ГОСУДАРСТВЕННОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ 
ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ

«МОРДОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

ИМ. Н. П. ОГАРЁВА»

Факультет биологический

Кафедра ботаники и физиологии растений 
 
 

КУРСОВАЯ  РАБОТА

МОРФОГЕНЕЗ   ГВОЗДИКИ (DIANTHUS CARYOPHYLLUS L.)  

 IN VITRO

   
 

Автор курсовой работы                            20.05.2010                  И.И. Иванов                                                                  

Специальность       020803 биоэкология

Обозначение курсовой работы КР-02069964-020803-02-10

Руководитель работы                           

канд. биол. наук, доц.      20.05.2010       Е. В. Мокшин

                                                       

                                                                      
 

   Оценка  
 
 
 
 
 
 
 

Саранск

2010

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ 
ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ

«МОРДОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

ИМ. Н. П. ОГАРЁВА»

Факультет биологический

Кафедра ботаники и физиологии растений

ЗАДАНИЕ НА КУРСОВУЮ РАБОТУ

 

Студент  И.И. Иванов

1 Тема Морфогенез гвоздики (Dianthus caryophyllus L.) in vitro

2 Срок представления  работы к защите: май 2010 года

3 Исходные данные для научного исследования: литературные источники, экспериментальные данные

4 Содержание курсовой работы

     4.1 Аналитический обзор

     4.1.1 Клональное микроразмножение декоративных растений

     4.1.2 Морфогенез в культуре клеток и тканей

          4.1.3 Влияние условий культивирования на морфогенез гвоздики in vitro                       

     4.2 Материалы и методы исследования

     4.3  Результаты и их обсуждение 
 

Руководитель работы  ___________________________   Е. В. Мокшин 

Задание принял к исполнению _____________________ 
 
 

Реферат

     Курсовая  работа содержит 45 страниц, 2 таблицы, 4 рисунка, 37 использованных источников.

КЛОНАЛЬНОЕ  МИКРОРАЗМНОЖЕНИЕ, МОРФОГЕНЕЗ, ЭКСПЛАНТ, IN VITRO, ГВОЗДИКА, КАЛЛУС, DIANTHUS, ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА, ОРГАНОГЕНЕЗ, РЕГУЛЯТОРЫ РОСТА, ИУК, 6-БАП.

     Объектом  исследования являются растения гвоздики садовой

     Цель работы – изучение потенциальных возможностей гвоздики к морфогенезу in vitro.

     Методы  исследования – анализ литературных данных, лабораторные опыты.

     В результате исследования было изучено влияние регуляторов роста на морфогенез гвоздики (Dianthus caryophyllus L.) in vitro

     Степень внедрения – частичная.

     Область применения – в работе кафедры ботаники и физиологии растений  
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

Содержание 

Введение                                                                                                                  6                                               

1 Аналитический  обзор                                                                                           8

1.1 Клональное микроразмножение декоративных растений                     8

1.2 Морфогенез в культуре тканей                                                                      14

1.2.1 Понятие и  механизм морфогенеза in vitro                                               14

1.2.2 Регенерация  растений в культуре клеток  и тканей                                 19

1.3 Влияние  условий культивирования   на морфогенез   гвоздики (Dianthus caryophyllus L.) in vitro                                                                        27

2 Материал и  методы исследования             31

2.1 Объект исследования                                                                                      31

2.2 Методы исследования                                                                                     32

2.2.1 Работа в  ламинар-боксе                                                                               32

2.2.2 Приготовление  питательных сред                                                              33

2.2.3 Посадка эксплантов  и снятие показателей                                                 34

3 Результаты и их обсуждение                                                                             36

3.1 Влияние регуляторов  роста на морфогенез эксплантов                              36

Заключение                                                                                                           40

Список использованных источников                                                                  41                     
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

Обозначения и сокращения 

2,4-Д – дихлорфеноксиуксусная кислота

6-БАП – 6-бензиламинопурин

АБК – абсцизовая кислота

ИМК– индолилмасляная  кислота

ИУК – индолил-3-уксусная кислота 

КМР – клональное микроразмножение

МС – Мурасиге-Скуга

НУК – нафтилуксусная кислота 

TDZ – тидиазурон 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

     Введение 

     Обширное  царство растений – потенциально неограниченный источник клеток и тканей, которые могут быть введены в культуру и, как следствие, существуют неограниченные возможности для создания новых биотехнологических процессов [1]. За последние годы в России резко возрос ассортимент и спрос на многие цветочные и декоративные культуры. Реальная возможность обогатить рынок – воспользоваться достижениями и знаниями в области биотехнологии растений. Использование технологий клонального микроразмножения позволяет сократить время выращивания до товарного стандарта для декоративно-лиственных бегоний и сенполий на 1-1,5 месяца, для хризантем, лилий, гвоздик и орхидей – на 3-4 месяца [2].

     Актуальны как фундаментальные, так и прикладные аспекты использования культивируемых клеток и тканей растения. В фундаментальных исследованиях клетки и ткани in vitro являются основой, которая позволяет объединить разные уровни исследования, начиная с молекулярно-генетического и заканчивая популяционным, что очень важно для изучения различных проблем биологии растений [3]. В отличие от клеток животных, практически любая растительная клетка способна в определенных условиях и на соответствующих питательных средах регенерировать полноценные растения. Решающую роль во вторичном образовании органов (корней или почек) из недифференцированных тканей in vitro играет соотношение фитогормонов (ауксинов и цитокининов) и их концентраций в питательной среде. Изучение процесса экспериментального морфогенеза на всех уровнях организации привело к созданию технологии клонального микроразмножения растений, которая уже в большинстве стран перешла на коммерческий уровень [4].

     С появлением метода культуры тканей представилась возможность изучать происходящие в растении изменения в процессе морфогенеза и роста, более того эти процессы научились контролировать. Ни один из аспектов ботанического исследования не может дать единой картины дифференцировки, а при ее изучении необходимо стремиться к объединению информации, получаемой с помощью морфологических, физиологических, биохимических и биофизических методов [5].

     Основным  итогом быстрого развития технических  приемов работы с изолированными тканями и клетками растений, культивируемыми in vitro, явилось понимание исследователями необходимости изучения биологии используемых объектов на всех уровнях – молекулярном, субклеточном, клеточном и тканевом для разработки практически важных технологий, так как эмпирический подход при их создании часто был неэффективен [6].

     Успех в применении культуры клеток и тканей в первую очередь зависит от оптимизации физиологических процессов, обеспечивающих нормальное деление клеток, их дифференцировку и регенерацию из них взрослых растений. Наиболее сложной является регенерация растений из отдельных клеток. Поэтому важнейшее значение имеет выяснение механизма морфогенеза in vitro, регенерации и лежащих в их основе процессов [5,7].

     Цель  данной работы – изучить процессы роста и морфогенеза гвоздики в культуре клеток и тканей, способы их регулирования. Основные задачи исследования:

     1) описать значение фундаментальных исследований в культуре клеток и тканей;

     2) определить потенциал растений-регенерантов гвоздики к клональному микроразмножению;

     3) выяснить роль регуляторов роста на морфогенез гвоздики in vitro.

 

     1 Аналитический обзор 

     1.1  Клональное микроразмножение декоративных растений 

     В последнее время в исследованиях  по культуре клеток и тканей высших растений четко наметились два направления. Первое из них связано с углубленным исследованием биологии культивируемой растительной клетки, изучением особенностей ее метаболизма, роста, дифференцировки, присущей ей генетической и эпигенетической изменчивости. Второе направление прикладное, ставящее своей целью более широкое использование приемов и методов культуры тканей для решения трудных практических задач, возникающих в растениеводстве, сельскохозяйственной генетике и селекции. Одним из таких весьма эффективных и экономически выгодных приемов является клональное микроразмножение растений в культуре in vitro [8].

     Массовое  бесполое размножение растений в  культуре клеток и тканей, при котором  возникшие формы генетически  идентичны исходному экземпляру, получило название клонального микроразмножения [9].

     … 

     1.2 Морфогенез в культуре клеток и тканей

     1.2.1 Понятие и механизм морфогенеза in vitro

     Морфогенез – возникновение и развитие органов, систем и частей тела растения как в индивидуальном (онтогенез), так и в эволюционном развитии. Он включает в себя цитогенез, гистогенез и органогенез. При изучении морфогенеза мы имеем дело не только с видимыми изменениями формы и структуры, но и с лежащими в их основе процессами, регулирующими развитие органов и тканей [13].

     … 

     1.2.2 Регенерация растений в культуре клеток и тканей

     Ряд исследователей в области культуры клеток и тканей, в частности Стюард, считают, что любая свободная клетка высшего растения, помещенная в подходящую среду, может регенерировать целое новое растение по одному из альтернативных путей. Но возможности развития большинства клеток каллуса каким-то образом ограничены, и дальнейшие ограничения накладываются при дифференцировке проводящей ткани, стеблевых почек и зачатков корней [3]. Для перехода к морфогенезу недостаточно индуктора, а необходимо, чтобы клетка была готова к ответу на него. Способность воспринимать стимулы морфогенеза называют компетентностью клетки. В пересадочной культуре некомпетентные клетки продолжают делиться и становятся на путь перехода к гормоннезависимости. Многие из каллусных тканей в силу генетических особенностей продолжают использовать экзогенные гормоны, но полностью утрачивают способность к регенерации [11].

     … 

     1.3 Влияние условий культивирования на морфогенез гвоздики  in vitro  

     Первая  работа по микроразмножению ремонтантной гвоздики была сделана Хакеттом и Андерсоном а 1967 г. Однако воспроизводство гвоздики по их методике, предполагающей предварительное формирование каллуса и последующую индукцию в его массе меристематических очагов, требует довольно больших затрат времени и не всегда удается [17].

     … 

 

       2 Материал и методы исследований 

      2.1 Объект исследования 

      Объектом  исследования являлись стерильные пробирочные растения гвоздики садовой (Dianthus caryophyllus L.), сорт Silkroad (рисунок 2.1).

      Рисуноу 2.1 – Dianthus caryophyllus L. в культуре in vitro 

      Гвоздика (Dianthus) – род многолетних растений семейства Гвоздичные (Caryophyllceae). Род насчитывает более 300 видов. Среди многолетних гвоздик имеются виды, культивируемые как двухлетние растения. Дикорастущая гвоздика распространена в зонах умеренного климата. В декоративном садоводстве в настоящее время используются многочисленные гибриды [30,31].

      Для гвоздик характерно одновременное  наличие вегетативных и цветущих побегов на растении. Вегетативные побеги обычно гораздо короче и не ветвятся. Листья линейные или линейно-ланцетные, иногда даже шиловидные, всегда супротивные. Узлы с характерным утолщением. Нередко у старых растений нижняя часть стеблей одревесневает, и они напоминают полукустарники. Генеративные побеги в разной степени ветвистые, чаще всего ветвление начинается только в соцветии, представляющем собой метелку или головку, нередко малоцветковую, часто встречаются одиночные цветки [30].

      Чашечка трубчатая, сросшаяся, имеющая пять зубцов, при основании чашечки располагаются 1-4 пары прицветных чешуи, количество, форма и размер которых являются признаком, характерным для каждого вида. Лепестков 5 с горизонтальной пластинкой и длинным ноготком, часто у основания пластинки имеются волоски, образующие бородку. В культуре часто встречаются формы с полумахровыми и махровыми цветками. Окраска пластинки лепестка – белая, розовая, красная, различных оттенков, реже – лавандовая и желтая. У ремонтантных гвоздик получены сорта с фиолетовой, оранжевой и зелёной окраской лепестков. Тычинок 10, столбиков 2, часто они выступают из цветка [30].

      Плод  – продолговатая одногнёздная коробочка, вскрывающаяся на верхушке четырьмя зубцами. Семена многочисленные, обычно чёрные, плоские, округлые или продолговатые [30].

      Садовые сорта голландской гвоздики (Dianthus caryophyllus) пользуются большой известностью и ценятся почти так же, как роза. Происхождение – Южная Европа. В культуре есть много разновидностей голландской гвоздики. От нее произошли первые ремонтантные гвоздики. Разнообразие колеров, хороший запах и красивое строение цветка являются особенностями гвоздики. Эти качества редко соединены в одном растении [31]. 

      2.2 Постановка эксперимента 

     Для получения хорошо растущей стерильной культуры растительный материал (побеги) извлекали из пробирок, делили на микрочеренки и помещали в пробирки на агаризованную (0,7%) питательную среду. В качестве основной среды использовали среду Мурасиге и Скуга (МС) (рН=5,8-5,9) [7], включающую витамины: тиамин и пиридоксин по 1 мг/л и сахарозу в концентрации 40 г/л.

     Эксперимент проводили по схеме представленной на рисунки 2.2.

 

      

 
 

 
 
 

   
 
 

 
 
 
 

 
 
 
 

 Рисунок 2.2 – Схема эксперимента

 

      2.3 Методы исследований 

      2.3.1 Методы стерильной  работы  

      Все применяемые методы в работе с  клеточными культурами требуют полнейшей  асептики, которая достигается различными способами.

      Стерилизация  посуды и инструментов. Инструменты, чашки Петри и колбы, предварительно закрытые фольгой заворачивали в бумагу и стерилизовали в сухожаровом шкафу при t = 180 °°С в течение 45 минут. Питательные среды автоклавировали при избыточном давлении 0,8 – 1,0 атм (181°С) в течение 15 минут [7]. 

      2.3.2 Работа в ламинар-боксе 

      Перед работой ламинар-бокс стерилизовали. Прежде всего, поверхность стола и стен протирали 70 % спиртом, затем помещали в ламинар необходимые стерильные инструменты, посуду и сосуд с 70 % спиртом, в котором находится пинцет и другие инструменты, необходимые во время работы. Все доступные поверхности посуды протирали 70 % спиртом.

      Помещали  в ламинар сосуды с растительным материалом. Поверхность сосудов и руки тщательно протирали 70-% спиртом. Включали спиртовку. Колбы и баночки, закрытые крышками из фольги открывали, осторожно разворачивали края фольги, снимали ее и клали на стол. После проведенной работы, брали пинцет из сосуда со спиртом, обжигали его в пламени спиртовка, обжигали горло сосуда, затем брали пинцетом крышку из фольги, обжигали ее с двух сторон и закрывали горло сосуда. Через некоторое время после охлаждения фольги ее прижимали плотно к горлу сосуда, закрывали целлофаном, сосуд подписывали. По окончании работы выключали последовательно: 1 – спиртовку, 2 – вентиляционную систему, 3 – сеть. Убирали использованную посуду и инструменты. Поверхность стола протирали 70 % спиртом [7].

      2.3.3 Приготовление питательной среды 

      В состав питательной среды входят минеральные соли (макро- и микроэлементы, соли железа, углеводы, витамины, регуляторы роста, агар (табл. 2.1). 

Таблица 2.1 –  Состав среды МС

 

      Для приготовления питательной среды  готовили маточные растворы макро- и  микросолей. Особой тщательности и  аккуратности придерживались при приготовлении  маточных растворов микросолей и  регуляторов роста, так как незначительные ошибки могли сказаться на росте ткани.

      Минеральные соли взвешивали в стеклянной таре, микроэлементы, витамины, сахарозу, регуляторы роста – на бумаге калька. Все компоненты среды готовили только на дистиллированной воде. Порядок приготовления питательной среды подробно изложен в статье [32].  

     2.3.4 Микроразмножение  

     Стерильные  растения в условиях ламинар-бокса  извлекали из пробирок. На стерильных матрасиках при помощи пинцета и скальпеля делили на черенки (экспланты). Экспланты помещали в пробирки на агаризованную среду. Штатив с пробирками переносили в условия культивирования. 

      2.3.5 Морфометрические измерения  

      Измерения проводили ежедневно в течение первых 14 дней и 1 раз в неделю в дальнейшем. При этом учитывали следующие показатели: число эксплантов образующих побеги, количество побегов на эксплант, интенсивность их роста. 

      2.3.6 Повторности и статистическая обработка результатов 

      Все опыты проводили не менее 3 раз  по 10-16 растений в каждом варианте опыта. Статистическая обработка полученных данных проведена на ПК с использованием программ Biostat, Статистика v.2.6, Microsoft Excell 2000. В таблицах и на графиках представлены средние значения из всех опытов с их стандартными ошибками, рассчитанные по стандартным биометрическим критериям. Достоверность различий между вариантами оценивали по t-критерию Стьюдента [33]. 
 
 

      3 Результаты и их обсуждение 

      3.1 Влияние регуляторов роста на органогенез эксплантов                         Dianthus caryophyllus L. 

     Одним из важнейших факторов, оказывающим существенное влияние на морфогенез растений в культуре in vitro, является гормональный состав среды [35,36,37,38].

      Нами  изучалась регенерационная активность эксплантов в зависимости от внесения в питательную среду следующих регуляторов роста ауксинов (ИУК, 2,4-Д), цитокининов (6-БАП, кинетин, тидиазурон).

       В первой серии опытов исследовали  совместное действие 6-БАП и ИУК. При изучении влияния регуляторов роста на органогенез гвоздики садовой установлено, что совместное применение 6-БАП и ИУК активизировало регенерационную активность эксплантов. Максимальное количество микропобегов de novo – 3 штуки на эксплант – формировалось в варианте с использованием 4,0 мг/л 6-БАП + 0,5 мг/л ИУК (таблица 3.1) (рисунок 3.1).  

Таблица 3.1 – Влияние 6-БАП и ИУК на побегообразование у гвоздики садовой, шт./эксплант

 

       Немаловажное  значение для последующего размножения  гвоздики                in vitro имеет размер образовавшихся побегов, так как это напрямую связано с количеством возможных новых эксплантов [39-54].

Рисунок 3.1 – Побегообразование у гвоздики садовой на среде 

с 4,0 мг/л 6-БАП + 0,5 мг/л ИУК 

       … 

 

Выводы 

      1 Проведенные исследования показали, что гвоздика садовая (Dianthus caryophyllus L.)  являются удобной биологической моделью для выяснения механизмов гормональной регуляции органогенеза в культуре клеток и тканей в условиях in vitro.

     2 Для формирования максимального числа побегов у гвоздики садовой в условиях in vitro в качестве регуляторов роста в среду необходимо вносить             4,0 мг/л 6-БАП + 0,5 мг/л ИУК.

     3 Для формирования побегов максимального  размера так же 4,0 мг/л 6-БАП  + 0,5 мг/л ИУК.

     4 Для большинства препаратов слишком высокие и низкие концентрации угнетают регенерационные процессы у эксплантов гвоздики садовой. 
 
 
 
 
 

 

Список использованных источников 

      1  Мосин О. В.   Фитобиотехнология   и  ее  прикладные  аспекты  /              О. В. Мосин. – 2005. – М. : Знание. – 18 с.

            2  Миронова О.  Ю. Разработка и совершенствование  технологий клонального микроразмножения декоративно-цветочных культур: дис. ... канд. биол. наук / О. Ю. Миронова. – М. – 2004. – 146 c.