Генетикалық инженерия негіздері

Қ.А.ЯСАУИ АТЫНДАҒЫ ХАЛЫҚАРАЛЫҚ ҚАЗАҚ-ТҮРІК       УНИВЕРСИТЕТІ

МОЛЕКУЛАЛЫҚ БИОЛОГИЯ ЖӘНЕ МЕДИЦИНАЛЫҚ ГЕНЕТИКА

 КАФЕДРАСЫ

 

 

 

 

 

СӨЖ

 

Тақырыбы: Генетикалық инженерия негіздері

 

 

 

 

 

 

                                                      Орындаған: Әбділдаев Қ.

                                                      Қабылдаған: Еримова А.

 

 

 

Түркістан – 2015ж.

                         

                                            Жоспар

 

І Кіріспе

ІІ Негізгі бөлім

1. Генетикалық инженерияның даму тарихы

2. Генетикалық инженерияның өту механизмдері

3. Саланың жеткен жетістіктері

4. ГМО дегеніміз  не?!

 

ІІІ Қорытынды

IV Пайдаланылған әдебиеттер

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

                                           

 

                                            Кіріспе

     

  Ген инженериясы молекулалық биологияның жаңа саласы. Ол лабораториялық әдіс арқылы генетикалық жүйелер мен тұқымы өзгерген организмдерді алу жолын қарастырады. Ген инженериясының пайда болуы генетиканың, биохимияның, микробиологияның және молекулалалық биологияның жетістіктерімен байланысты. Бұл атаудың екі түрі қол-данылады: «генетикалық инженерия» және «ген инженериясы». Соңғы кезде «генетикалық инженерия» жалпылама түрде колданылып жүр, ген инженериясы да осының ішіне кіреді. Гендік инженерия нәтижесінде ауылшаруашылық, медицина, биотехнология және т.б. секілді ғылым салалары көптеген жетістіктерге жетіп, өзіндік даму тарихында адамзат тарихындағы төңкеріс боларлықтай жаңалықтар ашылды. Гендік инженерия өз кезегінде молекулалық биологиямен және медициналық генетикамен өте тығыз байланысты. Себебі бұл саланың өзі тірі молекулалық деңгейде тікелей ДНҚ-ға байланысты жұмыс жасайды.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

                                                    -3-

                   Гендік инженерия ғылымының даму тарихы

Молекулалық биология ғылыми жетістіктерінің нәтижесінде пайда болған ген инженериясы организмнің бағалы қасиетін сақтап қана қоймай оған жаңа әрі саналы қасиет те бере алады. «Инженерия» деген атау құрастыру деген мағынаны білдіреді. Яғни ген инженериясы дегенді ген кұрастыру деп түсіну қажет. Ген инженериясының дәуірі басталмай тұрып 1969 жылы Г. Корана нуклеотидтерді белгілі бір жүйемен орналасқан ДНҚ синтезінің методологиясын жасап берген. Жекеленген дербес амин қышқылы — ашытқының аланиндік тРНҚ-ның бастауыш жүйесі ашылғаннан кейін Г. Корана химиялық жолмен осы РНҚ-ның көлемі 77 полинуклеотидтен тұратын кодтық бөлігін синтездеді. Кейіннен 1979 жылы осы лабораторияда ішек таяқшасының тирозиндік тРНҚ-сы синтезделді және ол Т4 бактериофагының құрамына енгізіліп, бактерияның клеткасында жұмыс істеді.

Ген инженериясының дүниеге келген уақыты 1972 жыл деп есептеледі. Сол жылы Т. Берг алғаш рет пробиркада үш түрлі микроорганизмнің ДНҚ-ларының фрагменттерінен жаңа гибридтік ДНҚ құрастырды. Бірақ маймылдың рак вирусының, бактериофагтың және ішек бактериясының гендік ДНҚ-ларынан құрастырылған ол гибридтік ДНҚ-ның клетка ішінде ойдағыдай жұмыс істей алатындығы тексерілмеді, себебі құрамында рак вирусының нуклеин қышқылы болғандықтан ғалымдар тәуекелге бармады.

Клеткада жұмыс істей алатын гибридтік ДНҚ-ны 1973-74 жылдары С. Коэн мен Г. Бойер құрастырды. Олар басқа организмнен бөліп алған ДНҚ фрагментін (генін) бактерия плазмидасының құрамына енгізді. Ол плазмидадағы бөтен гендердің алғаш рет жаңа организм ішінде жұмыс істей алатынын көрсетті. Соның артынша-ақ дүние жүзінің көптеген

-4-

лабораторияларында жұмыс істей алатын әр түрлі плазмидалар алынды. Совет елінде ондай бөтен гені бар плазмида академик А.А. Баевтың басшылығымен жасалды. Жануарлар клеткаларымен жүргізілген тәжірибелерде бір клетканың ядросын екіншісімен алмастыруға, екі немесе бірнеше эмбриондарды қосып біріктіруге, оларды бірнеше бөлікке бөлшектеуге болатыны анықталды. Мыс., генотиптері әр түрлі тіндердің клеткаларын біріктіру арқылы тышқанның аллофенді особьтары (фенотипі әр түрлі дарабастар) алынды. Гендік инженерия-ның теориялық негізіне генетикалық кодтың әмбебаптылығы жатады. Бір ғана кодтың (триплеттің) әр түрлі ағзадағы белок молекулаларының құрамына енетін амин қышқылдарын бақылай алатындығына байланысты, ДНҚ молекуласының кез келген бөлігін басқа бөтенклеткаға апарып салу, яғни молек. деңгейде будандастырылу теориялық тұрғыдан алғанда мүмкін екені анықталды. Жануарлар, өсімдіктер және микроорганизмдергендерінің қызметін қолдан басқаруға болатындығы дәлелденді. Ауыл шаруашылығында өсімдіктің атмосфералық азотты өзіне жинақтап алуы — үлкен мәселе. Осыған байланысты 1970 жылдары азотты фиксациялауға қабілеті жоқ пішен таяқшасына азотты жинақтай алатын, басқа бір бактерияның гені салынып, азотты жинақтау қасиетіне ие болды. Мед. саласында жаңа гендерді енгізу арқылы тұқым қуалайтын ауруларды емдеуге болады. Қазіргі кезде ауру адамдардан зат алмасудың 1000-нан аса әр түрлі тұқым қуалайтын өзгерістері табылған.

 

                                                        -5-

 

 Микроорганизмдер генетикасы  мен молекулалық биологияның  екпінді дамуы біздің ғасырымыздың   70-жылдарының бірінші жартысында   генетикалық инженерия, ген инженериясы немесе рекомбинатты ДНҚ техникасы деп аталатын жаңа эксперименттік технологияның пайдаболуына әкелді. ТМД елдерінде алғашқы — екі, ал батыста соңғы аталу кең қолдану алды.

Генетикалық   инженерия деп   in vitro   жағдайында функциялық пәрменді генетикалық құрылымдарды  (рекомбинантты ДНҚ-ны) құрастыруды және оларды   тіріклеткаларға енгізуді түсінеді. «Генетикалық инженерия» және «ген инженериясы» терминдері синоним ретіңде қаралғанмен, олардың мағынасы бірдей емес: генетикалық инженерия — генетикамен байланысқан, ал ген инженериясы — тек генге ғана қатысы бар. Рекомбинантты ДНҚ (рДНҚ) дегеніміз әр текті  ДНҚ-лардан құралған   (табиғи немесе синтетикалық ДНҚ фрагменттерін жалғастыру  арқылы) және клеткаларда репликациялана алатын генетикалық құрылымды түсінеді. Бүл арадан, біз үш терминнің де жалпы анықтамасы бір бағытта екендігін байқауымыз керек,  реалдық тұрғыдан олардың  мақсаттары.бірдей және қазіргі жаңа биотехнологияның негізгі, әрі перспективалы әдісі болып саналады.

Ген инженериясы мынадай кезеңдерден тұрады: 1) генді (ДНҚ фрагментін) алу; 2) рекомбинантты ДНҚ . молекуласын құрастыру; 3) реципиент клеткасына рекомбинантты ДНҚ молекуласын енгізу; 4) қажет рекомбинантты ДҢҚ молекулалары бар клондарды (бактерияық клеткаларды) ортадан табу. 

Ген инженериясында генді мынадай әдістермен алуға болады:

 

                                                        -6-

 

клеткадағы ДНҚ-дан тікелей кесіп алу; химиялық жолмен синтездеу; аРНҚ-дан кері транскриптаза арқылы синтездеу. Бірінші әдіс ген инженериясының дамуының алғашқы кезеңінде қолданыла бастады. Белгілі организмнің ДНҚ-сын тугелімен  әр түрлі рестриктазалармен үзіп, әр түрлі фрагменттер алады. Содан кейін оны клетка ішінде «аркалап» кіргізе алатын сақиналы (дөңгелек) плазмидалармен жалғайды, Ол үшін плазмиданы да рестриктазалармен  үзеді, оған әлгі ДНҚ фрагменттерін қосып жалғап, қайтадан бүтін плазмидалар алады. Бұл плазмидалардың әрқайсысының құрамында бір немесе бірнеше бөтен ДНҚ фрагменті (гені) болады, Одан кейін ол плазмидаларды қайтадан бактерияға еңгізеді. Осының нәтижесінде бактерия клеткасының әрқайсысында басқа организм генінің, бір түрі болады, Осындай әртүрлі бөтен гендері бар бактерия клеткаларының жиынтығын немесе коллекциясын «гендер банкі» кейде «гендер кітапханасы» деп атайды. Зерттеушілер ол банкіден уақытында қажет белоктың генін жаңадан тауып алады. Осындай гендер банкі қазір Ресейде, Батыс Европада және АҚШ-та жасалған. Химиялық жолмен жасанды генді 1969 жылы Г. Корана синтездеген. Бірақ оған жалғасқан промотор тізбегі мен транскрипцияны аяқтайтын кодондар болмағандықтан, ол клетка ішінде ешбір қызмет көрсете алмады. Гендерді химиялық синтездуге нуклеин қышқылдарындағы нуклеотидтердің орналасу тәртібін анықтау әдісін тапқаннан кейін  ғана  мүмкіндік  туды. Бұл  әдістерді  тапқан  Д. Джильберт пен  Ф. Сэнгер. Ғалымдар  генді  белоктың құрамындағы амин қышқылдарына  қарап  отырып  синтездеуді де үйренді, (3 нуклеотид — 1 кодон — 1 амин қышқылы деген заңдылық бойынша). Соның ішінде қолдан синтезделген ең ұзын ген, адамның самототропин (өсу) гені, ол 584 нуклеотидтен тұрады. Оны бактериядағы басқа геннің промоторына жалғастырып, плазмида арқылы бактерия клеткасына еңгізді. Соның нәтижесінде бактерияның бір клеткасы 3 млн-ға дейін адам самототропин молекуласын жасай алатын болды. Адам инсулині де химиялық жолмен синтезделіп,  осы айтылған жолмен бактерияға еңгізілді. Инсулин генін 40 аса алты мүшелік олигонуклеотидтерден тұратын түрінде бөліп алып, кейін ДНҚ-лигазаның кемегімен біріктірген. Алынған үзындығы 271 және 286 нб қос тізбекті полинуклеотидтер плазмидаға еңгізілді. Оған қоса бұдан молекулалардың экспрессиясын камтамасыз ететін, ДНҚ-ның реттеуші учаскелері де енгізілді. Клонданған (өркендетілген) гендер проинсулиннің синтезін кодтады, ал оны қарапайым химиялық өңдеу арқылы қос А және В полипептидтік тізбектен тұратын, ұзындығы 21 және 30 амин қышқылдарының қалдықтарынан тұратын, өзара дисульфидтік байланыстары бар белсенді гормонға айналдыруға болады. Жасанды әдіспен генді ферменттік синтезге сүйене отырып, кері транскрипция механизмнің көмегімен алуға да болады. Бұл механизм РНҚ-ға тәуелді ДНҚ-полимеразаның немесе кері транскриптазаның (ревертазалар) белсенділігіне байланысты. Бұл фермент ең алғаш он-когендік (залалды ісік) вирустарды

                                                            -7-

 зерттегенде  табылған. Фермент әртүрлі РНҚ-ларда, синтетикалық полинуклеотидтерді қоса, ДНҚ-ның көшірмесін құра алатын қабілеті бар. Ревертазаның көмегімен, сәйкес иРНҚ-ның қатысуымен, іс жүзінде кез келген бөліп алуы жақсы игерілген генді алуға болады. Бұл әдісті белгілі бір тканьдарда өте қарқынды транскрипцияланатын гендерге қолдану тиімді. Осындай әдістермен адамның, сүтқоректілер мен құстардың кодтаушы глобиндері, өгіздің көз хрусталигінің (көз жанары) белогы, жұмыртқа белогы, жібек фибрионы (талшығы) және тағы басқа гендер алынды да өркендетілді. Ферментті синтездеп, пробиркада РНҚ молекуласынан ДНҚ генінің комплементарлы тізбегін жазып алуды транскрипция дейді. Синтездеу үшін қолданылатын жүйе құрамында ДНҚ-ға кіретін төрт нуклеотид, магний ионы, кері транскриптаза ферменті және генмен кодталған көшірмесін алатын иРНҚ бар. иРНҚ-дан кері транскрипта-за, оған сәйкес ДНҚ тізбегін синтездеп, сол ферменттің көмегімен ДНҚ-ның екінші тізбегі синтезделеді. Осының нәтижесінде иРНҚ-да синтезделген ген құрылымына ұқсас ген пайда болады. Осы әдіспен көптеген елдің лабораториясында бірнеше гендер тобы алынды. Гендік инженерияда жасанды гендер ситездеумен қатар рекомбинантты молекуласын құрастыру үшін табиғи гендер де пайдаланылады. Ол гендерді векторлық ДНҚ молекуласына байланыстыру бактериялық ферменттер рестриктазалар арқылы іске асырылады. Бактерия клеткасындағы қорғанштық қызмет атқаратын рестриктазалар клеткаға енген бөтен ДНҚ-ны жою мақсатыкда оны бірнеше бөліктерге кесіп тастауға қабілетті келеді. Кесілген ДНҚ фрагменттері шамалы уақыттан кейін комплементарлық принцкп бойынша лигаза ферментінің көмегімен қайта жалғанып, ДНҚ-ның сақина тәрізді пішіні қалпына келеді. Осы әдіспен түрлі клеткалардан немесе хромосома учаскелерінен алынған ДНҚ кесінділерін жалғастырып рекомбинантты ДНҚ молекуласын алуға мүмкіндік туды. Векторлар ретінде ДНҚ-дан басқа да фогтар, вирустар, пазмидтер, эписомдар қолданылады. Генетикалық инженерияның алдына қойған мақсаты алуан  түрлі, өйткені бұл әдісті  пайдалану  турлі деңгейде жүреді. Олар: организмдік деңгей клеткалық деңгей гендік  деңгей Организмдік деңгейде генетикалық  инженерияны қолданудың мысалы ретінде аллофендік жануарларды (тышқанды) алуға болады. Бірнеше аналық тышқанның жатырынан дамудың 8 бластомерлік кезеңіндегі ұрықтарды шығарып алып,  түтікше ішінде ол бластомерлерді бір-бірінен  ажыратады, Түрлі особътардан алынған осы бластомерлерді араластырып түзілген қоспа бластуланы дамуының  гаструлалық кезеңінде бір аналық тышқанның жатырына енгізіп дамуды жалғастырады. Дүниеге келген аллофенді тышқанның фенотипінде барлық ата-аналарна тән белгілер қайталанғанымен, бірқатар  өзіндік  жаңа қасиеттер де пайда болады. Ендеше, ересек жағдайда ұлпалары бір-біріне иммунологиялық жағынан сәйкес келмейтін особьтардың клеткаларынан осы жолмен қалыпты дамып  жетіліп, тіршілік етуге  қабілетті аллофендік ұрпақ алуға мүмкіндік туады.

                                                      -8-

 

 Клеткалық  деңгейде әр түрге жататын организмдердің сомалық клеткаларын будандастыру арқылы бірнеше генотиптен  құралған  бұдан клетка алынады. Мысалы «адам-тышқан» будандық клетканы алып, одан адам хромосомаларын біртідеп шығарып тастайды, Жойылған қайсы бір хромосомадан кейнгі байқалатын клеткалық  фенотиптік өзгерістерге қарай отырып адамның тіркесу топтарының гендік құрамын анықтайды. Гендік децгейде — тұқым  қуалаушылықты басқару жолы гендік инженерия деп аталады. Мұндағы мақсат қолдан жасанды гендер алып немесе даяр гендерді басқа организмдердің геномына енгізу арқылы олардың фенотиптерін қалаған бағытта  өзгерту. Гендік инженерияның негізгі әдістері осы ғасырдың 60-70 жылдары қолданыла бастады. Бұл әдіспен организмдердің  генотиптері мен  рекотиптерін өзгерту жұмыстары мынадай төрт кезеңнен тұрады: Қажетті генді донорлық клеткадан бөліп алу немесе жасанды түрде синтездеу; Реципиент-клеткасына енгізуге қабілетті векторлық ДНҚ-ға осы генді байланыстыру; Реципиент-клеткасының геномына генді енгізу. Гендердің экспериментальды    түрде    басқа    геномга    тасымалдануын      трансгенез деп атайды; Геннің жұмыс істеуіне сай  транскрипция және трансляция нәтижесінде реципиент-клетканың фенотиптік өзгерістерін бақылау.Қазіргі генетикада генді организмнсн тыс синтездеудің екі әдісі бар: химиялық және ферментативтік. Гендік инженерия жетістіктерінің қолданылуы Гендік инженерия жетістіктерін қазіргі кезде өкеркәсіптік көлемде жануарлар мен адамның антибиотиктерін, витаминдерін, гормондарын синтездейтін микроорганизмдердің жаңа штамдарын шығаруға  пайдалануда. Соңдай-ақ, адамның  көптеген ауруларына себепші болатын вирустың бөліп алынған гендері бактерия клеткасына енгізіліп жан-жақты зерттелуде. Олай болса, адамзатты бірқатар тұқым  қуалайтын  аурулардан  арылтуда гендік: инженерияның болашағы зор деп есептеледі.

 

 

 

 

 

 

 

                                                   -9-

   1979 жылы Ю. А. Овчинников пен М. Н. Колосовтың басшылығымен ферменттердің көмегімен химиялық жолмен адам мен жануарлардың гормонының гендері – энкефалин және брадикинин синтезделді. Химиялық – ферменттік синтездеу ұсақ гендерді алу үшін ген иженериясында кеңінен қолданылады. 1970 жылы Г. Темин, Т. Мизутани және Д. Балтимор кері трнскриптаза (ревертаза) ферментін ашты. 1972 жылы кейбір онкогенді (рак) вирустар кері транскриптаза ферментінің көмегімен РНҚ – ның үлгісінен ДНҚ синтездейтіні ашылды. Одан әрі жүргізілген зерттеулер ДНҚ көшірмесінің пайда болуы үшін онкогендік вирустардың ғана РНҚ – сы ғана емес, сондай  ақ жасанды полирибонуклеотидтердің де үлгі бола алатындығын көрсетті. Бұл кез келген жеке гендерді (ДНҚ), олардың РНҚ көшірмелерін қолдана отырып ферменттік синтездеуге болатынына мүмкіншілік туғызды. Жасанды генді рак вирустарынан бөлініп алынған транскриптаза ферменті  арқылы синтездеу қазір кеңінен қолданылып жүр.  Кері транскриптазаның РНҚ – ға қарап, оның тізбегіне сәйкес ДНҚ тізбегін жасайтынын айттық. Яғни кез келген организмнен бөлініп алынған РНҚ – дан оған сәйкес генді (ДНҚ - ны) жасауға болады. Осы әдіспен соматотропиннің иРНҚ – сы пайдаланылды (иРНҚ клеткаларында өте көп синтезделеді екен). Ю. А. Овчинниковтың басшылығымен интерферон гені кері транскриптаза арқылы жаса келіп, соңында ең көп мөлшерде интерферон жасайтын бактерия түрі алынды. Ферментті синтездеп, пробиркада РНҚ молекуласынан ДНҚ генінің комплементарлы тізбегін жазып алуды транскрипция дейді. Синтездеу үшін қолданылатын жүйе құрамында ДНҚ – ға кіретін төрт нуклеотид, магний ионы, кері транскриптаза ферменті және генмен кодталған көшірмесін алатын иРНҚ бар. иРНҚ – дан кері транскриптаза, оған сәйкес ДНҚ тізбегін синтездеп, сол ферменттің көмегімен ДНҚ – ның екінші тізбегі синтезделеді. Осының нәтижесінде иРНҚ – да синтезделген ген құрылымына ұқсас ген пайда болады. Осы әдіспен көптеген елдің лабораториясында бірнеше гендер тобы алынды.

В. А. Энгельгардтың басшылығымен «ревертаза» жобасы жасалған. Осы ферменттің көмегімен гендер синтезделеді. Бұл жобаны іске асыру үшін көптеген инситуттар, сондай – ақ ЧССР және ГДР ғылым академиялары қатысты. Осының нәтижесінде 1974-1978 жылдар арлығында көгершіннің, үй қоянының және адамның глобин гені, сонымен қатар тышқанның бауыр митохондриясының гені, иммундық белок генінің бөлшектері және т.б. гендер синтезделді. Ревертазаның көмегімен синтезделген гендердің реттеуші учаскесі болмайды, сондықтан олардың қалыпты жұмыс істеуі үшін реттеуші элементтер жалғау керек. Ол элементтер химиялық синтез жолымен немесе бактерия клеткаларынан алынады, бұның өзі едәір қиындыққа соғады. Жоғарыда айтылған әдістерден басқа, генді трансдукция фагтарының көмегімен алуға болады. Бұл әдіспен 1969 жылы Дж. Беквитц бірінші рет лактоза генін (лакген) ішек таяқшасынн бөліп алды. Алайда бұл әдіс үнемі қолдануға жарамсыз, себебі ол фагтыбелгілі бір жерге орналастыруды талап етеді. Сондықтан еректі гендерді тасымалдауға қолайлы векторларға орналастырып көбейтіп, клетка – реципиенттер құрамына кіргізеді.

-10-

І.2 Рестрикция ферменттері

Рестрикциялау – модификациялау құбылысы 50 – ші жылдары байқалған болатын. Рестрикция тоқтату деген мағынаны білдіреді, ал модификация – молекуланың белгілі топтарын химялық жолмен немесе оларға басқа топтарды жалғау арқылы өзгерту. Рестрикция мен модификациялау құпиясын 1962 жылы В. Арбер ашты.

Бактерияның «өзінің» нуклеин қышқылын «бөтен» фагтардың (вирустардың) нуклеин қышқылынан ажырататын арнайы ферменттері болады. Рестрикция ферменттері фагтың нуклеин қышқылын үзіп, оның клеткада көбеюіне жол бермейді. Рестриктазалармен қатар бактерияларда метилаза деген фермент бар. Ол бактерияның өзінің ДНҚ тізбегіндегі азоттық негіздерге белгілі мөлшерде әрбір репликациядан кейін метил тобын (CH3) жалғап, модификациялап отырады. Метилденген ДНҚ – ны рестриктаза «өзінікі» санап, оған «тиіспейді». Бұл бактериялардағы өзіндік бір «иммундық жүйе» іспеттес. Дегенмен, кейде бактерия клеткасына енген фагтың кейбір нуклеин қышқылы кездейсоқ метильденіп кетеді. Осы қателігінен бактерияның өзі фагтың әсерінен қырылып кетеді. Осы құбылысты Haemophilus influnzae штаммынан Х. Смит, Д. Натанс және В. Арбер 1970 жылы ашты. Ол Hind ІІІ деп белгіленді. Рестриктазалар табиғаттың ген инженериясына жасалған таптырмас құралы. Бактерия әр түрлі болғандықтан олардың рестриктазалары ДНҚ – ны әр түрлі жолмен үзеді. Қазір 400 – ден аса рестриктаза түрі белгілі және олар ДНҚ – ны бір – бірінен өзгеше 120 жерінен үзе алады. Яғни зерттеуші рестриктазаны таңдай отырып, ДНҚ – дан қалаған ферментті немесе генді бүлдірмей бүтін күйінде кесіп алады. Генді бөліп алу мен ген өркенін (клондарын) алу үшін әр түрлі объектілер (бактериялардан, сүтқоректілер клеткаларынан, құстардан т. б. алынған) және вирустар жұқтырылған ортада өсірілетін ерекше ферменттер құрал ретінде пайдаланады. Негізінде олар үш түрлі ферменттер: рестриктазалар, лигаза және кері транскриптаза.

Рестриктазалар – дезоксирибонуклеазалардың ДНҚ молекуласын қысқа немесе ұзын бөлшектерге тіпті жеке нуклеотидтерге дейін кесетін ферменттердің бір түрі. Рестриктазалардың ерекшеліктері ДНҚ молекуласын  кез келген жерден кеспей тек белгілі нуклеотидтер арасынан кесуінде. Әрбір  рестриктазаның таңдайтын нуклеотидтер орналасу тәртібі бар. Сондықтан рестриктазалар ДНҚ – ны бірнеше жүздеген немесе мыңдаған нуклеотидтер жұптарынан тұратын бөлшектерге үзеді.

Рестриктазалардың үш класы белгілі, олар өзара ДНҚ – ны тану үшін және үзілген жерін білу, белок құрылымы және реакцияға түсу үшін қажетті шартты анықтауы бойынша өзгешеленеді. Ген – инженерлік жұмыстарында ДНҚ – ның қос тізбегін таныған учаскесінің зонасында үзетін екінші кластағы ферменттер қолданылады. әдетте фермент 4-6 нб тұратын ерекше жүйелілікті таниды, ол палиндром (гр. «palindromeo» - артқа жүгіру, яғни алға да артқа қарайда бірдей оқылу керек) және оны ортасынан немесе одан шеткерірек кеседі. Соңғы жағдайда бір тізбекті ұштар пайда болады, оларды «жабысқақ» деп атайды. Мұндай бір рестриктазаның әсерінен пайда болған ұштар негіздердің комплементарлығына сай өзара будандаса алады.

                                            -11-

Бұл әр түрлі ДНҚ молекулаларының болашақта бірігу мүмкіншілігін туғызады.

Рестрикция ферменттері бөлініп алынған организмнң атымен белгіленеді. Бактерияның түрінің үш әріпін пайдаланады, мысалы, Bgl ІІ - Bacillus globidi, Eco RL – E.coli, Hind ІІІ – Haemophilis influenzae т.с .с. Үш әріптен кейін курсивпен әріптік бейне (символ) беріледі, ол генетикалық линиясын немесе штаммды білдіреді.

Лигаза – ДНҚ – ның бос ұштарын бір – біріне жалғайтын фермент. Бұл фермент қалыпты клеткаларда ДНҚ синтезіне және репарация (қалпына келу) процестеріне қатысады, яғни ДНҚ молекуласының біраз бүлінген жерлерін қалпына келтіруге қатысады.

Кері транскриптаза – ДНҚ – полимераза тәріздес фермент. Бірақ ДНҚ – ны ДНҚ – дан емес РНҚ – дан синтездейді. РНҚ – полимеразамен салыстырғанда, ол кері бағытта жұмыс істейді, яғни ДНҚ – дан РНҚ – ға емес, РНҚ – дан ДНҚ – ға. Кері транскриптаза ферментінің қалыпты сау клеткалары бар ма, және оларда ДНҚ синтезі РНҚ – да жүре ме ? Бұл күмәнді сұрақ әлі толық шешілмеген. Алайда бұл фермент, эукариот клеткаларында оларға ДНҚ арқылы көбейетін РНҚ – сы бар вирустарды жұқтырғаннан кейін пайда болады. Бұл вирустардың геномы кері транскриптазаны кодтайды, соның көмегімен вирустың ДНҚ үлгісі құрылады да, кейін вирустар молекулаларының РНҚ – сы синтезделеді.

 

ДНҚ рекомбинанттары (будан ДНҚ – лар)

Генетикалық рекомбинацияның мәні – екі хромосоманың өзара гендерімен алмасуында. Екі немесе одан көп тұқым қуатын анықтауышы бар клетканың немесе организмнің пайда болуына әкеп соғатын кез келген процесті 1958 жылы Понтекорво рекомбинация деп атады. Міндетті түрде сүтқоректілердің жыныс клеткалары пайда болғанда, мейоздың барысында гомологты хромосомалар гендерімен алмасады (кроссинговер – айқасу құбылысы). Осы алмасулар ұрпақтарға берілетін тұқым қуатын белгілердің араласуын түсіндіруге мүмкіндік береді.

Гендер алмасуын, сондай – ақ клеткаға «бөтен» генді енгізуді генетикалық рекомбинация арқылы in vitro организмнен тыс жасауға болады.

1972 жылы  П.Бергтің лабораториясында (АҚШ, Станфорд университеті) ең бірінші рекомбинантты деп аталатын будан ДНҚ молекуласы алынды. Оның құрамына лямбда бактериофагының геномы мен SV 40 вирус геномы кірді. Организмнен тыс рекомбинация әдісі, әр түрдің ДНҚ – ларын (табиғи немесе жасанды) бөліп алып, оларды бір – бірімен қосуды, содан кейін осы рекомбинантты ДНҚ – ны тірі клеткаға енгізіп, жаңа белгінің пайда болуын, мысалы, ерекше белок синтезін жүргізуді көздейді.

 

                                           -12-

Ген инженериясы негізінде биотехнологиялық өнімдер алу

Қазіргі кезде тек ген инженериясы ғана адамға қажетті биологиялық активті заттарды химиялық таза күйінде алуды қамтамасыз ете алады. Ген инженериясының қарқынды дамуы арқасында адамның бірқатар ауруларын (генетикалық аурулар) емдеу және ауылшаруашылық малдарының өнімділігін жоғарылату мүмкін болды. Алғаш рет медицинада ген инженериясының өнімі – инсулин қолданды. Инсулин ұйқы безінде түзіледі, оның арқасында қандағы глюкозаның артық мөлшері жануар текті крахмал гликогенге айналады. Ұйқы безінде инсулиннің түзілуі бұзылатын болса, адам диабет ауруына ұшырайды, яғни қанда жүзім қантының мөлшері артады. Есептеу бойынша дүние жүзінде 60 млн. адам диабетпен ауырады. Диабетпен ауыратын адам тәулігіне гормонның орта есеппен 40 бірлігін қабылдауы қажет. Осы уақытқа дейін инсулиннің негізгі шығу көзі – етке өткізілген сиыр мен шошқаның ұйқы безі болатын. Ауру адамдардың біраз бөлігі, әсіресе балаларда бұл гормонға аллергия дамығандықтан, оларды жануар текті гормонмен емдеу қиын болды және де инсулинге тәуелді адамдардың саны жылдан жылға арта түсуде. Осы себептерге орай адамның ген инженерлік инсулиннің бактерия клеткасында өндіру қажеттігі туды.

Адам инсулині генін алғаш рет 1978 ж. «Генентек» фирмасы (АҚШ) синтездей алды. Соматостатин гені сияқты инсулиннің синтетикалық гені плазмидаға бетта – галактозидаза генінің соңына енгізілді. Мұнда әрбір бактериялық клеткада инсулиннің шамамен 100 мың молекуласы синтезделді. E.coli клеткасында проинсулиннің биосинтезі іске асты, ол үшін кері транскиптазаның көмегімен иРНҚ – да оның ДНҚ көшірмесі синтезделді. Америкалық «Эли Лилли» фирмасының зерттеушілері  E.coli клеткасының 20% көлемін проинсулин немесе инсулин алатынын атап көрсетті. Көлемі 100 л бактерия культурасынан 200г дейін инсулин өндіруге болады, әншейінде гормонның мұндай мөлшерін өндіру үшін сиырдың немесе шошқаның 1600 кг ұйқы безін өңдеу қажет болар еді. Ұлыбритания мен СССР – де  рДНҚ технологиясы арқылы бактерия клеткасында инсулин өндіру 1980 ж ойдағыдай шешілді.

Инсулинен кейін ген инженерлік фармокология соматотропин деп аталатын өсу гормонын бактериялық клеткада синтездеуді шындап қолға алды. Адамдарда соматотропин гипофиздің алдынғы бөлігінде синтезделеді, оның жетіспеушілігі гипофиздік ергежейлікке әкеледі. Көп уақыт бойы соматотропинді өліктерден бөліп келді. Алайда, дамыған елдерде осындай жолмен бөлінген гормон гипофиздік ергежейлілікпен ауыратын адамдардың тек үштен біріне ғана жеткілікті болды. Бұдан басқа, өліктерден бөлінген гормонның қоспасы көп болғандықтан, препарат қабылдаған аурулардың 30 % гормонға қарсы антизаттар синтездейді, мұның өзі гормонның активтілігін жоққа шығарды.

 

                                        -13-

Швецияның «Каби битрум» фирмасы 1978 ж. «Генентек» компаниясымен ген инженериясының әдісі арқылы соматотропинді синтездей алатын бактерия штамын алу үшін келісімге қол қойды. 8 айдан соң  «Генентек» фирмасының зерттеушілері – Дж. Геддель және т.б. соматотропинді синтездей алатын E.coli К12 штаммын алды. Алайда, алынған синтетикалық гормонның N – ұшында метиониннің қосымша қалдығы болды. 1980 ж. «Генентек» компаниясының зерттеушілері қосымша метионині бар синтетикалық гормонның биологиялық активтілігі табиғи соматотропиннен кем түспейтін дәлелдерін FDA – ға ұсынды. 1985 ж. соңынан бастап «Каби битрум» компаниясы өсу гормонын сомтрем деген аталумен Стренгнестегі өзінің зауыттарының ферменттерлеріне (әр қайсысының сыйымдылығы 1500л) кең өндірістік масштабта шығаруда.

Ал, 1987 ж. «Эли Лилли» фирмасы рекомбинантты ДНҚ негізінде метионині жоқ яғни табиғи гормоннан айнымайтын өсу гормонын өндірістік негізде шығаруды бастады. Бұл, 191 амин қышқылынан тұратын синтетикалық гормон хуматроп деген комерциялық атаумен белгілі.

Қазіргі кезде Жапония, Канада, Англия және Францияда рекомбинантты соматотропинді бактериялық клетка арқылы өндірістік жағдайдаөндіру кең жолға қойылған.

Рекомбинантты  ДНҚ әдістерін пайдаланып, организм өсуінің басқа факторларын (соматостатин, соматомедин т.б.) синтездеуге болады.  Соматостатин генінің өнімін E.coli клеткасынан лак – апейронды қолданып, бөлу мүмкіндігі бар. Адамда гипофиздің аденомасында акромегалия ауруы (жақ және жіліктердің шеміршек ұштарының сәйкессіз өсуі дамиды). Аурудың себебі, соматотропиннің мөлшерден тыс синтезделуінен болады. Міне, осындай ауруды рДНҚ негізінде алынған соматостатинмен емдеудің пайдасы өте зор.

Мал шаруашылығындағы ген инженериясының маңызды жетістіктерінің бірі болып ген – инженерлік соматотропинді зоотехнияда қолдану саналады. Бұл күрделі поли функциялық белок мал шаруашылығында екі бағытта қолдану алды: 1) малдың өсуін стимуляциялау үшін (соматогендік активтілік); 2) сүт бездерінің қызметін жақсарту үшін (лактогендік активтілік). Яғни соматотропин препараты малдың өсуін жеделдету және сауын сиырдың сүттілігін жоғарылату үшін қолданылады. Өсу гормонының соматогендік пен лактогендіктен басқа екі физиологиялық активтілігі бар: инсулиндік және диабеттік.

Қазіргі кезде ген инженерлік әдіс арқылы ірі қараның, қойдың, шошқаның және тауықтың соматотропин гені алынды және оның   E.coli клеткасындағы клонын алу және экспрессиясы іске асты. Мұқият жүргізілген зерттеулер ірі қараның бактериялардан алынған соматотропині сауын сиыр сүттілігінің артуына ықпал ететінін дәлелдеді. Малға тәулігіне 13,5 тен

                                              -14-

40,5мг дейін  соматотропинді енгізгенде, сиырдан  алынған сүт мөлшері препараттың  мөлшерімен малдың күтіміне байланысты 10 нан 50 % ке дейін көтерілді. Осы  биотехнологиялық өнімді ірі қара сүт шаруашылығында жаппай қолдану кейбір ғалымдардың (Т. Аткинсон және т.б., 1985; Д. Бауман, Маг Гутчеон,1985) пікірі бойынша сиыр сүттілігін орта есеппен 23 – 31 % ке көтереді. П. Баттери өз қызметкерлерімен ұзақ уақыт бойы (188 күн) соматотропин қабылдаған сиырлар сүтінің сапасы бақылау тобынан ешқандай айырмашылығы жоқ екендігін дәлелдеді. Бұдан соматотропин малдың басқа физиологиялық белгілеріне зиянды әсер бермеді.

Алдыңғы қатардағы биотехнологиялық фирмалар (мысалы Дженерал Диагностик Корп, АҚШ ) рекомбинантты ДНҚ технологиясы арқылы мал өсуін реттейтін белокты заттарды шығаруды бастады. Мысалы, протеаза ингибиторлары белоктың ыдырау жылдамдығын бәсеңдетуі арқылы малдың ет массасының көбеюіне себепші болады. Белоктық препарат бетта – агонист май қыртыстарын азайтып, ет ұлпасының түзілуін күшейтеді.

Гендік инженериясының әдістері медицина үшін қан факторлары мен иммуномодуляторларын (Интерферон және интерлейкин) алу үшін кеңінен қолданылады. Интерферон адам және жануар клеткаларында инфекциялық вирустарға қарсы синтезделеді. Олардың антивирустік активтілігі бар, сонымен қатар қатерлі ісіктердің (рак) көбеюін тоқтата алады. Интерферонның үш түрін ажыратады: альфа – интерферон лейкоциттерде вирустарға қарсы түзіледі; бетта – интерферон – фиборбластарға вирустар әсер еткенде түзіледі және иммундық деп аталатын гамма интерферон, Т – лимфоциттерде вирустық немесе бактериялық антигендерге және қатерлі ісіктерге қарсы синтезделеді.

Лейкоциттік альфа – интерферонды алғаш рет 1980 ж. «Биоген» компаниясының зерттеушілері Гилберд пен Вейссман және Фин ғалымы Кантелл генетикалық құрастырылған ішек таяқшасы бактериясынан алды. Лейкоциттік интерферонның генін алу үшін Синдай вирусымен жұқтырылған лейкоцит клеткаларына иРНҚ фракцияларын бөледі. Ревертаза арқылы синтезделген қтДНҚ ұшына олиго – dГ жалғайды, ал рестриктаза Pst І арқылы үзілген pBR322 плазмидасының ұшына олиго-dЦ жалғайды. Pst І бойынша ендірме плазмиданың tet генін инактивациялайды. Сондықтан рДНҚ енген гибридті клеткаларды алғашқы сұрыптау тетрациклинге төзімділік бойынша өтеді. Лейкоциттік альфа – интерферонның геномында интрон бөліктері жоқ және де глюкозаланбаған. Осыған байланысты  альфа – интерферонның рекомбинантты генінің экспрессиясын E.coli клеткасында іске асыру қиын емес. Ал, геннің өзін кері транскрипция арқылы синтездеу өте күрделі, өйткені интерферон иРНҚ – ның мөлшері тіпті лейкоциттердің өзінде жеткіліксіз. 1982 жылы М.Н. Колосов тобы адамның альфа – интерферонының синтетикалық генін синтездеп, оған бактериялық реттеуші элементтерін жалғау арқылы геннің E.coli клеткасындағы экспрессиясын бақылады.