Генная инженерия. 4

Введение

Генная инженерия - совокупность приёмов, методов и технологий получения рекомбинантных РНК и ДНК, выделения генов из организма (клеток), осуществления манипуляций с генами и введения их в другие организмы. Иными словами, набор специальных методов для создания генно-инженерных конструкций.

Генетическая инженерия  не является наукой в широком смысле, но является инструментом биотехнологии, используя методы таких биологических  наук, как молекулярная и клеточная  биология, цитология, генетика, микробиология, вирусология. Уже сегодня генная инженерия позволяет включать и  выключать отдельные гены, контролируя, таким образом, деятельность организмов, а также - переносить генетические инструкции из одного организма в другой, в том числе - организмы другого вида. По мере того, как генетики всё больше узнают о работе генов и белков, всё более реальной становится возможность произвольным образом программировать генотип (прежде всего, человеческий).

Перенос генов дает возможность  преодолевать межвидовые барьеры и  передавать отдельные наследственные признаки одних организмов другим. Цель генной инженерии – создание рекомбинантных ДНК, которые состоят из фрагментов молекул ДНК, полученных от разных организмов.

Генная инженерия является основой:

• Биотехнологических процессов
• Картирования хромосом
• Секвенирования геномов
• Коррекции генома и генотерапии

1.Основные этапы создания и клонирования рекомбинантных ДНК.

Рекомбинантные ДНК состоят  из фрагментов ДНК, полученных от разных организмов (например, ДНК бактерии, вируса и человека).

В 1973-74 гг. С. Коэном, Д. Хелинским, Г. Бойером и другими учеными впервые сконструированы функционально активные молекулы гибридной ДНК, то есть удалось их клонирование. Были созданы первые, не существующие в Природе, плазмиды (стабилизатор наследства) на базе ДНК из разных видов бактерий и высших организмов, из ДНК лягушки (кодирующей синтез рРНК), морского ежа (контролирующей синтез белков-гистонов), и от мыши.  Первые рекомбинантные ДНК называли химерами.

Достижения генетики и  химии нуклеиновых кислот позволили разработать методологию генной инженерии. Методы генной инженерии используют в определенной последовательности, причем различают несколько стадий в выполнении типичного генно-инженерного эксперимента, направленного на клонирование какого-либо гена, а именно:

1. Выделение ДНК из клеток интересующего организма (исходного) и выделение ДНК-вектора.

2. Разрезание (рестрикция) ДНК исходного организма на фрагменты, содержащие интересующие гены, с помощью одного из ферментов-рестриктаз и выделение этих генов из образованной рестрикционной смеси. Одновременно разрезают (рестрикциируют) векторную ДНК, превращая ее из кольцевой структуры в линейную.

3. Смыкание интересующего сегмента ДНК (гена) с ДНК вектора с целью получения гибридных молекул ДНК.

4. Введение гибридных молекул ДНК путем трансформации в какой-либо другой организм, например, в Е. coli или в соматические клетки.

5. Высев бактерий, в которые вводили гибридные молекулы ДНК, на питательные среды, позволяющие рост только клеток, содержащих гибридные молекулы ДНК.

6. Идентификация колоний, состоящих из бактерий, содержащих гибридные молекулы ДНК.

7. Выделение клонированной ДНК (клонированных генов) и ее характеристика, включая секвенирование азотистых оснований в клонированном фрагменте ДНК.

Создание рекомбинантной ДНК осуществляется по принципу «вектор-вставка», где вставка- это чужеродная ДНК, встроенная в вектор, а вектор- это молекула ДНК, которую используют для переноса рекомбинантной ДНК в клетку- хозяина с целью её размножения и клонирования.

Для вставки используют:

• Геномную ДНК, выделенную из клеток
• Гены, синтезированные in vitro
• Копии ДНК, полученные с помощью фермента обратной транскриптазы на РНК-матрице.

Сегмент ДНК (ген), который  предназначен для молекулярного  клонирования, должен обладать способностью к репликации при переносе его  в бактериальную клетку, т. е. быть репликоном. Однако он такой способностью не обладает. Поэтому, чтобы обеспечить перенос и обнаружение клонируемых генов в клетках, их объединяют с так называемыми генетическими векторами. Последние должны обладать, как минимум, двумя свойствами.

Во-первых, векторы должны быть способны к репликации в клетках, причем в нескольких копиях.

Во-вторых, они должны обеспечивать возможность селекции клеток, содержащих вектор, т. е. обладать маркером для отбора и клонирования трансформированных клеток хозяина.

Таким требованиям отвечают плазмиды и фаги. Плазмиды являются хорошими векторами по той причине, что они являются репликонами и могут содержать гены резистентности к какому-либо антибиотику, что позволяет вести селекцию бактерий на устойчивость к этому антибиотику и, следовательно, легкое обнаружение рекомбинантных молекул ДНК.

Поскольку природные плазмидные векторы неизвестны, то все известные к настоящему времени плазмидные векторы были сконструированы искусственно. Исходным материалом для создания ряда генетических векторов послужили R-плазмиды, в которых с помощью рестриктаз удаляли излишние последовательности ДНК, в том числе те, на которых располагались множественные сайты рестрикции. Это удаление определялось тем, что плазмидный вектор должен обладать только одним сайтом узнавания для одной рестриктазы, причем этот сайт должен лежать в функционально несущественном районе плазмидного генома. Например, плазмидный вектор pBR 322, который содержит гены резистентности к ампициллину и тетрациклину, что делает его очень удобным для селекции бактерий, содержащих клонируемый сегмент ДНК, обладает одиночными сайтами рестрикции для более 20 ферментов-рестриктаз, включая такие известные рестриктазы, как Eco R I, Hind III, Pst I, Pva II и Sal I

Фаговые векторы тоже обладают рядом преимуществ. Они могут включать в себя более крупные (более длинные) клонируемые фрагменты ДНК по сравнению с плазмидными векторами. Далее, перенос фагами клонируемого фрагмента в клетки в результате инфицирования ими последних является более эффективным, чем трансформация ДНК. Наконец, фаговые векторы позволяют более эффективный скрининг (распознавание) на поверхности агара колоний, содержащих клетки, несущие клонируемый ген. Многие фаговые векторы сконструированы на базе фага λ (так называемые косплазмиды – плазмиды, которые содержат cos – сайты фага λ).

Кроме фаговых используют и другие вирусные векторы, сконструированные на базе вируса герпеса, а также векторы, сконструированные на базе дрожжевой ДНК  (с использованием Yac – yeast artificial chromosomes – искусственные хромосомы дрожжей).

2. Основные ферменты, используемые в генной инженерии.

• Эндонуклеазы рестрикции
• ДНК – лигазы
• Обратная транскриптаза
• Taq – полимераза
• Концевая трансфераза
• ДНК-полимераза I (Фрагмент Кленова)
• РНКаза Н

3. Строение плазмидного вектора.

Карта плазмиды pBR 322

4. Схема создания рекомбинантной ДНК.

5. Трансформация. Скрининг.

Трансформация – изменение свойств клетки в результате переноса рекомбинантной ДНК через мембрану.

Как уже отмечалось, выделение (получение) нужного гена (трансгена), намеченного для переноса – один из главных этапов в генетической инженерии. Ген может быть выделен из естественных источников (из подходящего генома), синтезирован химическим (по имеющейся последовательности нуклеотидов) или ферментативным путем с использованием механизма обратной транскрипции (синтез кДНК на матрице мРНК с помощью обратной транскриптазы), получен с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР). Часто нужный ген выделяют из банка генов.

Банк генов, или  клонотека (геномная библиотека) – это коллекция

клонов ДНК, включающая все  фрагменты, входящие в состав генома данного вида. Для ее создания необходимо выделение всей (тотальной) геномной ДНК, ее фрагментация с помощью рестриктаз или методом дробовика(ультразвуком); присоединение полученных фрагментов к клонирующим векторным молекулам, введение рекомбинантных ДНК в реципиентные бактерии для их последующего клонирования. В результате получают клоны с разными фрагментами одной молекулы ДНК. Набор клонированных фрагментов генома и называется банком генов, а точнее, – это произвольная (случайная) коллекция клонированных фрагментов ДНК, представляющая собой совокупность всех нуклеотидных последовательностей ДНК данного индивида или вида. Однажды полученная библиотека генов может храниться и использоваться неограниченно долго. В библиотеке содержится вся наследственная информация организма. Банк генов – это не только источник для получения нужного трансгена, но и источник материала для изучения структуры, функции и регуляции индивидуальных генов, структуры и функции белков. С его помощью можно также решить проблему сохранения генофонда исчезающих видов.

Гены эукариот занимают достаточно протяженные участки ДНК (до 2,5 млн пн). Для клонирования таких крупных фрагментов плазмидные векторы не подходят. В этом случае используют клонирующие векторы, созданные на основе бактериофага λ (возможный размер клонируемого фрагмента – до 23 тпн), космиды (до 45 тпн) или же искусственные хромосомы (от 100 до >1000 тпн).

Первую геномную библиотеку создали Т. Маниатис с сотрудниками в

1978 г. Они использовали  ДНК из генома D. melanogaster, которую   клонировали в клетках E. coli. Аналогичные коллекции, полученные из индивидуальных хромосом или их частей, называются хромосомными библиотеками.

Библиотеки кДНК составляют копии ДНК, комплементарные РНК. Поскольку кДНК получают из зрелых мРНК, прошедших процессинг, они не содержат интронов. Библиотека кДНК отражает спектр генной активности в клетках, из которых она была выделена. Создание таких библиотек полезно для сравнения генной активности в клетках разных тканей.

Скрининг - поиск и обнаружение  рекомбинантных ДНК среди десятков тысяч клонов. (Клон – популяция  клеток, которая берёт начало от одной клетки).

Поиск нужных генов в смеси  клонированных фрагментов ДНК библиотеки осуществляется различными способами;  суть всех их состоит в скринировании библиотек. Рассмотрим некоторые из них. 

1.  Если нам доступен  искомый ген,  мы знаем его  местоположение,

молекулярную массу, то его  можно выделить путем разделения фрагментов по молекулярной массе и заряду при помощи гель-электрофореза. Для этого исследуемые образцы  (содержащие различные фрагменты одной и той же ДНК)  наносят сверху на агарозный или полиакриламидный  (ПААГ)  гель. При наложении на гель электрического поля фрагменты начнут перемещаться вниз (от отрицательного к положительному полюсу, поскольку молекулы ДНК отрицательно заряжены)  со скоростью, зависящей от длины (массы) фрагмента. Это связано с тем,  что в гелевой среде,  состоящей из пор, молекулы ДНК разного размера тратят разное время на преодоление пор. Чем меньше размер фрагментов, тем быстрее они движутся. В результате электрофореза в геле образуется ряд полос,  расположенных одна под другой. Верхние полосы соответствуют фрагментам, имеющим более крупные размеры, а нижние – более мелкие. Полосы выявляются при окрашивании гелей бромистым этидием и просмотре гелей в ультрафиолетовом свете. Чтобы определить относительную молекулярную массу разделенных фрагментов, одновременно проводят электрофорез маркерных молекул с известными молекулярными массами. Зная, какую массу имеет фрагмент, содержащий интересующий нас ген, можно выделить его из электрофоретического геля и использовать по назначению.

2.  Если единственным  «паспортом»  искомого гена служит его нуклеотидная последовательность, то поиск нужного гена в смеси фрагментов ДНК осуществляют с помощью метода гибридизации нуклеиновых кислот (так называемой in situ – гибридизации).  Для этого применяют молекулярные зонды. Зонды – это искусственно синтезированные меченые (изотопами или флуоресцентными красителями –  химически)  небольшие (10–30  нуклеотидов)  сегменты одноцепочечной ДНК (или РНК,  или ее ДНК-копии), комплементарные искомому гену.  Зонд – это синтетический олигонуклеотид  (короткий сегмент одноцепочечной ДНК)  с известной нуклеотидной последовательностью, который используется для выявления комплементарных последовательностей с помощью гибридизации (т.е. зонды служат индикаторами гомологии при гибридизации соответствующих по следовательностей).

Для успеха работ по генетической инженерии важно,  чтобы каждый

конкретный зонд представлял  копии одной молекулы ДНК с известной последовательностью нуклеотидов,  а данные по ДНК-гибридизации во всех лабораториях мира можно было сравнивать между собой.

Реакция гибридизации нуклеиновых  кислот –  чувствительный метод

выявления специфических  последовательностей нуклеотидов.  Гибридизация in situ – это отжиг одноцепочечного фрагмента ДНК на комплементарный ему участок другой молекулы ДНК с образованием двухцепочечной гибридной молекулы.  Отжиг –  процесс восстановления  (ренатурации) двухцепочечных молекул ДНК из одиночных полинуклеотидных цепей путем постепенного охлаждения.

Процедура поиска нужных генов  в банке получила название блоттинга (от англ. blotting – промокание). Блоттинг – это метод перенесения

электрофоретических фрагментов ДНК на специальную пленку (мембрану) из нитроцеллюлозы,  связывающую  (иммобилизующую)  одноцепочечные молекулы ДНК.  

6. Принципы клонирования генов в составе генетического вектора.

Клонирование – получение  большого количества копий определённого  гена в результате его размножения  в клетках в составе рекомбинантной ДНК.

Клонирование генов проводят с целью получения того или  иного

фрагмента ДНК в большом  количестве. Этот процесс необходим для получения многочисленных копий желаемых генов. Клонирование ДНК возможно благодаря способности бактериальных плазмид и фагов продолжать нормальное функционирование после встраивания в их геном чужеродной ДНК. Поскольку встроенные в геном чужеродные последовательности ДНК не влияют на свойства химерных штаммов бактерий, практически любая последовательность ДНК может быть клонирована таким образом. Для клонирования плазмиду, содержащую рекДНК, вводят в клетки бактерии (например, E. coli) или дрожжей, где происходит ее многократная репликация.Для клонирования небольших фрагментов ДНК используют плазмиды, фаговые ДНК, а для крупных – космиды и искусственные хромосомы. Клонирование рекомбинантных молекул с генами человека или животных в клетках бактерий дает возможность в условиях микробиологического синтеза получать большое количество нужных белков. Так, искусственно синтезированный человеческий ген инсулина введен в бактерию, что дало возможность получать человеческий инсулин (гормон, широко используемый в медицине при лечении сахарного диабета) в промышленных количествах.

Раньше для лечения  сахарного диабета использовали инсулин животного происхождения, получаемый из поджелудочной железы крупного рогатого скота. В 1979 г. из 60 млн больных диабетом во всем мире только 4 млн получали этот гормональный препарат. Однако, у 5 % возникали аллергические реакции, обусловленные антигенной несовместимостью гормона и клеток человека, т.е. такие больные были обречены на гибель. Кишечная палочка со встроенным геном инсулина синтезирует в культуре до 200 г инсулина на 1 л культурной среды, что эквивалентно количеству инсулина, выделенному из 1600 кг поджелудочной железы коровы или свиньи, и не вызывает аллергии. Природные штаммы бактерий инсулин никогда не продуцировали.

7. Генная терапия. Принципы и направления генной терапии.

Генная терапия - коррекция мутантных генов или нарушений клеточных функций с помощью методов генной инженерии. Генотерапия основана на введении нормальной копии гена в соматические клетки костного мозга, фибробласты кожи, миобласты, гепатоциты или лимфоциты пациента.

Основными направлениями  генотерапии является лечение моногенных наследственных и ненаследственных заболеваний.

Принципы генной терапии.

В зависимости от способа  введения экзогенных ДНК в геном  пациента генная терапия может проводиться  либо в культуре клеток (ex vivo), либо непосредственно в организме (in vivo). Клеточная генная терапия (ex vivo) предполагает выделение и культивирование специфических типов клеток пациента, введение в них чужеродных генов, отбор трансфецированных клеток и реинфузию их тому же пациенту. В настоящее время в большинстве допущенных к клиническим испытаниям программ генной терапии используются именно этот подход.

Генная терапия in vivo основана на прямом введении клонированных и определённым образом упакованных последовательностей ДНК в специфические ткани больного. Особенно перспективным для лечения генных болезней in vivo представляется введение генов с помощью аэрозольных или инъецируемых вакцин. Аэрозольная генотерапия разрабатывается, как правило, для лечения пульмонологических заболеваний (муковисцидоз, рак лёгких).

Первый раз человека подвергли  такому лечению в США в 1990 г. Это  был четырехлетний ребенок, страдающий дефицитом редкого энзима, отсутствие которого разрушает иммунную систему  человека. Исправление или замещение  поврежденных генов производится по методам генной инженерии. Здоровый ген вводят в какой-нибудь вирус (обычно переносчик легко поддающейся  лечению инфекции) так, чтобы он был  непосредственно нацелен на поврежденные клетки. С самого начала генная терапия  была задумана как средство лечения  наследственных заболеваний - муковисцидиоз или серповидная анемия, но также исследовались возможности применения метода для лечения других болезней, таких как рак, при которой ген поражается только спустя некоторое время. Хотя тысячи больных уже были излечены, главным образом в США, генная терапия еще не сказала своего слова. Не все из вводимых генов достигают цели, и не все, попавшие в поврежденную клетку, эффективно срабатывают. Существует также проблема использования вируса в качестве переносчика гена. Организм встречает вирус как «чужака», и у некоторых пациентов из-за этого наблюдается тяжелая иммунная реакция. Существует и теоретический риск того, что сам вирус может распространиться и вызвать рак.

Генная терапия используется для лечения тяжелых состояний  иммунодефицита, когда исчезает ген, ответственный за выработку энзима аденозина дезаминазы (АДА). Так как АДА очень важен для выработки лейкоцитов (белых кровяных телец), это приводит к тому, что организм становится беззащитен против инфекций. Тогда два ретро-вируса (1) вводятся в костный мозг, который может выработать РНК из своего ДНК (2), используя резервный энзим транскриптазы (3). Потом эта ДНК объединяется с человеческими хромосомами (4). Когда количество хромосом увеличивается, вырабатывается новая вирусная РНК, вирусные протеины и АДА (5). Вирусная РНК и вирусные белки вырабатывают много новых вирусов, а АДА используется организмом для производства жизненно важных лейкоцитов. Потом процесс повторяется и распространяется на весь костный мозг.

8. Генная коррекция опухолевых заболеваний.

Одновременно с развитием  исследований в области генокоррекции наследственных дефектов успешными также оказались поиски терапевтического использования смысловых последовательностей ДНК для лечения ненаследственных заболеваний, и главным образом злокачественных опухолей и вирусных инфекций.

В таблице приведены основные методологические подходы к генотерапии различных опухолей, разработанные и уже широко используемые. Многие из этих подходов вполне приложимы и для борьбы с наиболее серьёзными инфекционными заболеваниями, например, с ВИЧ-инфекцией.

Результаты первых клинических  испытаний этих подходов оказались  в высшей степени обнадёживающими, в особенности при лечении  нейродегенеративных и онкологических заболеваний нервной системы.

Таблица. Основные подходы  в генокоррекции онкологических заболеваний.

Таким образом, генетическая революция, апофеозом которой явилась  генная терапия, не только предлагает реальные пути лечения тяжелых наследственных и ненаследственных недугов, но и  в своём стремительном развитии ставит перед обществом новые  проблемы, решение которых настоятельно необходимо уже в ближайшем будущем.

Список литературы:

1. Баранов В.С. Соросовский образовательный журнал, №3, 1999.- с.63-67.
2. В.Н.Попрв, О.С.Машкина. Принципы и основные методы генетической инженерии. Издательско-полиграфический центр Воронежского государственного университета, 2009.- с.5-18
3. Горелов А.А. Концепции современного естествознания. – М.: Центр, 1997.
4. Научно-технический энциклопедический словарь (http://dic.academic.ru)
5. Рыбчин В.Н. Основы генетической инженерии / В.Н. Рыбчин. – СПб. :Изд-во СПбГТУ, 1999. – 521с.
6. Айала Ф., Кайгер Дж. Современная генетика: в 3-х т. — М.: Мир, 1987. — Т. 1. — с.295
7. Глик Б. Молекулярная биотехнология: принципы и применение /Б. Глик, Дж. Пастернак. – М. : Мир, 2002. – 589 с.