Аттенуация вирусов

          Аттенуация - уменьшение болезнетворной способности (вирулентности) бактерий и вирусов при помощи химического воздействия, нагревания, высушивания, выращивания при неблагоприятных условиях или проведения через какой-либо другой организм. Ослабленные (вирулентные) бактерии и вирусы часто используются в процессе иммунизации.

          Аттенуация (от лат. attenuatio — уменьшение) — искусственное стойкое ослабление вирулентности патогенных микроорганизмов, сохраняющих способность вызывать иммунитет. Используется при изготовлении живых вакцин против туберкулеза, оспы.

Обычно вакцинный вирус —  близкий родственник патогенного. Однако попав в организм, он вызывает только специфический иммунитет, а  не заболевание.

         Метод аттенуации впервые применил Луи Пастер. Он несколько раз подряд размножил (пропассировал) возбудитель бешенства на мало чувствительных к нему кроликах. Адаптируясь к новому «хозяину» (кролику), вирус терял по отношению к человеку агрессивность. Ослабление болезнетворных свойств вируса (аттенуация) путем пассирования на маловосприимчивых хозяевах в течение 20 века был по существу единственным способом получения живых противовирусных вакцин.

          Механизм изменения вирусов при их аттенуации неясен. Расшифровка механизмов вирусной аттенуации позволит создавать совершенно новые вакцины. Важное значение имеет генетическая стабильность аттенуированного вируса. Возврат болезнетворных свойств (реверсия) является серьезной проблемой при разработке и применении живых противовирусных вакцин.

         Установлено, что для разных вирусов требуется разная продолжительность аттенуации. Примером короткого периода аттенуации могут служить вирусы чумы уток и ринотрахеита индеек. Высокоэффективные и безопасные вакцинные штаммы чаще и быстрее удавалось получить у оболочечных вирусов, чем у безоболочечных.    Кроме обычного серийного культивирования, для ускорения аттенуации вирусов использовали метод быстрых пассажей . Уже на ранних этапах аттенуации в популяции вируса появляются новые мутанты, отличающиеся более быстрым размножением в новой системе и аттенуированным фенотипом. Если, применять большую заражающую дозу и собирать «ранний» урожай вируса для очередного пассажа, то можно значительно ускорить процесс аттенуации. В опытах с вирусом венесуэльского энцефаломиелита лошадей, было установлено, что популяция вируса, размноженного в клетках содержит две группы клонов: медленно проникающие в клетки и вирулентные; быстро проникающие в клетки и авирулентные.

       Вирусы со сложным патогенезом, включающим первичное место репликации с последующим проникновением в один или несколько органов-мишеней, могут быть аттенуированы с помощью селективного изменения их тропизма. Вероятно этот механизм не единственный и не главный в аттенуации современных традиционных вакцинных штаммов, тем не менее в большинстве случаев аттенуация вирусов прежде всего связана с изменением их клеточного тропизма.

        В тех случаях, когда клетки-мишени являются первичным и единственным местом репликации вируса, создание эффективной и безопасной живой вакцины затруднено, поскольку зачастую невозможно добиться выраженной репликации вируса в клетках-мишенях с последующей антигенной стимуляцией организма без их повреждения, то есть проявления вирулентных свойств. Известно много примеров, когда новорожденные или молодые организмы и взрослые особи одного вида резко различаются между собой чувствительностью к ряду вирусов в естественных или экспериментальных условиях. Возможно, что в основе этого явления лежит тот же механизм, что и при аттенуации вирусов, — клеточная чувствительность, с той лишь разницей, что в первом случае она контролируется хозяином, во втором — вирусом.

       В проблеме вирулентности и аттенуации вирусов есть один важный аспект. Имеется в виду полигенный контроль вирулентности и различия ее у одного и того же вируса для разных хозяев. Оба эти явления имеют общую основу, суть которой состоит в отношении вируса к клеткам-мишеням организма хозяина. Данный аспект проблемы удобно рассмотреть на примере вируса болезни Ауески. В результате делеционных мутаций этот вирус мог полностью утратить вирулентность для свиней и овец, но оставаться высоковирулентным для кроликов и пушных зверей - небольшие дозы вируса вызывали у них заболевание с летальным исходом.  Следовательно, вирус утратил способность поражать клетки-мишени в организме свиней и овец, но сохранил способность размножаться и вызывать иммунитет. В этом случае, в процессе аттенуации вируса имеет место изменение клеточного тропизма, но изменение его не вообще, а для конкретных видов животных. А это значит, что тканевой тропизм вируса в данном случае имеет многофакторную основу и полигенный контроль.

       Другим примером может служить нейровирулентность полиовируса при прямом контакте с нейронами переднего рога спинного мозга циномольгусов и авирулентность для тех же клеток шимпанзе. Если вирулентность для одного хозяина отличается от таковой для другого, значит, это количественное свойство, которое можно усилить или ослабить. При идеальном исходе аттенуации вирус должен практически утрачивать способность поражать клетки-мишени, но сохранять способность размножаться в других клетках, обеспечивая создание выраженного и напряженного иммунитета и иммунологической памяти при минимальной реактогеннос-ти и полной безопасности.

 
                               Иммуногенность вирусных пулов

          Органами иммуногенеза являются  костный мозг, вилочковая железа, пейеровы бляшки, лимфатические  узлы, селезенка. Предшественниками  всех иммунокомпетентных клеток, расселяющихся по различным органам, являются стволовые клетки костного мозга, которые дифференцируются в Т- и В- лимфоциты, моноциты, гранулоциты, мегакариоциты и эритроциты. Иммунная система содержит более 2x10 лимфоцитов.

         Различают 3 основных класса лимфоцитов: Т-клетки (55-60%), В-клетки (25-30%) и нулевые клетки (10-20%). В-лимфоциты являются ведущим звеном гуморального иммунного ответа, они мигрируют из костного мозга во все лимфоидные органы за исключением тимуса, где превращаются в плазматические клетки, основная функция которых - синтез и секреция антител. Для превращения В-клстки в плазматическую требуется минимум 3 сигнала: сигнал активации (антиген, липополисахарид, ИЛ-4), сигнал пролиферации (ИЛ-5) и сигнал дифференцировки (ИЛ-6).

           Перерабатывать и представлять антиген В-лимфоцитам способны макрофаги, дендритные клетки, а также эндотелиальные клетки (не относящиеся к иммуно-компетентным). Макрофаги фагоцитируют и расщепляют возбудителей, оказывая на них цитостатическое действие. Они вырабатывают несколько десятков растворимых медиаторов, главные из которых - интерлейкин-1 и интерферон.

          Регуляция специфического иммунного ответа осуществляется Т-лимфоцитами. В зависимости от присутствия на их поверхности тех или иных маркеров, они выполняют разные функции, главные из них -индукция иммунных реакций (Т-хелперы - CD4), супрессия иммунного ответа (Т-супрессоры - CD8).

           Различают два класса Т-хелперов - T-hl и T-h2, считающихся антагонистами; в организме поддерживается баланс между этими двумя системами, у лиц с аллергией имеется преобладание T-h2 системы. Иммунный ответ T-hl-типа стимулируется ИЛ 2, ИЛ 12, у-интерфероном, он обеспечивает защиту против внутриклеточных возбудителей (вирусов), цитотоксические реакции и сопровождается продукцией IgG-антител. Этот тип ответа стимулирует реакции замедленной гиперчувствительности.

          Для Т-h2-ответа, стимулируемого ИЛ-4 и ИЛ-10, характерен гуморальный В-клеточный ответ, который, наряду с участием в защите от внеклеточных возбудителей, стимулирует развитие реакций немедленной гиперчувствительности и продукцию IgE. Оба типа ответа являются Т-зависимыми.

            Эффекторные клетки иммунного ответа (плазматические клетки, Т-эффекторы гиперчувствительности замедленного типа, Т-киллеры) имеют сравнительно короткий период жизни. Основу длительного иммунитета, в том числе поствакцинального, составляют клетки памяти. Они обеспечивают образование клонов, состоящих из специфических предшественников Т- или В-клеток, способных к быстрой дифференцировке при новом контакте с соответствующим антигеном.

          Естественные киллеры вызывают независимый от антител и комплемента лизис клеток-мишеней (клетки, пораженные вирусом гриппа, кори, простого герпеса, опухолевые клетки и пр.); их регулируют цитокины (интерферон, ИЛ2 и др.).

                                                Типы иммунитета

     Большинство инфекционных агентов при попадании в организм быстро разрушается механизмами врожденного иммунитета, которые не являются антиген-специфическими. Врожденный иммунитет включает:

•              Механический барьер  (эпителий кожи, слизистых)

•              Комплемент,  активируемый бактериями по альтернативному пути.

•              Нейтрофилы и макрофаги,  фагоцитирующие бактерий.

•              Естественные киллеры,  которые разрушают  инфицированные клетки.

     Они помогают держать инфекцию под контролем до тех пор, когда начнут действовать механизмы специфического иммунного ответа, обеспечивающие формирование приобретенного иммунитета. Процесс выработки иммунитета в ответ на инфекцию или вакцину можно представить в виде ряда последовательных этапов:

•              Стадия индукции включает захват антигена макрофагами, процессинг и презентацию  их Т-клеткам, расщепление антигена, эпитопы (пептидные детерминанты на клеточной мембране) которого становятся доступными в иммуногенной форме.

•              Стадия иммунорегуляции - активная пролиферация и дифференцировка иммунокомпетентных клеток, что обеспечивает распознавание эпитопов, активацию В-клеток, их созревание в плазматические клетки; формирование клеток памяти. Длительность первых 2 стадий (латентный период) составляет 1-2 нед.

•              Эффекторная стадия - активация эффекторных  клеток и образование циркулирующих антител. В фазу роста происходит экспоненциальное увеличение количества антител, она длится около 3 нед. в ответ на столбнячный и дифтерийный анатоксины, 2 нед. - в ответ на инактивированные бактериальные вакцины, например, коклюшную. Затем следует фаза снижения уровня антител, вначале быстрого, потом медленного - в течение нескольких лет или десятилетий. Уровень антител классов IgM и IgA снижается быстрее, чем IgG-антител. Когда уровень антител становится ниже протективного, возможно заболевание, что делает необходимым проведение ревакцинации при использовании инактивированных вакцин.

•              Стадия иммунологической памяти, характерная  и для клеточного, и для гумо­рального  типов иммунного ответа, обеспечивает организму возможность быстро реагировать на повторный контакт с антигеном. Благодаря клеткам памяти антитела в крови присутствуют десятилетия, хотя период полувыведения иммуноглобулинов редко превышает 1 месяц.

      Первичный иммунный ответ развивается при первой встрече иммунной системы с данным антигеном. Он характеризуется ранней (на 3-6 день) продукцией  IgM-антител, более поздним появлением IgG-антител (2-3 нед.) и IgA-антител (15-21 день). Функция IgM-антител - лизис микроорганизмов, опосредованных комплементом, нейтрализация вирусов, но они циркулируют короткий период (из-за быстрого катаболизма), тогда как длительную защиту обеспечивают антитела класса IgG, в чьи функции входит нейтрализация вирусов и токсинов, опсонизация и лизис бактерий. Антитела класса IgA участвуют, в основном, в защите слизистых, формируя секреторные IgA-антитела.

 Вторичный ответ  развивается при повторном контакте  с антигеном. При нем подъем  уровня IgM незначителен, тогда как быстро и интенсивно происходит синтез антител IgG-класса примированными клетками памяти.

 Первое введение  вакцины, например, АКДС, вызывает  слабую и непродолжительную продукцию  антител, вторая инъекция - более  выраженный и быстрый ответ,  третья - еще более сильный ответ.  Поэтому для первичной иммунизации  используют три введения, что создает так наз. грунд-иммунитет. Оптимальный интервал между двумя введениями вакцины составляет 1-2 мес, ко времени повторного введения в крови еще сохраняются антитела, индуцированные предыдущей инъекцией, и вторая доза антигена вызывает значительный их прирост. При более раннем введении, когда антитела в крови еще на максимуме, возможна элиминация антигенов вакцины этими антителами. Удлинение интервала между введениями не снижает конечной эффективности иммунизации, но удлиняет период незащищенности.

 После создания  грунд-иммунитета 3 инъекциями АКДС (как и другими инактивированными  вакцинами) высокий уровень антител  сохраняется несколько месяцев,  а затем снижается ниже протективного.  Ревакцинация приводит к быстрому, за несколько дней, подъему уровня антител, которые сохраняются в течение нескольких лет. Напротив, живые вирусные вакцины (коревая, краснушная, паротитная и др.), вызывая инфекционный процесс, уже после одной инъекции формируют стойкий иммунитет. Повторная вакцинация ими проводится для того, чтобы защитить лиц, у которых первая иммунизация оказалась неэффективной по каким-либо причинам:

•    нарушение  условий хранения и транспортировки  вакцины (холодовой цепи);

•    введение незадолго  до или после вакцинации препаратов крови;

•    возникновение сразу после прививки интеркуррентной инфекции с активной выработкой интерферона, инактивирующего вакцинный вирус;

•   рефрактерность иммунной системы ребенка на момент вакцинации.

 Повторные введения  оральной полиовакцины проводятся  также не с целью бустирования, а для подстраховки, чтобы добиться формирования иммунитета ко всем трем типам вируса, входящим в состав вакцины в условиях конкуренции вакцинных вирусов с дикими энтеровирусами, часто присутствующими в кишечнике.

На одновременное введение нескольких антигенов продукция антител происходит так же, как при их раздельном введении. Современные исследования опровергли бытовавшую в прошлом теорию «конкуренции антигенов». При введении АКДС + ОПВ мы вводим 6 вакцинальных антигенов, дополнительное введение еще 2-3 или более антигенов (например, тривакцины) приводит к созданию иммунитета и против этих инфекций. Коклюшный компонент, обладая адъювантным действием, усиливает ответ на другие антигены. ВОЗ предусматривает возможность одномоментного введения всех вакцин, показанных ребенку данного возраста. Комбинированные вакцины с 5-7 и более антигенами сокращают инъекционную нагрузку, спо­собствуя более быстрому формированию иммунитета ко многим инфекциям.

                                  Защитный эффект вакцинации

        Успехи иммунопрофилактики в XX веке были связаны, в основном, с вакцинами против бактериемических и виремических инфекций. Их эффект связан с функцией как антител, так и Т-клеток. Антитела осуществляют специфическую защиту от инфекции путем нейтрализации возбудителей и токсинов, однако, их действие ограничено лишь эпитопами 1-2 поверхностных антигенов инфекционного агента. Изменчивость эпитопов, как это, например, наблюдается у вируса гриппа, позволяет новому штамму вируса ускользать от действия антител, которые появились после предыдущей инфекции или вакцинации.

          Инфицированные клетки организма, имеющие вирусные антигены на поверхности, могут быть разрушены с помощью двух механизмов: системы антитела-комплемент и антитело-зависимой клеточной цитотоксичности. Главная функция эффекторных Т-киллеров - уничтожение возбудителя путем лизиса инфицированных клеток. Особенностью клеточного иммунитета является то, что ответ происходит на многие эпитопы одного и того же возбудителя. Это позволяет организму защищаться от возбудителей, которым свойственна антигенная изменчивость.

         Эффективность вакцин зависит от того, насколько они способны:

•       активировать представляющие антиген клетки;

•       активировать Т- и В-клетки, образовывать большое количество клеток памяти;

•       генерировать Т-хелперы и Т-цитотоксические  клетки к нескольким эпитопами;

•       обеспечить длительное сохранение антигенов в  лимфоидной ткани, откуда пополняется  пул В-клеток памяти;

       Лучше всего удовлетворяют этим критериям живые вирусные вакцины: антитела, образовавшиеся после вакцинации, при последующем заражении настолько уменьшают инфекционную нагрузку, что цитотоксические Т-клетки, реагирующие на многие эпитопы, успешно справляются с инфекцией. Быстрое нарастание уровня антител в ответ, например, на коревую вакцину, позволяет использовать активную иммунизацию и для постэкспозиционной профилактики.

      Полисахаридные вакцины (пневмококковая, гемофильная типа  b) приводят к формированию антикапсульных опсонизирующих антител, однако они плохо вырабатываются у детей до 2 лет, так как у них они не вызывают Т-клеточный ответ из-за неспособности макрофагов представлять полисахаридные антигены. В обход этого полисахариды конъюгируют с белковым носителем (дифтерийный или столбнячный анатоксин), получая полноценный иммунный ответ на вакцинацию даже у грудных детей, так как данный комплекс способен активировать Т-клетки.

      Анатоксины (дифтерийный, столбнячный) - растворимые белковые антигены, вызывают образование антитоксических (нейтрализующих) антител. В отличие от них вакцины, состоящие из убитых бактерий, вызывают появление нескольких типов антител, в том числе опсонинов, способствующих фагоцитозу возбудителя.

       Вакцина БЦЖ вызывает формирование клеточного иммунитета с появлением реакции гиперчувствительности замедленного типа на туберкулин, тогда как антитела не играют заметной роли в выработке невосприимчивости.

        Некоторые живые вакцины (оральная полиомиелитная, интраназальная гриппозная) вызывают развитие как гуморального, так и местного иммунитета. Продукция секреторных  IgA-антител обеспечивает эффективный местный иммунитет, который предупреждает проникновение вируса в эпителиальные клетки слизистой во входных воротах инфекции. Бесклеточная коклюшная вакцина за счет присутствия в ее составе филаментозного гемагтлютинина вызывает образование антител, препятствующих адгезии коклюшных бактерий на клетках эпителия дыхательных путей.

       Однако есть ряд важных для здравоохранения инфекций, на возбудителей которых циркулирующие антитела практически не влияют. Это цитомегаловирусная инфекция, хеликобактериоз, инфекция вирусом Эпштейна Бара, гепатит С, простой герпес, хламидиозы, малярия, Денге, ВИЧ-инфекция, хотя они и протекают с образованием антител, по которым и устанавливается диагноз. Залогом успеха в борьбе против них является создание вакцин, способных вызывать весь комплекс иммунологических реакций, необходимых для предотвращения инфекции.

       Адъюванты. Иммуногенность инактивированной вакцины определяется размером молекулы, химическим составом и физическим состоянием вводимого антигена. Чем крупнее и сложнее молекула, тем выше иммуногенность. Растворимые белки являются более слабыми иммуногенами, чем нерастворимые антигены.

        Для усиления иммунного ответа используют адъюванты. Необходимость применения адъювантов связана и с высокой степенью очистки вакцинного антигена, поскольку это уменьшает его иммуногенность. Адъювантами могут быть:

•               минеральные соединения;

•               микробные структуры (белки, нуклеиновые  кислоты, липополисахариды);

•               синтетические вещества (полинуклеотиды, гликопептиды, полиоксидоний);

•               цитокины и пептиды;

         В качестве адъювантов для вакцин массового применения во всем мире разрешены лишь соли алюминия и масляный адъювант. Соединения алюминия сорбируют антиген, длительно удерживают его вблизи от места инъекции, что обеспечивает лучшее взаимодействие с представляющими антиген клетками. Минеральные адъюванты стимулируют, в основном, Т-h2 иммунный ответ. Иммуногенность сорбированных препаратов (АКДС, ВГВ, анатоксины) повышается в сотни раз. При замораживании и оттаивании сорбированных вакцин происходит их десорбция, снижающая их иммуногенность и повышающая риск иммунокомплексных осложнений.

         В отечественных вакцинах Гриппол и Геп-А-ин ВАК-ПОЛ используется полиоксидоний, который позволяют индуцировать Т-независимый ответ, что обеспечивает, высокий уровень ответа на вакцинацию, даже у лиц с генетически предопределенным низким иммунным ответом. Включение полиоксидония в состав Гриппола позволило уменьшить дозу антигенов вируса гриппа, но не привело к появлению других преимуществ перед аналогичными субъединичными вакцинами. Комбинация ВГВ с полиоксидонием при вакцинации иммунодепрессив­ных детей с онкогематологическими заболеваниями также не привело к более активному специфическому ответу по сравнению с контрольной группой .

        Цитокины и пептиды в качестве адъювантов опробованы в экспериментальных работах и отдельных клинических наблюдениях, показавших их эффективность при вакцинации против некоторых вирусных инфекций (клещевой энцефалит, гепатит А, бешенство), хотя перспективность их массового применения сомнительна.