Высокоэффективная жидкостная хроматография и применение ее в фармацевтическом анализе

 

 

 

 

 

 

 

Курсовая работа

на тему

Высокоэффективная жидкостная хроматография и применение ее в фармацевтическом анализе

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Исполнитель: Ермакова Елена Александровна

студентка 52 группы

Руководитель: Ендальцева Ольга Сергеевна

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Пермь 2012

Оглавление

Оглавление ---------------------------------------------------------------------------------2

Введение ------------------------------------------------------------------------------------3

Обзор литературных данных

1. ВЭЖХ определения, достоинства, недостатки -----------------------------4
2. Строение и принцип действия жидкостного хроматографа -------------4
3. Сорбенты, применяемые в ВЭЖХ --------------------------------------------5
4. Подвижная фаза для ВЭЖХ ----------------------------------------------------6
5. Классификация методов ВЭЖХ -----------------------------------------------6
6. Качественный анализ -----------------------------------------------------------10
7. Количественный анализ --------------------------------------------------------11
8. Примеры привенения ВЭЖХ в фармацевтическом анализе ------------17
9. Выводы -----------------------------------------------------------------------------20
10. Список литературы --------------------------------------------------------------21

  

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Введение

Методы анализа, применяемые в фармакопейном анализе (титриметрические, спектрофотометрические), можно использовать только для анализа индивидуальных веществ или простейших смесей. Определение в одной пробе 2 – 3 соединений такими методами возможно только в очень редких случаях, когда свойства соединений очень отличаются друг от друга. Для применения сложных смесей предпочтительнее использовать хроматографические методы, так как в одной пробе происходит разделение смеси веществ и их анализ.

Сегодня ВЭЖХ применяют во многих областях науки и техники, в том числе и в фармацевтической промышленности. ВЭЖХ вытесняет классическую колоночную, бумажную и тонкослойную хроматографии. Важнейшими катализаторами развития хроматографической науки и практики являются потребности разных естественных и технических наук, начиная от медицины и кончая креминалистикой, а также химические и биологические науки Рост применения связан с разработкой теоретических основ и серийным выпуском отдельных узлов и аппаратов для ВЭЖХ, а так же растворителей и химикатов.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Обзор литературных данных

 

1. ВЭЖХ определение, достоинства и недостатки.

Хроматография – это метод разделения компонентов смеси, основанный на различии в равновесном распределении их между двумя несмешивающимися фазами, одна из которых неподвижна, а другая подвижна.

Принцип жидкостной хроматографии состоит в разделении компонентов смеси, основанном на различии в равновесном распределении их между двумя несмешивающимися фазами, одна из которых неподвижна (сорбент), а другая подвижна (жидкость).

Отличительной особенностью ВЭЖХ является использование давления (до 400 бар) и мелкозернистых сорбентов (3 – 5 мкм, сейчас до 1,8 мкм). Это позволяет разделять сложные смеси веществ быстро и полно (среднее время анализа 3 – 30 мин). Использование высокоселективных детекторов позволяет определить в сложных смесях микроколичества веществ.

Важнейшим преимуществом ВЭЖХ перед газовой хроматографией – это возможность исследовать практически любые объекты без ограничений по их физико-химическим свойствам (например, температура кипения, молекулярная масса).

Недостатком является дороговизна оборудования.

 

2. Строение и принцип действия жидкостного хроматографа.

В любом жидкостном хроматографе есть следующие части: 1 – насос, 2 – узел ввода пробы, 3 – хроматографическая колонка, 4 – детектор, 5 – регистратор (самописец, интегратор, компьютер), 6 – термостат колонок, 7 – узел подготовки элюента с емкостями для элюента, 8 – слив элюента или коллектор фракций.

Принцип действия хроматографа заключается в следующем: раствор анализируемой смеси с помощью узла ввода пробы вводятся в верхнюю часть хроматографической колонки. С помощью насоса анализируемая смесь прокачивается элюентом (подвижная фаза) через хроматографическую колонку, которая представляет собой трубку, содержащую сорбент. В колонке происходит разделение анализируемой смеси на отдельные вещества (компоненты). Вытекающий из колонки элюат, содержащий отдельные компаненты анализируемой смеси детектируется детектором, показания которого регистрируются регистратором.

 

 

 

3. Сорбенты, применяемые в ВЭЖХ.

Основными группами сорбентов являются:

• поверхностно-пористые сорбенты, представляющие собой непроницаемое для растворителя ядро из стекла, на поверхность которого нанесен тонкий слой пористого сорбента, обычно силикагеля. Достоинства: возможность упаковки в колонки сухим способом, легкость фракционирования, широкий ассортимент привитых и нанесенных фаз.

Недостатки: малая поверхность сорбента в колонке (основной объем занимает непористое ядро, которое не участвует в разделении), большое гидравлическое сопротивление длинных колонок, малая производительность, быстрая перегрузка, сложная технология получения сорбентов и их дороговизна, длительность анализа и недостаточная эффективность

• пористые сорбенты на основе силикагеля. В настоящее время фирмы производят более 200 сорбентов для ВЭЖХ на основе силикагеля. На поверхности силикогеля находятся свободная силанольная, силанольная, связанная водородной связью, силоксановая группы.
• пористые сорбенты на основе оксида алюминия. Для хроматографии используется гамма-оксид алюминия. В ВЭЖХ носит ограниченный характер,в тех случаях когда требуется селективность, отличная от силикагеля.
• пористые сорбенты на полимерной основе, чаще применяются в распределительной ВЭЖХ. Достоинства: неограниченный рабочий диапазон рН
• гели, применяются в эксклюзионной ВЭЖХ. Они подразделяются на две группы: полужесткие (органические) и жесткие (неорганические, аэрогели). Органические гели представляют собой сшитые сополимеры с большой плотностью сшивки, способные ограничено набухать в используемых растворителях.

В качестве жестких неорганических сорбентов применяется силикагели, в меньшей степени пористые стекла.

• сорбенты для ионообменной хроматографии можно разделить на ионообменные смолы, силикагель с химически привитой фазой, обладающей ионообменными свойствами.

 

 

 

4. Подвижная фаза для ВЭЖХ.

Растворители, применяемые в ВЭЖХ, должны удовлетворять требованиям:

• чистота, влияет на все основные стадии процесса: подачу растворителя, разделение в колонке, детектирование и воспроизводимость результатов;
• химическая инертность, при использование химически активных растворителей ухудшает детектирование, портят сорбенты, изменять компоненты пробы и вызывать коррозию аппаратуры;
• совместимость с детектором;
• достаточная растворяющая способность по отношению к анализируемым веществам;
• низкая вязкость, чтобы не ухудшать массопередачу, и не затруднять работу насоса;
• безопасность, необходимы определенные условия в помещениях (эффективная приточно-вытяжная вентиляция, недопущение на рабочем месте застойных зон) и использовать менее токсичные и взрывоопасные растворители;
• доступность

В некоторых случаях значение имеет смешиваемость с другими растворителями, температура кипения и возможность легкого извлечения вещества из элюента.

 

5. Классификация методов ВЭЖХ.

 

1. По механизму разделения анализируемых веществ ВЭЖХ:

• Адсорбционная хроматография.

Разделение методом адсорбционной хроматографии осуществляется в результате взаимодействия вещества с адсорбентами, имеющими на поверхности активные центры (например, силикагель, оксид алюминия). Различие в способности к взаимодействию с адсорбционными центрами разных молекул пробы приводит к разделению на зоны в процессе движения с подвижной фазой по колонке.

В основе сорбции на поверхности адсорбента, имеющего гидроксильные группы, лежит специфическое взаимодействие между полярной поверхностью адсорбента и полярными (способными поляризоваться) группами или участками молекул (например, диполь-дипольное взаимодействие, образование водородной связи, образование комплексов с переносом заряда).

Наибольшее применение в ВЭЖХ находят адсорбенты из силикогеля с разной поверхностью, объемом и диаметром пор. Значительно реже используют оксид алюминия и крайне редко – другие адсорбенты, широко применяющиеся в классической колоночной и тонкослойной хроматографии. Основная причина этого – недостаточная механическая прочность адсорбентов, не позволяющая упаковывать их и использовать при повышенных давлениях, характерных для ВЭЖХ.

 Полярные группы, обусловливающие адсорбцию и находящиеся на поверхности силикагеля и оксида алюминия, по свойствам близки. Поэтому обычно порядок элюирования смесей веществ и элюотропный ряд растворителей для этих адсорбентов одинаков. Однако различие химического строения силикагеля и оксида алюминия иногда приводит к появлению различий в селективности, тогда предпочтение отдают тому или другому адсорбенту, более подходящему для данной конкретной задачи. Например, оксид алюминия обеспечивает большую избирательность при разделении некоторых многоядерных ароматических углеводородов.

Предпочтение, отдаваемое обычно силикагелю по сравнению с оксидом алюминия, объясняется более широким выбором силикагелей по пористости, поверхности и диаметру пор, а также значительно более высокой каталитической активностью оксида алюминия, нередко приводящей к искажению результатов анализа вследствие разложения компонентов пробы либо их необратимой хемосорбции.

К недостаткам адсорбционной ВЭЖХ прежде всего относится большая длительность процессов уравновешивания адсорбентов с растворителями, содержащими воду в микроколичествах, трудность приготовления таких растворителей с определенной и воспроизводимой влажностью. Из этого следуют плохая воспроизводимость параметров удерживания, разрешения, селективности.

Существенные недостатки адсорбентов, особенно оксида алюминия, связанные с частыми случаями перегруппировок чувствительных к катализу соединений, их разложения, необратимой сорбции, также общеизвестны и неоднократно отмечались в литературе. Необратимо сорбирующиеся вещества, накапливаясь на начальном участке колонки, меняют природу сорбента, могут привести к повышению сопротивления колонки или даже к полной ее забивке. Последний недостаток может быть устранен путем использования предколонки, которая по-мере повышения сопротивления и забивки заменяется на новую или перезаполняется новым сорбентом. Однако необратимая сорбция приводит к получению хроматограммы, на которой полностью или частично отсутствуют чувствительные к сорбции или каталитическому разложению компоненты пробы.

 

• Распредилительная хроматография.

Распределительная хроматография — это вариант ВЭЖХ, в котором разделение смеси на компоненты осуществляется за счет различия их коэффициентов распределения между двумя несмешивающимися фазами: растворителем (подвижная фаза) и фазой на сорбенте (неподвижная фаза).

Первые сорбенты такого типа получали нанесением жидких фаз (оксидипропионитрила, парафинового масла и др.) на пористые носители. Однако сразу же обнаружились и недостатки таких сорбентов, основным из которых было относительно быстрое смывание фазы с носителя. С этим недостатком боролись, насыщая растворитель нанесенной фазой еще до его попадания в колонку. Унос также уменьшался, когда использовали более вязкие и менее растворимые полимерные фазы, однако в этом случае из-за затруднения диффузии из толстых полимерных пленок эффективность колонок заметно снижалась.

Позже стали привить химическими связями жидкую фазу к носителю таким образом, чтобы унос ее стал физически невозможен, т. Е. превратить носитель и фазу в одно целое, так называемый привито-фазный сорбент. Эти так называемые «щеточные» сорбенты показали, что с их использованием действительно удается получить высокую эффективность колонок при отсутствии уноса фазы из колонки и стабильности времен удерживания. Однако устойчивость таких сорбентов в условиях применения водных растворителей и даже слабоосновных или кислых сред была низкой: фаза отщеплялась химически за счет реакции гидролиза.

 

В дальнейшем усилия исследователей были направлены на поиск реагентов, прививка которых протекала бы достаточно быстро и полно, а образовавшиеся связи были максимально устойчивыми. Такими реагентами стали алкилхлорсиланы и их производные, позволившие по сходной технологии получать привито-фазные сорбенты разного типа и с разными как полярными, так   и неполярными группами на поверхности.

Сложность технологии прививки реагентов и подготовки сырья и материалов, ее многостадийность приводят к тому, что даже полученные по одной технологии на одной фирме-производителе партии сорбентов могут иметь несколько разные хроматографические характеристики. Особенно это касается тех случаев, когда такие сорбенты используют для анализа многокомпонентных смесей, содержащих вещества, заметно различающиеся по количеству и положению функциональных групп, по роду функциональности.

• Ионообменная хроматография

В ионообменной хроматографии разделение компонентов смеси достигается за счет обратимого взаимодействия ионизирующихся веществ с ионными группами сорбента. Сохранение электронейтральности сорбента обеспечивается наличием противоионов способных к ионному обмену, расположенных в непосредственной близости к поверхности. Ион введенного образца, взаимодействуя с фиксированным зарядом сорбента, обменивается с противоионом. Вещества, имеющие разное сродство к фиксированным зарядам, разделяются на анионитах или на катионитах. Аниониты имеют на поверхности положительно заряженные группы и сорбируют из подвижной фазы анионы. Катиониты соответственно содержат группы с отрицательным зарядом, взаимодействующие с катионами.

 

 В качестве подвижной фазы используют водные растворы солей кислот, оснований и растворители типа жидкого аммиаА, т. Е. системы растворителей, имеющих высокое значение диэлектрической проницаемости и большую тенденцию ионизировать соединения. Обычно работают с буферными растворами, позволяющими регулировать значение рН.

При хроматографическом разделении ионы анализируемого вещества конкурируют с ионами, содержащимися в элюенте, стремясь вступить во взаимодействие с противоположно заряженными группами сорбента. Отсюда следует, что ионообменную хроматографию можно применять для разделения любых соединений, которые могут быть каким-либо образом  ионизированы.

Разделение конкретных веществ зависит в первую очередь от выбора наиболее подходящего сорбента и подвижной фазы. В качестве неподвижных фаз в ионообменной хроматографии применяют ионообменные смолы и силикагели с привитыми ионогенными группами.

• Эксклюзионная хроматография.

Эксклюзионная хроматография представляет собой вариант жидкостной хроматографии, в котором разделение происходит за счет распределения молекул между растворителем, находящимся внутри пор сорбента, и растворителем, протекающим между его частицами.

В отличие от остальных вариантов    ВЭЖХ, где разделение идет за счет различного взаимодействия компонентов с поверхностью сорбента, роль твердого наполнителя   в эксклюзионной хроматографии заключается только в формировании пор определенного размера, а неподвижной фазой является растворитель, заполняющий эти поры. Поэтому применение термина «сорбент» к данным наполнителям в определенной степени условно.

Принципиальной особенностью метода является возможность разделения молекул по их размеру в растворе в диапазоне практически любых молекулярных масс — от 102 до 108, что делает его незаменимым для исследования синтетических и биополимеров.

По традиции процесс, проводимый в органических растворителях, все еще часто называют гель-проникающей, а в водных системах — гель-фильтрационной хроматографией.

Но на практике четких границ нет, так как разделение часто протекает по нескольким механизмам одновременно.

 

 

 

2. По полярности подвижной и неподвижной фаз:

• Нормально-фазовая, неподвижная фаза более полярна, чем подвижная

• Обратно-фазовая, подвижная фаза более полярна чем неподвижная. Причиной сорбции служит сильное притяжение полярных молекул растворителя друг к другу, роль химичкеской природы неподвижной фазы мала, так как взаимодействие сорбат-сорбент ограничивается слабыми дисперсионными силами.

 

6. Качественный анализ.

Качественный анализ применяют для идентификации известного продукта, полученного новым путем или находящегося в смеси с другими продуктами. Он необходим при выделении из сложных биологических, химических смесей различных компонентов, что особенно важно в медицине, криминалистике, экологии, для контроля за нахождением некоторых лекарств и химических веществ и их метаболитов в биоматериалах.

 

 Идентификацию компонентов в ВЭЖХ можно проводить тремя способами:

 

1. использовать информацию об удерживании.

Совпадение значений времени удерживания известного вещества с исследуемым веществом дает возможность предположить их идентичность. Достоверность идентификации возрастает, если проводить сравнение хроматограмм известного вещества и неизвестного компонента в различных условиях. Если вещества в адсорбционной и обращенно-фазной или ион-нообменной и эксклюзионной хроматографии ведут себя одинаково, надежность идентификации возрастает. Если достоверность идентификации при равенстве относительного удерживания составляет 90%, то при изучении поведения этих же веществ в условиях существенно отличающихся достоверность идентификации составляет уже 99%. Ценной характеристикой вещества, применяемой при идентификации,  является    отношение    сигналов,    полученных для данного вещества на двух разных детекторах. Анализируемое вещество после выхода из колонки проходит сначала через первый детектор, затем через второй, а сигналы, поступающие с детекторов, регистрируются одновременно при помощи многоперьевого самописца или на двух самописцах. Обычно применяют последовательное соединение ультрафиолетового детектора (более чувствительного, но селективного) с рефрактометром, или ультрафиолетового с детектором по флуоресценции, или двух ультрафиолетовых детекторов, работающих на разных длинах волн.

 

 

 

 

2. исследовать зоны, полученные при разделении в колонке жидкостного хроматографа, методами спектрального или химического анализа.

В некоторых случаях идентификация неизвестного вещества может быть обеспечена сбором фракции, соответствующей пику хроматографического разделения, и последующим анализом этой фракции физическими или химическими методами. При этом подвижная и неподвижная хроматографические фазы должны быть очищенными, чтобы фон от фазы был сведен к минимуму, они не должны вступать в химическую реакцию с растворенным веществом, должны быть совместимыми-с хроматографической системой, используемой для разделения и обнаружения пика. Неподвижная фаза не должна выноситься из колонки. Кроме того, обе фазы не должны мешать идентификации вспомогательными методами и быть летучими, чтобы их можно было легко удалить выпариванием, фракции обычно собирают вручную, хотя возможно применение коллектора фракций. Для обеспечения чистоты, соответствующей пику собираемой фракции, внутренний объем трубки между детектором и выходом канала для сбора фракций должен быть минимальным. Этот объем должен быть измерен и внесены поправки на задержку между регистрацией пика детектором и фактическим выходом пика из канала для сбора фракций. Фракции удобно собирать в чистые, сухие, защищенные от попадания света сосуды с навинчивающимися крышками и тефлоновыми прокладками во избежание загрязнений. Возможен барботаж этих фракций чистым азотом или гелием.

Растворители удаляют из образца выпариванием, продувкой газом, нагреванием ИК-лампой. Воду и смеси органических растворителей с водой удаляют выпариванием или лиофильной сушкой. Летучие буферные соединения удаляют при повышенных температурах.

 

3. непосредственно подключить спектральный анализатор к колонке.

Разработаны комплексные автоматизированные системы, позволяющие вводить вещество после разделения в колонке хроматографа непосредственно в спектрофотометр, но подобное оборудование является довольно дорогостоящим, требует значительной подготовки оператора и имеет ряд ограничений. Для многих задач применение таких систем нецелесообразно, а иногда даже непригодно. Возможно подключение к жидкостному хроматографу ИК-спектрометра с преобразователем Фурье. При этом химическая структура веществ, соответствующих пикам на хроматограмме, может быть идентифицирована с помощью данных, записанных в библиотеку спектральной информации системы.

 

 

 

 

 

7. Количественный анализ.

Количественная жидкостная хроматография является хорошо  разработанным   аналитическим    методом,  не уступающим по точности количественной  газовой  хроматографии  и  значительно превышающим точность ТСХ или электрофореза. К сожалению, в ВЭЖХ не существует детектора, который имел бы близкую чувствительность для соединений различного химического строения   (как катарометр в ГЖХ). Поэтому для получения количественных результатов калибровка прибора обязательна.

Количественный анализ состоит из следующих стадий:

 

1. хроматографическое разделение.

Нельзя использовать в количественном анализе пики ложные или нечеткой формы, а также пики, время выхода которых близко к t0, поскольку возможно недостаточное их разделение. Наивысшая эффективность колонки достигается при введении 10-5-10-6 г растворенного вещества на 1 г сорбента. При введении больших количеств образца зависимость высоты пика от нагрузки может оказаться нелинейной и потребоваться количественная оценка по площадям пиков. К существенному искажению результатов хроматографического разделения приводят погрешности, связанные с детектированием, или усилением. Каждый детектор характеризуется специфичностью, линейностью и чувствительностью. Особенно важна проверка на селективность при анализе микропримесей. Отклик УФ-детекторов может изменяться на вещества со схожими функциональными группами в 104 раз. Необходимо отклик детектора прокалибровать для каждого определяемого вещества. Естественно, что вещества, не поглощающие в УФ-области, не дадут сигнала на самописец при использовании в качестве детектора фотометра. При использовании рефрактометра возможно появление отрицательных пиков. Кроме того, этот детектор необходимо термостатировать, чего не требуется для УФ-детектора.

 

2. измерение площадей или высот пика;

Высотой пик h называют расстояние от вершины пика до базовой линии, его измеряют линейной либо подсчитывают число делений на самописце. Некоторые электронные интеграторы и вычислительные машины дают информацию о высоте пиков. Положение базовой линии смещенных пиков находят путем интерполирования значений ординат, соответствующих началу и концу пика. Для повышения точности необходимо иметь пологую стабильную базовую линию. В случае неразделенных пиков базовую линию строят между началом и концом пика, а не заменяют нулевой линией. Так как высота пиков менее зависит от влияния соседних перекрывающихся пиков, оценка по высоте пика точнее, и ее почти всегда используют при анализе микропримесей.

Площадь пика можно определять различными способами:

 

2.1. Планиметрический метод  заключается в том, что пик  обводят ручным планиметром, представляющим  собой прибор механически определяющий  площадь пика. Метод точен, но  трудоемок и плохо воспроизводим. Применение этого метода нежелательно.

 

2.2. Метод бумажных силуэтов. Пик вырезают и взвешивают. Метод  хорошо воспроизводим, но трудоемок, при этом уничтожается хроматограмма. Применимость его зависит от  однородности диаграммной ленты. Метод также не может быть  широко рекомендован.

 

2.3. Метод вычисления произведения  высоты пика на ширину на  уровне половины высоты. Его применяют  при четко очерченных и симметричных  пиках. Базовую линию строят так  же, как и при измерении высоты  пика. Для более точного определения  основания на уровне половины  высоты можно увеличить скорость  диаграммной ленты или применить  микроскоп с миллиметровой сеткой. Ширину лучше измерять от внутренней  границы одной линии до наружной  границы другой. Для асимметричных  пиков метод становится менее  точным, так как ширина на уровне  половины высоты может и не  равняться половине основания.

 

2.4. Метод триангуляции  состоит в построении треугольника  путем проведения касательных к сторонам пика. Вершина треугольника находится выше, чем вершина пика. Увеличение площади, образованной этой продленной вершиной, будет последовательным для всей хроматограммы и не слишком повлияет на точность. Кроме того, некоторая площадь, теряемая при проведении касательных, будет компенсирована. Основание треугольника определяют пересечением касательных с базовой линией, а площадь произведением 1/2 основания на высоту. Для определения площадей асимметричных пиков этот метод наилучший. Однако воспроизводимость при построении касательных различными операторами различна и, следовательно, низкая.

 

2.5. Метод с применением дискового интегратора основан на электромеханическом приспособлении, присоединенном к самописцу. Перо, прикрепленное к интегратору, перемещается по полосе внизу ленты со скоростью, пропорциональной перемещению пера самописца. Как и при ручном измерении, пик должен оставаться на шкале самописца, однако регулировки, компенсирующие смещение базовой линии и неполное разделение смежных пиков, снижает надежность и увеличивает продолжительность анализа. Метод более точен, чем ручные методы измерения, особенно при асимметричных пиках, и дает преимущество в скорости. Кроме того, он обеспечивает постоянную количественную запись анализа.

 

2.6. Методы с применением электронных интеграторов, определяющих площадь пиков и печатающих информацию об этой площади и о временах удерживания, могут включать коррекцию смещения базовой линии и определять площадь лишь частично разделенных пиков. Основные преимущества: точность, скорость, независимость действия от работы самописца. Интеграторы имеют память, и их можно программировать для конкретного анализа, используя предварительно заложенную программу. К достоинствам интегратора относят его способность использовать поправочные коэффициенты на отклик детектора при пересчете исходных данных о площадях пиков, компенсируя различие чувствительности детектора к разным веществам. Подобные системы экономят время, улучшают аналитическую точность и полезны для рутинного аналитического анализа.