Энзимодиагностика. 2

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ

ВИТЕБСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТИЕТ

КАФЕДРА БИОЛОГИЧЕСКОЙ ХИМИИ

 

 

 

 

 

 

РЕФЕРАТ НА ТЕМУ:

ЭНЗИМОДИАГНОСТИКА

 

 

 

 

 

Выполнила: 
студентка  
фармацевтического факультета 
 
Проверила: 

 

 

 

Витебск, 2015

Содержание

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Введение  

Достижения энзимологии находят все большее применение в медицине, в частности в профилактике, диагностике и лечении болезней. Успешно развивается новое направление энзимологии-медицинская энзимология, которая имеет свои цели и задачи, специфические методологические подходы и методы исследования.

Медицинская энзимология развивается по трем главным направлениям, хотя возможности применения научных достижений энзимологии в медицине теоретически безграничны, в частности в области энзимопатологии, энзимодиагностики и энзимотерапии.

Энзимодиагностика, безусловно, является важной и актуальной для современной медицины и науки, так как биохимические исследования, белкового спектра, активности ферментов в крови и других биологических жидкостей, которые осуществляются в этой области, способствуют выявлению причин, приводящих к различным поталогиям, и помогают предотвратить или ослабить их неблагоприятное действие на организм.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Энзимодиагностика

Энзимодиагностика заключается в постановке диагноза заболевания (или синдрома) на основе определения активности ферментов в биологических жидкостях человека. Принципы энзимодиагностики основаны на следующих позициях:

• при повреждении клеток в крови или других биологических жидкостях (например, в моче) увеличивается концентрация внутриклеточных ферментов повреждённых клеток;
• количество высвобождаемого фермента достаточно для его обнаружения;
• активность ферментов в биологических жидкостях, обнаруживаемых при повреждении клеток, стабильна в течение достаточно длительного времени и отличается от нормальных значений;
• ряд ферментов имеет преимущественную или абсолютную локализацию в определённых органах (органоспецифичность);
• существуют различия во внутриклеточной локализации ряда ферментов.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Основы энзимодиагностики

При выборе материала исследований необходимо учитывать:

• Наличие исследуемых ферментов в клетках крови и возможность их освобождения при гемолизе, что исказит результаты исследования;
• Для большинства ферментов не имеет значения, определяется их активность в плазме или в сыворотке крови, но это имеет значение для тех, которые содержатся в тромбоцитах (кислая фосфатаза, лактатдегидрогеназа), так как при свертывании крови указанные ферменты будут освобождаться из тромбоцитов и ферментативная активность в сыворотке крови будет выше, чем в плазме.
• При разведении биологической жидкости активность фермента изменяется не всегда пропорционально, вследствие нарушения естественной среды фермента (белково-липидное окружение) и соотношения активаторов и ингибиторов.
• Определять активность фермента следует в свежем биологическом материале. При хранении активность многих ферментов снижается.

Изменение активности ферментов в биологических жидкостях обуславливается рядом причин.

1. Повышение активности может быть результатом ускорения процессов синтеза (щелочная фосфатаза при рахите, гепатите), некроза клеток, понижения выведения, повышении проницаемости клеточных мембран.
2. Снижение активности вызывается уменьшением числа клеток, секретирующих фермент (холинэстераза при циррозе печени), недостаточностью синтеза, увеличением выведения фермента, торможением активности (в результате действия протеиназ).
3. Степень изменения активности исследуемых ферментов зависит от массы пораженного органа, распределения ферментов между тканями, локализации ферментов во внутриклеточных органеллах. Так, аланинаминотрансфераза локализована в цитоплазме, а аспартатаминотрансфераза и в цитоплазме, и в митохондриях, глутаматдегидрогеназа — митохондриальный фермент. При воспалительных процессах в первую очередь выходят цитоплазматические ферменты, при прогрессировании заболевания наблюдается некроз клеток и происходит разрушение органелл.

 

 

 

Наличие и активность фермента можно учесть по его действию в определенных условиях, по скорости накопления продукта или исчезновения субстрата данной ферментативной реакции. Для этого применяются самые разнообразные методы:

1. Химические методы, основаны на количественном учете химических групп или веществ, образующихся (исчезающих) в растворе в результате действия фермента;
2. Газометрические методы;
3. Поляриметрические методы;
4. Хроматографические методы — путем количественной хроматографии исследуют величину накопления продукта реакции или убыли субстрата; также при помощи хроматографии разделяют изоферменты и определяют в дальнейшем их активность;
5. Вискозиметрические методы;
6. Методы электрометрического титрования;
7. Спектрофотометрические и колориметрические методы — наиболее широко применяемые в настоящее время.

Также существуют методические принципы определения активности ферментов, различающиеся по способу измерения активности ферментов:

1. Непрерывное кинетическое измерение — прямое непрерывное измерение скорости ферментативной реакции в начальной линейной части кривой при оптимизированной концентрации реактивов. Способ широко используется в автоматических анализаторах. Наиболее точными и приемлемыми являются спектрофотометрические методы, основанные на оптическом тесте Варбурга и использующие различную величину поглощения при 340 нм окисленной (поглощение отсутствует) и восстановленной (мак­симальная абсорбция) форм НАД.

Прямой оптический тест применяется для определения НАД‑зависимых дегидрогеназ (лактатдегидрогеназы, сорбитдегидрогеназы), например для ЛДГ по реакции:

Пируват + НАДH ↔ Лактат + НАД

2. Двухточечное измерение — активность фермента определяется по измерению величины накопления продукта (или убыли субстрата) за определенный промежуток времени на начальном этапе реакции.
3. Измерение по конечной точке (метод постоянного времени) — измеряется концентрация продукта после остановки реакции в определенный момент времени с помощью ингибитора либо физической инактивации фермента.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Причины, приводящие к увеличению количестваферментов в крови

Ферменты плазмы крови можно разделить на 2 группы. Первая, относительно небольшая группа ферментов активно секретируется в плазму крови определёнными органами. Например, печень синтезирует неактивные предшественники ферментов свёртывающей системы крови. Ко второй относят большую группу ферментов, высвобождающихся из клеток во время их нормального функционирования. Обычно эти ферменты выполняют свою функцию внутри клетки и не имеют физиологического значения в плазме крови. У здорового человека активность этих ферментов в плазме низкая и достаточно постоянная, так как постоянно соотношение скоростей высвобождения их из клеток и скоростей разрушения.

При многих заболеваниях происходит повреждение клеток, и их содержимое, в том числе и ферменты, высвобождаются в кровь. К причинам, вызывающим высвобождение внутриклеточного содержимого в кровь, относят нарушение проницаемости мембраны клеток (при воспалительных процессах) или нарушение целостности клеток (при некрозе). Определение в крови активности ряда ферментов хорошо налажено в биохимических лабораториях, что используют для диагностики заболеваний сердца, печени, скелетной мускулатуры и других тканей. Уровень активности ферментов в плазме коррелирует со степенью повреждения клеток.

Для энзимодиагностики имеют большое значение знания о субклеточной локализации ферментов. Так, появление в плазме крови ферментов, имеющих только цитозольную локализацию, свидетельствует о воспалительном процессе; при обнаружении митохондриальных или ядерных ферментов можно говорить о более глубоких повреждениях клетки, например о некрозе.

Однако повышение концентрации ферментов не всегда связано с повреждением тканей. При избыточной клеточной пролиферации, например при онкопролиферативных процессах, при повышенной скорости синтеза некоторых ферментов в клетках или при нарушенном клиренсе (способности вьпюдиться почками) наблюдают повышение концентрации в крови определённых ферментов. Врачам следует учитывать, что нормальные значения активности ферментов в крови детей и беременных женщин отличаются от показателей, характерных для взрослых здоровых людей.

 

Изоферменты

Ферменты, катализирующие одну и ту же химическую реакцию, но отличающиеся по первичной структуре белка, называют изофермен-тами, или изоэнзимами. Они катализируют один и тот же тип реакции с принципиально одинаковым механизмом, но отличаются друг от друга кинетическими параметрами, условиями активации, особенностями связи апофермента и кофермента.

Природа появления изоферментов разнообразна, но чаще всего обусловлена различиями в структуре генов, кодирующих эти изоферменты. Следовательно, изоферменты различаются по первичной структуре белковой молекулы и, соответственно, по физико-химическим свойствам. На различиях в физико-химических свойствах основаны методы определения изоферментов.

По своей структуре изоферменты в основном являются олигомерными белками. Причём та или иная ткань преимущественно синтезирует определённые виды протомеров. В результате определённой комбинации этих протомеров формируются ферменты с различной структурой - изомерные формы. Обнаружение определённых изоферментных форм ферментов позволяет использовать их для диагностики заболеваний.

Изоформы лактатдегидрогеназы. Фермент лак-татдегидрогеназа (ЛДГ) катализирует обратимую реакцию окисления лактата (молочной кислоты) до пирувата (пировиноградной кислоты).

Лактатдегидрогеназа - олигомерный белок с молекулярной массой 134 000 Д, состоящий из 4 субъединиц 2 типов: М (от англ, muscle - мышца) и Н (от англ, heart - сердце). Комбинация этих субъединиц лежит в основе формирования 5 изоформ лактатдегидрогеназы (рис. 2-35, А). ЛДГ1 и ЛДГ2 наиболее активны в сердечной мышце и почках, ЛДГ4 и ЛДГ5 - в скелетных мышцах и печени. В остальных тканях имеются различные формы этого фермента.    

• Изоформы ЛДГ отличаются электрофоретической подвижностью, что позволяет устанавливать тканевую принадлежность изоформ ЛДГ.

Рис. 1. Изоформы лактатдегидрогеназы. А - строение различных изоформ ЛДГ; Б - распределение на электрофореграмме и относительные количества изоформ ЛДГ в различных органах; В - содержание изоформ ЛДГ в плазме крови в норме и при патологии (электрофореграммы - слева и фотометрическое сканирование - справа).

 

• Появление в эволюции различных изоформ ЛДГ обусловлено особенностями окислительного метаболизма тканей. Изоферменты ЛДГ4 и ЛДГ5 (М-типы ЛДГ) работают эффективно в анаэробных условиях, ЛДГ, и ЛДГ2 (Н-типы) - в аэробных, когда пируват быстро окисляется до СО2 и Н2О, а не восстанавливается до молочной кислоты.
• При ряде заболеваний исследуют активность ЛДГ в плазме крови. В норме активность ЛДГ составляет 170-520 ЕД/л. Повышение активности наблюдают при острых поражениях сердца, печени, почек, а также при мегалобластных и гемолитических анемиях. Однако это указывает на повреждение лишь одной из перечисленных тканей.
• Для постановки диагноза необходимо исследование изоформ ЛДГ в плазме крови методом электрофореза. На рис. 2-35, В представлены электрофореграммы плазмы крови здорового человека, больного инфарктом миокарда и больного гепатитом. Выявление в плазме крови тканеспецифичес-ких изоформ ЛДГ используют в качестве диагностического теста повреждения данной ткани.

Изоформы креатинкиназы. Креатинкиназа (КК) катализирует реакцию образования креатинфосфата:

Молекула КК - димер, состоящий из субъединиц двух типов: М (от англ, muscle - мышца) и В (от англ, brain - мозг). Из этих субъединиц образуются 3 изофермента - ВВ, MB, MM. Изофермент ВВ находится преимущественно в головном мозге, ММ - в скелетных мышцах и MB - в сердечной мышце. Изоформы КК имеют разную электрофоретическую подвижность (рис. 2).

 

Активность КК в норме не должна превышать 90 МЕ/л. Определение активности КК в плазме крови имеет диагностическое значение при инфаркте миокарда (происходит повышение уровня МВ-изоформы). Количество изоформы ММ может повышаться при травмах и повреждениях скелетных мышц. Изоформа ВВ не может проникнуть через гематоэнцефалический барьер, поэтому в крови практически не определяется даже при инсультах и диагностического значения не имеет.

Дополнительным подтверждением диагноза инфаркта миокарда служит обнаружение активностей ферментов ACT и ЛДГ в крови больных. Динамика изменений этих активностей также представлена на этом рисунке. Активность ACT в норме составляет 5-40 МЕ/л. При инфаркте миокарда активность ACT повышается через 4-6 ч; максимум активности наблюдают в течение 2-3 дней. Уровень ЛДГ также увеличивается в плазме крови через несколько часов после закупорки кровеносного сосуда; максимум активности наблюдают на 3-4-й день, затей наступает постепенная нормализация активности. Уровень повышения активности ЛДГ коррелирует с размерами повреждения сердечной мышцы.

 

 

 

 

 

 

Рис. 2. Изменение активности ферментов в плазме крови при инфаркте миокарда.

Амилаза. α‑Амилаза (диастаза, 1,4‑a‑D‑глюкангидролаза) катализирует гидролиз α‑1,4‑глюкозидных связей крахмала, гликогена и родственных им полисахаридов до мальтозы, декстринов и других полимеров. Молекулярная масса фермента около 48000 Д. В состав молекулы входит атом кальция, который не только активирует фермент, но и защищает его от действия протеиназ, активность амилазы возрастает при влиянии ионов хлора. В крови она представлена двумя изоферментами: панкреатическим — P‑тип и слюнным — S‑тип, каждый из которых делится на несколько фракций. Изофермент S‑типа составляет в целом 45‑70% (в среднем 57%), остальное приходится на долю P‑типа. Оба изофермента имеют почти идентичные каталитические и иммунологические свойства, незначительно отличаются по электрофоретической подвижности, но хорошо разделяются при гель‑фильтрации на ДЭАЭ‑сефадексе. Существует также макроамилаза, которая не выделяется почками, но может встречаться в сыворотке крови в норме (около 1 % здоровых людей) и патологии (2,5 %).

Высокая активность амилазы наблюдается в околоушной и поджелудочной железах. Вместе с тем, ее активность, хотя и намного ниже, обнаруживается в толстом и тонком кишечнике, скелетных мышцах, печени, почках, легких, фаллопиевых трубах, жировой ткани. В крови фермент связан как с белками плазмы крови, так и с форменными элементами. Активность фермента одинакова у мужчин и у женщин и не зависит от характера принимаемой пищи и времени суток.

Существующие методы изучения активности a‑амилазы в биологических жидкостях делятся на две большие группы:

1. Сахарифицирующие (редуктометрические), основанные на исследовании образующихся из крахмала сахаров по редуцирующему действию глюкозы и мальтозы.

2. Амилокластические, базирующиеся на определении остатка нерасщепленного крахмала:

• по степени интенсивности его реакции с йодом. Эти методы более чувствительны и специфичны, но точность их во многом зависит от качества крахмала и оптимизации условий определения.
• по вязкости суспензии крахмала, не отличаются высокой точностью и сейчас не применяются.

3. Методы с применением  хромогенных субстратов –– основаны  на использовании комплексов  субстрат‑краситель, которые под действием α‑амилазы распадаются с образованием водорастворимого красителя.

4. Методы, основанные на  сопряженных ферментативных реакциях.

Холинестераза. Холинэстеразы — ферменты класса гидролаз, расщепляющие различные эфиры холина с образованием холина и соответствующих кислот. В крови человека различают два типа фермента: "истинную" или ацетилхолинэстеразу (ацетилгидролаза ацетилхолина, АХЭ, КФ 3.1.1.7) и "ложную" холинэстеразу (ацилгидролаза ацилхолина, ХЭ). Ферменты различаются по свойствам, локализации, субстратной специфичности.

Ацетилхолинэстераза содержится преимущественно в эритроцитах, также ее активность достаточно высока в нервной и мышечной ткани. Для сыворотки, печени, поджелудочной железы характерен второй тип холинэстеразы. Ацетилхолинэстераза обладает абсолютной субстратной специфичностью — ее субстратом является только ацетилхолин, в то же время холинэстеразе свойственна абсолютная групповая субстратная специфичность — она расщепляет, кроме ацетилхолина, такие субстраты как бензоилхолин, сукцинилхолин, бутирилхолин и другие эфиры холина.

Холинэстераза синтезируется в печени, представляет собой высокомолекулярный белок (ММ около 300 тыс Д), связанный с альбуминовой фракцией, ее уровень в сыворотке коррелирует с содержанием альбуминов.

Для изучения активности холинэстеразы используют различные способы:

А. Биологические, заключающиеся в обработке исследуемой сывороткой ацетилхолина, после чего им воздействуют на мышцу животного и по степени реакции мышцы судят о количестве ацетилхолина, разрушенного ацетилхолинэстеразой и об активности фермента.

Б. Химические:

По количеству уксусной кислоты, образованной в результате ферментативной реакции:

♦ манометрически учитывают объем углекислого газа, выделившегося из карбонатного буфера под влиянием кислоты;

♦ фиксируют сдвиг pH раствора по изменению его окраски в присутствии индикаторов (фенолового красного, бромтимолового синего, гидроксиламина);

♦ измеряют количество щелочи, пошедшей на титрование уксусной кислоты.

Спектрофотометрическое определение изменения абсорбции света при гидролизе субстратов, например, бензоилхолина с максимумом поглощения 240 нм.

Определение ферментативной активности: а) по количеству расщепленного ацетилхолина хлорида; б) по накоплению продуктов гидролиза в растворе –– по взаимодействию тиохолина (продукта гидролиза специфических субстратов бутирилтиохолина и ацетилтиохолина) с 5,5'‑дитио‑бис‑2‑нитробензойной кислотой.

Электрохимические методы:

♦ кондуктометрия;

♦ устанавливают величину pH до и после реакции.

В качестве унифицированных методов утвержден колориметрический метод с субстратом ацетилхолина хлоридом и индикатором феноловым красным и экспресс‑метод с использованием индикаторной бумаги.

 

 

 

 

 

Заключение

Использование энзимных тестов является важным критерием в распознавании врожденных энзимопатий, характеризующихся специфическими нарушениями обмена веществ и жизнедеятельности в связи с отсутствием или недостатком того или иного фермента.

Диагностическая ценность энзимных тестов достаточно высока; она зависит как от специфичности данного вида гиперферментемии для определенных болезней, так и от степени чувствительности теста, т.е. кратности возрастания активности фермента при данном заболевании относительно нормальных значений. Однако большое значение имеет время постановки теста, т.к. появление и продолжительность гиперферментемии после повреждения органа различны и определяются соотношением скорости поступления фермента в кровоток и скорости его инактивации. При отдельных заболеваниях надежность их диагностики может быть повышена исследованием не одного, а нескольких изоферментов. Так, например, достоверность диагноза острого инфаркта миокарда возрастает, если в определенные сроки отмечено повышение активности креатинфосфокиназы, лактатдегидрогеназы и аспарагиновой аминотрансферазы. Степень выявляемой гиперферментемии объективно отражает тяжесть и распространенность повреждения органа, что позволяет прогнозировать течение заболевания.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Литература

1. Биохимия для студента [Электронный ресурс] / Основы энзимодиагностики. – Режим доступа: http://biokhimija.ru/enzymes/obchie-svedenia.html. – Дата доступа: 22.11.2015
2. Биохимия для студента [Электронный ресурс] /Амилаза. – Режим доступа: http://biokhimija.ru/enzymes/amilase.html. – Дата доступа: 22.11.2015
3. Биохимия для студента [Электронный ресурс] / Холинэстераза. – Режим доступа: http://biokhimija.ru/enzymes/cholinesterasa.html. – Дата доступа: 22.11.2015
4. Северин Е.С., Алейникова Т.Л., Осипов Е.В., Силаева С.А. Биологическая химия. – М.: ООО «Медицинское информационное агенство», 2008. – 119-123 с.