создания новых высокоселективных сенсорных материалов. В то же время достоинства и преимущества потенциометрических сенсоров как простых и эффективных аналитических инструментов стимулируют дальнейшие исследования в этой области. Одним из новых направлений, появившимся немного более 10 лет назад, стала разработка мультисенсорных систем типа «электронный язык».

   Первые  мультисенсорные системы, а также  многие системы типа «электронный язык», предложенные к настоящему времени, основаны на использовании ионоселективных электродов или сенсоров, близких к ним по принципам функционирования [1, 2].

   Сенсоры представляют собой привлекательный  аналитический инструмент для анализа растворов благодаря таким характеристикам, как экспрессность анализа, возможность миниатюризации и автоматизации, простота их применения и невысокая стоимость.

   Ионоселективные сенсоры широко используются для  анализа растворов, хотя, как правило, их применение ограничено случаями, когда концентрации мешающих ионов в анализируемом растворе невысоки, а электродная функция описывается уравнением Нернста. Более широкое внедрение этих электродов в практику анализа существенно ограничивается недостаточной селективностью к определяемому иону в присутствии других ионов и веществ, что является распространенной ситуацией при анализе реальных объектов. Существенный прогресс в создании новых сенсорных материалов наблюдается в области синтеза новых органических веществ, используемых в качестве ионофоров в полимерных пластифицированных мембранах. Тем не менее в настоящее время, как и почти 100 лет назад, наиболее селективным и широко применяемым потенциометрическим сенсором остается стеклянный pH-электрод [3].

   При работе с сенсорами, использующими  другие принципы детектирования, также сталкиваются с проблемой недостаточной селективности определения веществ в многокомпонентных средах, что очень часто тормозит их практическое аналитическое применение.

   Одним из возможных путей решения проблемы многокомпонентного анализа реальных сред является разработка и использование мультисенсорных систем вместо отдельных сенсоров.

   Целью настоящей работы является создание мультисенсорной системы  для  анализа антибиотиков пенициллинового ряда. 

1. Мультисенсорные системы в анализе

   (литературный обзор)

   Источником  вдохновения для разработки химических мультисенсорных систем явилась идея имитировать строение и свойства биологических сенсорных систем, а именно органов обоняния млекопитающих. Биологические принципы первоначально пытались реализовать в системах для анализа газов — электронных носах, а позднее для создания анализаторов жидкостей — электронных языков.

   Биологическая система обоняния обладает исключительно высокой чувствительностью: человек способен распознавать до десяти тысячи веществ в количестве до 40 молекул [4]. Предел чувствительности человеческого носа к некоторым веществам составляет несколько миллиардных долей, а у животных может быть еще ниже. Такие возможности обоняния обусловлены сочетанием большого числа рецепторов (несколько миллионов рецепторов нескольких сотен типов), обладающих невысокой селективностью, с обработкой сигналов этого массива рецепторов в периферической и центральной нервной системе.

   Организация функционирования органов вкуса аналогична системе обоняния, хотя количество рецепторов вкуса у человека значительно меньше, чем обонятельных. Традиционно все вкусовые ощущения разделяют на четыре основных вкуса: сладкий, соленый, кислый и горький. В последнее время часто используется еще одна, пятая, характеристика вкуса — «вкусность» (вкус, например, глютамата натрия) [4].

   Взаимосвязь между структурой и химическими  свойствами многих веществ с их вкусом в настоящее время изучена недостаточно, также как и многие эффекты, например, взаимодействие между веществами с различными типами вкуса или повышение предела чувствительности при одновременном присутствии веществ с разными типами вкуса. Предел обнаружения вкуса, как правило, выше, чем запаха, однако дифференциальная чувствительность биологических сенсорных систем детектирования вкусов и запахов сравнима. Таким образом, механизмы функционирования чувства вкуса и обоняния аналогичны, хотя обоняние более развито в живой природе, например, у млекопитающих и человека [5].

   Массив невысокоселективных сенсоров и многомерные методы обработки данных были применены при разработке мультисенсорных систем для анализа жидкостей — электронных языков. Система «электронный язык» работает в разнообразных жидких средах также, как и биологическая сенсорная система. Однако чувствительность и пределы обнаружения искусственных языков могут значительно превосходить аналогичные параметры их биологического прототипа, поскольку материалы сенсоров искусственных языков совсем не похожи на биологические и способны значительно расширить аналитические возможности системы [6].

   Наиболее  характерной общей чертой систем типа «электронный язык» является сочетание массива сенсоров с невысокой селективностью и обработки данных методами распознавания образов. Сенсорные материалы электронного языка, однако, практически не имеют между собой ничего общего, причем сенсоры для языков многочисленнее и намного разнообразнее. В отличие от биологического языка электронный язык может работать в любых средах, в том числе в опасных для живых существ.

   Важно отметить, что в искусственных системах и для анализа газов, и для анализа жидкостей используются только организационные принципы биологических сенсорных систем, поэтому проводить прямые параллели между возможностями искусственных и биологических систем нельзя [4,6].

1. 2 Математические  методы в анализе

мультисенсорными  системами

   Большинство ионоселективных электродов (и сенсоров, основанных на других принципах) обладают невысокой селективностью при анализе многокомпонентных растворов. Влияние мешающих ионов на отклик ионоселективного электрода традиционно описывается уравнением Никольского (или более сложным, но в принципе аналогичным ему):

                                       (1)

где Е разность потенциалов (ЭДС) электрохимической ячейки, состоящей из электрода сравнения и ионоселективного электрода; Е⁰ — стандартный потенциал; R — универсальная газовая постоянная; Т абсолютная температура; F — константа Фарадея; а_i и a_j — активность основного и мешающего ионов, соответственно; К_i/j коэффициент селективности электрода к основному иону i в присутствии мешающего иона j; z_i и z_j -заряд основного и мешающего ионов, соответственно [7].

   Таким образом, отклик электрода с невысокой селективностью определяется соотношением концентраций   основного   и   мешающего ионов.   Если   a_i   и сравнимы по величине, отклик электрода становится нелинейным. Нелинейная градуировочная кривая, если она воспроизводима, также может быть использована в аналитических целях, при этом для определения параметров уравнения Никольского необходимо применять электрохимическую систему, включающую более одного ионоселективного электрода. Очевидно, что число электродов в таком случае должно быть не меньше, чем число определяемых ионов. В рамках приведенной выше логики для преодоления недостаточной селективности ионоселективного электрода в присутствии мешающих ионов было предложено использовать для анализа многокомпонентного раствора наборы электродов вместо отдельных сенсоров. При этом отклик каждого электрода должен описываться уравнением Никольского, соответствующим отдельно взятому иону в многокомпонентном растворе. Решение системы таких уравнений позволяет определить некоторые параметры отклика электродов в многокомпонентных растворах, такие как стандартный потенциал, коэффициенты электродной селективности и/или угловой коэффициент электродной функции. Найденные параметры могут быть использованы в дальнейшем для определения концентраций ионов в растворах неизвестного состава. Известно, что многие параметры отклика ионоселективного электрода (например, предел обнаружения или коэффициент электродной селективности) зависят от условий и методов их измерения [3,7]. Многочисленные попытки разработать стандартные методы их определения к успеху не привели. 

   Системы типа «электронный язык» могут включать в себя любые химические сенсоры для анализа жидкостей независимо от того, на каком физическом принципе они работают [6].

   Первой  мультисенсорной системой типа «электронный язык» был сенсор вкуса, предложенный японскими учеными из Университета Кюсю в начале 1990-х годов. Эта система содержит восемь потенциометрических сенсоров с липидными мембранами на поливинилхлоридной матрице [8], обладающими перекрестной чувствительностью к веществам с различным вкусом. С целью миниатюризации сенсорной системы были сконструированы тонкопленочные сенсоры на основе тех же чувствительных материалов, но реализующие другой принцип детектирования сигнала. Тонкопленочные сенсоры изготавливали нанесением пленок Ленгмюра—Блоджетт на полупроводниковую подложку. В качестве трансдъюсеров (преобразователей) использовали полевые транзисторы [9], потенциометрические сенсоры с лазерным сканированием и изменяемым поверхностным фотопотенциалом [10].

   Электронный язык на основе потенциометрических сенсоров, в том числе и с неорганическими мембранами, разработан и активно исследуется уже более 10 лет в Лаборатории химических сенсоров Санкт-Петербургского государственного университета [1, 11]. Ю. Власов и сотрудники совместно с итальянскими коллегами из университета «Тор Вергата» (Рим) впервые предложили и сам термин «электронный язык» применительно к системам перекрестно-чувствительных сенсоров с обработкой данных методами распознавания образов. Для изготовления сенсоров использовался широкий круг мембранных материалов, в том числе халькогенидные стекла, допированные различными металлами, пластифицированные полимеры, содержащие активные вещества, а также поликристаллические композиции [1, 12]. Всего было исследовано несколько сотен различных сенсоров, из которых для конструирования электронного языка отбирались обладающие наиболее высокой перекрестной чувствительностью. Как правило, электронный язык включает от 5 до 30 сенсоров в зависимости от аналитической задачи. Разработаны также микросенсоры на основе тонких нанопленок халькогенидных стекол с использованием новой технологии — абляции под действием импульсного лазера (PLD) [13]. Состав и свойства полученных пленочных сенсоров и систем в целом мало отличаются от характеристик объемных халькогенидных стекол, из которых изготавливались сенсоры.

   Разработан  проточно-инжекционный вариант системы  типа «электронный язык» с мультисенсорным  детектированием, включающий от 3 до 11 сенсоров [14]. К достоинствам этой мультисенсорной системы относятся возможность проводить многократные и часто повторяющиеся измерения в автоматическом режиме благодаря многоканальному сенсору, а также уменьшенный объем анализируемой пробы. Объем пробы составляет, как правило, 150—500 мкл, но может быть уменьшен до 50 мкл.

   Описан  электронный язык на основе потенциометрических  сенсоров, изготовленных из пленок металопорфиринов на подложке из стеклоуглерода [15]. Металлопорфирины с различными катионами металлов [Mn(III), Fe(III), Co(II), Ni(II)], а также тетрафенилпорфирин наносили на подложку методом электрополимеризации. В работе [16] предлагается электронный язык на основе уже существующих и коммерчески доступных ионоселективных электродов.

   Сущность  измерений массивом потенциометрических  сенсоров в целом аналогична таковой при работе с отдельными ионоселективными электродами: поочередно измеряется ЭДС электрохимических ячеек, каждая из которых включает один рабочий сенсор из массива и электрод сравнения. Для измерений применяют многоканальные вольтметры с высоким входным сопротивлением (не менее 10¹² Ом). Как правило, управление процедурой измерения и запись данных осуществляются с помощью компьютера.

   Для детектирования сигнала в мультисенсорных системах используется и другой электрохимический метод — вольтамперометрия [17]. В вольтамперометрическом электронном языке реализуется та же идея сочетания неспецифичных электрохимических сигналов и их обработка методами распознавания образов. Полярографическая волна становится неселективным аналитическим сигналом в тех случаях, когда несколько компонентов анализируемого раствора окисляются при одинаковых или близких значениях потенциала. В качестве материала рабочих электродов применяются металлы: платина, золото, иридий, родий и рений.

   Предложена  мультисенсорная система на основе электродов, модифицированных монофталоцианинами кобальта и меди и бисфталоцианинами европия, гадолиния, лютеция и замещенным бисфталоцианина празеодима [18]. Модифицированные электроды готовят либо нанесением пленок Ленгмюра—Блоджетт на стеклянную подложку, либо по технологии приготовления намазного электрода из смеси графитовой пасты с 15%(об.) фталоцианина. Метод квадратноволновой импульсной вольтамперометрии был выбран авторами [17] для измерений с массивом электродов, изготовленных из благородных металлов. При этом проводится сканирование потенциалов в диапазоне –0,4÷+0,6 В с шагом 100 мВ, в каждой точке записывается 20 значений силы тока. Измерения с помощью массива модифицированных электродов осуществляли также методом циклической вольтамперометрии со скоростью сканирования потенциалов 0,1 В/с [18].

   Дизайн  электронного языка, основанный на оптических сенсорах, предложен авторами в работе [19]. Сенсоры представляют собой зерна полиэтиленгликоль-полистирольной резины, дериватизированные индикаторными молекулами, в качестве которых были выбраны флуоресцеин, о-крезолфталеинкомплексон, ализаринкомплексон и борный эфир галактозы, дериватизированной резоруфином (оксазиновый краситель). Отклик сенсоров измеряется относительно контрольного сенсора, который в данном случае представлял собой резиновое зерно с терминальным ацетилированным амином.

   В качестве сенсорных материалов для  электронного языка предложено использовать различные токопроводящие полимеры, такие как полианилин, полипиррол, а также стеариновую кислоту и их смеси [20]. Полимерные пленки Ленгмюра—Блоджетт наносили на металлическую подложку. Измерения с помощью полученных электродов проводили методом импедансной электрической спектроскопии. Комплексное сопротивление измеряли при комнатной температуре (20±3) °С в диапазоне частот 20—10⁵ Гц. Применение импедансной спектроскопии основывается на том факте, что область низких частот импедансного спектра описывает свойства двойного электрического слоя, который образуется в результате адсорбции веществ, содержащихся в анализируемом растворе, на поверхности сенсоров и, следовательно, может нести полезную аналитическую информацию. 

   «электронный язык»

   Мультисенсорные системы типа «электронный язык»  могут применяться для решения разнообразных аналитических задач, как традиционных для химических сенсоров — количественный анализ растворов, так и для нетипичных — распознавание, идентификация и классификация. В последнее время большое внимание уделяется использованию электронных языков для мониторинга промышленных процессов и контроля качества, заключающегося как в определении концентраций ключевых компонентов, так и в оценке соответствия общего качества процесса или продукта стандарту. Чрезвычайно востребовано искусственное определение вкуса с помощью аналитического инструмента в пищевой и фармацевтической промышленностях, что представляется одним из интереснейших будущих практических приложений электронных языков.

   Самыми  распространенными объектами анализа  с использованием электронных языков являются пищевые продукты. Описано применение электронных языков для анализа фруктовых соков [2,21], молока и молочнокислых продуктов [2], минеральных вод [22], прохладительных напитков [22], чая [23,24], вина [15,25, 26] и других продуктов питания. Как правило, электронный язык используется для распознавания и классификации перечисленных продуктов, реже — для их количественного анализа. Описано применение электронного языка для определения концентраций неорганических катионов и анионов, анионов органических кислот, аминокислот, полифенолов, а также таких параметров, как общая или титруемая кислотность [27], количество бактерий в портящемся молоке. Продемонстрирована возможность использования электронного языка для мониторинга и определения концентраций ключевых компонентов биотехнологических процессов производства пищевых продуктов, таких как закваска для сыров, мизо и сакэ [28].

   Мультисенсорные системы применяли для мониторинга  и определения основных компонентов в питательных средах, используемых для выращивания микроорганизмов [29], для мониторинга процесса очистки питьевой воды [30], для определения содержания неорганических анионов и катионов переходных металлов в модельной грунтовой, шахтной и морской водах [12], а также в дыму мусоросжигательных заводов (после поглощения дыма жидкостью) [14], для количественного анализа диализирующих растворов, используемых в аппаратах «искусственная почка» и др.

   Продемонстрирована  возможность использования сенсорных  систем для определения микробиологической активности, в частности для контроля за чистотой (загрязнением) технологического оборудования для микробиологических процессов [31] и для выявления воспалительных заболеваний (мастита) у коров [32]. В этих случаях детектирование микробиологических эффектов осуществляется путем отслеживания интегрального изменения химического состава среды с помощью сенсоров системы «электронный язык». При этом точность результата (правильность определения наличия заболеваний) составляет около   95 %, а в случае детектирования мастита у коров не зависит от породы, возраста, условий кормления и содержания животных.

   Наличие корреляции между откликом электронного языка и человеческим восприятием вкуса — важное и очень перспективное свойство таких систем с практической точки зрения. Первые коммерческие электронные системы типа «электронный язык» уже доступны в настоящее время. Но это направление только развивается, а значительная часть знаний все еще остается эмпирической. Необходимы новые усилия по изучению механизма отклика сенсоров к различным аналитам, созданию новых сенсорных композиций, а также по разработке методик практического применения электронного языка для решения конкретных задач. В наше время и, очевидно, в ближайшие годы в этой области происходит и будет происходить бурный прогресс.

   Таким образом, исследования сенсорных систем типа «электронный язык» являются актуальными и активно развиваются, а работ по данной тематике публикуют все больше ученых из разных стран. 

2. Экспериментальная часть

2.1.  Аппаратура, реактивы и растворы

1. Весы аналитические общего типа WP-11 второго класса точности с наибольшим пределом взвешивания 100 г по ГОСТ 24104-88Е;
2. Иономер И-160-М;
3. Магнитная мешалка типа ММЗ-М;
4. Хлорид серебряный электрод ЭВМ-1МЗ;
5. Металлический экран для защиты электролитической ячейки от наведенных токов с заземлением;
6. Солевой мостик, заполненный насыщенным раствором хлорида калия (поливинилхлоридная трубка l=30 см, d=3 мм по ГОСТ 19034-72);
7. Колбы 2-25-2 по ГОСТ 1770-74;
8. Пипетки 1а-2-1, 1а-2-2, 2а-2-5, 2а-2-10 по ГОСТ 29227-91;
9. Стакан В-1-50, СВ-24/10 ПО ГОСТ 25336-82;
10. Чашки Петри по ГОСТ 25336-82, d= 37, 67, 97 мм;
11. Эксикатор исполнения 2-190 по ГОСТ 25336-82;
12. Вода дистиллированная ГОСТ 6709-77;
13. NaCl, стандартный раствор для внутренних растворов электродов с концентрацией 1×10^-3 М готовили растворением точной навески соли;
14. Дибутилфталат по ГОСТ 8728-88;
15. Поливинилхлорид С-7059-М «ч.д.а.» по ГОСТ 14332-78;
16. Тетрадециламмоний бромид С = 1×10^-3 М готовили по следующей методике: навеску ТДА массой 0,0165 г. количественно переносили в мерную колбу на 25 мл, растворяли в хлороформе, доводили до метки и тщательно перемешивали;
17. Растворы антибиотиков пенициллинового ряда исходной 1×10^-3 М концентрации готовили растворением соответствующих навесок веществ в дистиллированной воде в колбах на 25 мл. Рабочие растворы с концентрацией 1×10^-2 - 1×10^-5 М.

   2.2. Синтез электродноактивных  веществ, 

   изготовление  мембран и электродов

   Синтез  ЭАС β-лактам-КПАВ осуществляли по реакции обмена, представленной на схеме:

КПАВHal + β-lac^-Na⁺ Û КПАВ⁺ β-lac^- + NaHal

     В делительную воронку помещали раствор КПАВ в хлороформе              (V = 5 мл, С =  1×10^-3 М) и водные растворы соответствующей  натриевой соли антибиотика (V = 2 мл, С =  1,5×10^-2 М). Смесь интенсивно встряхивали в течение двух часов, хлороформный слой отделяли от водной фазы в предварительно взвешенный бюкс и оставляли под тягой до полного испарения хлороформа.

В работе использовали следующие растворители: хлороформ «ч», циклогексанон «ч», дибутилфталат «ч.д.а.».  В качестве инертной матрицы для изготовления мембран использовали поливинилхлорид марки С-70, «ч».

   Для синтеза ЭАВ и приготовления  мембран использовали следующие вещества (табл. 1).

   Таблица 1. Вещества, используемые при синтезе мембран

   Объектами исследования являлись натриевые соли бензилпенициллина (Pen), ампициллина (Am), оксациллина (Ox) фармакопейной чистоты в виде порошков (табл. 2).

   Таблица 2. Названия и структурные формулы веществ,

   использованных  в работе