Генная инженерия. 2
ГОУ ВПО «Самарский государственный медицинский университет»
Кафедра фармакогнозии с ботаникой и основами фитотерапии
Реферат
ПО ТЕМЕ:
«Генетическая инженерия»
Исполнитель: студент группы 175 Грозунова Е.А.
Самара 2010
Содержание
- Введение…………………………………………………………
…………...3 - История развития генетической инженерии……………………………….4
- Генная инженерия человека………………………………………………...5
- Строение рекомбинантной ДНК…………………………………………...6
- Уровни применения генетической инженерии…………………………....7
- Генная инженерия в природе и векторы для клонирования генов растений…………………………………………………………
…………...9 - Практические результаты генной инженерии…………………………….11
- Основные ферменты, используемые в генной инженерии………………12
- Достяжения генной инженерии……………………………………………12
- Заключение……………………………………………………
……………14 - Список использованной литературы……………………………………..15
2
Введение
Синтез идей и методов общей, молекулярной генетики и молекулярной биологии привел к появлению нового направления в современной биологии, получившего название «генетическая инженерия».
Это направление
науки ставит своей задачей
моделировать желательные для
практики и науки формы
В данном реферате рассматриваются основные характеристики, проблемы и перспективы такой новейшей технологии. В настоящее время тема «генетической инженерии» весьма актуальна, так как человечество, для решения своих проблем, стремится внедрять в сельское хозяйство, да и не только, наиболее производительные биотехнологии.
Генети́ческая инжене́рия
направление исследований
в молекулярной биологии и генетике,
конечной целью которых является
получение с помощью
3
История развития генетической инженерии
Как и каждая
новая биологическая
Одной из первых работ в этом плане является работа Н.П. Дубилина (1934), посвященная изучению изменения видового числа пар хромосом у вида D.melanogaster, который в норме имеет 4 пары хромосом. В результате проведенных опытов с использованием рентгеновского облучения были созданы особи с измененным кариотипом по заранее предсказанной модели. В кариотипе D. melanogaster было изменено число пар хромосом так, что были получены формы как с уменьшенным (3 пары ) , так и с увеличенным числом (до 5 пар) пар хромосом. Таким образом, в конечном результате целеноправленно удалось создать популяции хромосомных рас особей D. melanogastr, имеющих отличное от исходного вида число хромосомных пар в своих кариотипах.
Дальнейшее
развитие эта работа получила
в опытах Е. Сирса, который
в 1956 г. При помощи рентгеновского
облучения осуществил перенос
участка хромосомы с геном
устойчивости к листовой
В 1971 г. В.А.
Струнников применил к
______________________________
[1] – С.М. Гершензон
– «Основы современной
4
Большой вклад в развитие отечественной генной инженерии внес доктор
биологических наук, профессор Николай Иванович Матвиенко. Им независимо от зарубежных исследователей были получены первые в стране векторные молекулы ДНК на основе бактериофага λ. Это позволило в довольно короткий срок начать широкомасштабные эксперименты по генной инженерии сразу в ряде отечественных научных центров. Н.И. Матвиенко с сотрудниками одним из первых продемонстрировал функциональную активность клонированного гена. Особое внимание Николай Иванович уделял разработке методических приемов генной инженерии. Им были разработаны метод создания трехкомпонентной системы для эффективной экспрессии клонированных генов, метод селективной ПЦР-опосредованной амплификации фрагментов геномной ДНК и другие [2].
Генная инженерия человека
В применении к человеку генная инженерия могла бы применяться для лечения наследственных болезней. Однако, технически, есть существенная разница между лечением самого пациента и изменением генома его потомков.
Задача изменения генома взрослого человека несколько
сложнее, чем выведение новых генноинженерных
пород животных, поскольку в данном случае
требуется изменить геном многочисленных
клеток уже сформировавшегося организма,
а не одной лишь яйцеклетки-зародыша. Для
этого предлагается использовать вирусные
частицы в качестве вектора. Вирусные
частицы способны проникать в значительный
процент клеток взрослого человека, встраивая
в них свою наследственную информацию;
______________________________
[2] – Памяти Н.И. Матвиенко // Биохимия, 2008, том 73, вып. 7, с.1039-1040
5
возможно контролируемое размножение вирусных частиц в организме. При этом для уменьшения побочных эффектов учёные стараются избегать внедрения генноинженерных ДНК в клетки половых органов, тем самым избегая воздействия на будущих потомков пациента. Также стоит отметить значительную критику этой технологии в СМИ: разработка генноинженерных вирусов воспринимается многими как угроза для всего человечества.
С помощью генотерапии в будущем возможно изменение генома человека. В настоящее время эффективные методы изменения генома человека находятся на стадии разработки и испытаний на приматах. Долгое время генетическая инженерия обезьян сталкивалась с серьёзными трудностями, однако в 2009 году эксперименты увенчались успехом: в журнале Nature появилась публикация об успешном применении генноинженерных вирусных векторов для исцеления взрослого самца обезьяны от дальтонизма. В этом же году дал потомство первый генетически модифицированный примат (выращенный из модифицированной яйцеклетки) — игрунка обыкновенная.
Хотя и в небольшом масштабе, генная инженерия уже используется для того, чтобы дать шанс забеременеть женщинам с некоторыми разновидностями бесплодия. Для этого используют яйцеклетки здоровой женщины. Ребёнок в результате наследует генотип от одного отца и двух матерей.
Однако возможность
внесения более значительных изменений
в геном человека сталкивается с
рядом серьёзных этических
Строение рекомбинантной ДНК
Гибридная ДНК имеет вид кольца. Она содержит ген (или гены) и вектор. Вектор - это фрагмент ДНК, обеспечивающий размножение гибридной ДНК
6
и синтез конечных продуктов деятельности генетической системы - белков. Большая часть векторов получена на основе фага лямбда, из плазмид, вирусов SV40, полиомы, дрожжей и др. бактерий. Синтез белков происходит клетке-хозяине. Наиболее часто в качестве клетки-хозяина используют кишечную палочку, однако применяют и др. бактерии, дрожжи, животные или растительные клетки.
Система вектор-хозяин не может быть произвольной: вектор подгоняется к клетке-хозяину. Выбор вектора зависит от видовой специфичности и целей исследования. Ключевое значение в конструировании гибридной ДНК несут два фермента. Первый - рестриктаза - рассекает молекулу ДНК на фрагменты по строго определенным местам. И второй - ДНК-лигазы - сшивают фрагменты ДНК в единое целое. Только после выделения таких ферментов создание искусственных генетических структур стало технически выполнимой задачей.
Уровни применения генетической инженерии
Так как задачи генетической инженерии весьма разнообразны , разделяют следующие уровни ее применения: организменный, клеточный, генный.
Представление об организменном уровне применения генетической инженерии дает пример аллофенных животных. Тела их состоят из генотипически разных тканей, развившихся из клеток нескольких родителей, искусственно объединенных в данном потомке. Так, зародыши мышей на стадии восьми бластомеров, извлеченные из двух и более матерей, в пробирке разбиваются на отдельные бластомеры. Путем комбинации бластомеров создается комплексный эмбрион, который на стадии гаструлы вводится в матку мыши-воспитательницы. Рожденный аллофенный мышонок объединяет в фенотипе черты всех родителей, но вместе с тем отличается
7
некоторыми уникальными свойствами. Интересен, например, факт
нормального развития и жизнедеятельности аллофенного потомка, составленного из клеток родителей, ткани которых во взрослом состоянии иммунологически не совместимы.
Путем объединения цитоплазмы яйцеклетки и ядерного материала соматической клетки с последующим развитием полного организма создаются генетически тождественные особи даже у млекопитающих. В селекции это открывает возможность прямой передачи потомкам особо ценного генотипа в обход явления комбинативной изменчивости.
На клеточном уровне применения генетической инженерии путем соматической гибридизации получают гибриды, совмещающие в одной клетке генотипы организмов разных биологических видов. Особенность гибридов «человек-мышь», например, заключается в постепенном удалении из клетки человеческих хромосом. Наблюдения за изменениями клеточного фенотипа после потери отдельной хромосомы уточняют генный состав групп сцепления человека.
Эффективным путем управления наследственностью на генном уровне является генная инженерия. Она объединяет в себе методы получения отдельных генов и введения их в геномы других организмов с целью изменить фенотип последних. Основные этапы процесса изменения генотипа и фенотипа в этом случае заключается в следующем: 1) выделение гена из клетки-донора или искусственный его синтез; 2) присоединение гена к молекуле ДНК (вектору), способной ввести его в клетку-реципиент; 3) включение гена в геном клетки-реципиента; 4) активация гена и проявление информации в фенотипе клетки-реципиента путем ее транскрипции и трансляции. Роль векторов выполняют фаги, вирусы, плазмиды, эписомы, митохондриальная ДНК [3].
______________________________
[3] – В.Н. Ярыгин – «Биология», 1985, с.145-146
8
Генная инженерия в природе и векторы для клонирования генов растений
Опухолевое заболевание растений, известное как корончатый галл , описал еще Аристотель. В начале нашего века Е. Смит и К.Таундсен (1907) показали, что вызывает это заболевание почвенная бактерия. Выделенная в виде чистой культуры Agrobacterium tumefaciens способна приводить к образованию опухолей у некоторых представителей голосеменных и большинства двудольных покрытосеменных растений. Клетки растительных опухолей интенсивно растут на искусственных средах и при этом не нуждаются в добавлении фитогормонов в отличие от клеток нормальных тканей.
В семидесятых годах выяснилось, что причиной опухолеобразования являются так называемые Ti-плазмиды – это кольцевые молекулы ДНК размером 50-80 мкм с молекулярной массой около 1,3* 10 Д длиной до 200 тыс. п. н. Эти плазмиды проникают из бактерий в клетки растения, и часть ДНК Ti-плазмиды, так называемая Т-ДНК, ковалентно встраивается в хромосомы инфицируемого
растения. Будучи интегрирована с хромосомой, Т-ДНК вызывает образование опухоли, гиперпродукцию фитогормонов: цитокининов и индолилуксусной кислоты (ауксина ), а также синтез ряда производных аминокислот, объединяемых под общим термином опины. Опухоль возникает вследствие нарушения баланса фитогормонов, от которого зависит нормальный морфогенез растения. Опины, выделяемые клетками опухоли, бактерия использует в качестве истозников углерода и азота, причем только в том случае, когда A. tumefaciens, лишенные ее.
Этот процесс эффективно происходит в зараженном растении и стимулируется опинами.
Описанные здесь взаимоотношения А. tumefaciens и высшего растения Дж. Шелл назвал генетической колонизацией, которая представляет собой эксперимент по генной инженерии, поставленный самой природой. Таким
9
образом, Ti-плазмида – это природный вектор для трансформации клеток высших растений. Как показал Дж. Шелл, если из клеток корешков табака с интегрированной Т-ДНК получить культуру (каллус) растительной ткани, а затем целые растения-регенеранты, то при последующем генетическом анализе признак «присутствие Т-ДНК» обнаруживает менделевское расщепление.
В качестве векторов для клонирования генов и последующей трансформации растений используют две разновидности Ti-плазмид. Они различаются по типу опинов (октопины или нопалины) , которые синтезируют зараженные ими растения. Клонируемый ген встраивают вместо кодирующей части генов октопинсинтетазы или нопалинсинтентазы, входящих в состав Т-ДНК. Для клонирования гена в бактерии, обычно E. coli, конструируют гибридные плазмиды. После заражения растения плазмидой ее Т-ДНК со встроенным геном интегрирует с хромосомной ДНК.
В настоящее время выделены и проклонированны несколько десятков генов высших растений, в том числе гены, контролирующие запасные белки: сои, ячменя, гороха, кукурузы, а также некоторые гены, контролирующие активность ферментов: алкогольдегидрогеназы и каталазы кукурузы, а-амилазы ячменя; некоторые гены хлоропласта пшеницы, шпината и др.
Первыми чужеродными генами, введенными в начале 80-х годов в высшие растения, были гены устойчивости к антибиотикам
Из E. coli. Так, в клетки табака был передан
ген устойчивости к метатрексатору –
ингибитору дигидрофолатредуктазы. В
табак был введен также ген дрожжей, кодирующий
алкогольдегидрогеназу. Этот ген устойчиво
наследовался в мейозе у растений-
В клетки подсолнечника с помощью Ti-плазмиды был передан ген
10
фазеолина бобов. Фазеолин – это гликопротеин, составляющий до 50% запасного белка бобов. Будующее растение, полученное первоначально в виде каллусной массы, получило наименование санбин. Тот же ген фазеолина введен в табак и получены растения-регенеранты, синтезирующие менее 1 % фазеолина от общего белка растения. Получены растения табака, которые светятся в темноте благодаря экспрессии в них гена люциферазы светлячка. Это лишь первые шаги генной инженерии растений [4].
Практические результаты генной инженерии
В результате интенсивногоразвития методов генетической инженерии получены клоны множества генов рибосомальной, транспортной и 5S РНК , гистонов, глобина мыши, кролика, человека, коллагена, овальбумина, инсулина человека и др. пептидных гормонов, интерферона человека и прочее. Это позволило создавать штаммы бактерий, производящих многие биологически активные вещества, используемые в медицине, сельском хозяйстве и микробиологической промышленности.
На основе генетической инженерии возникла отрасль фармацевтической промышленности, названная «индустрией ДНК». Это одна из современных ветвей биотехнологии.
Для лечебного применения допущен инсулин человека (хумулин), полученный посредством рекДНК. Кроме того, на основе многочисленных мутантов по отдельным генам, получаемых при их изучении, созданы высокоэффективные тест-системы для выявления генетической активности факторов среды, в том числе для выявления канцерогенных соединений.
______________________________
[4] – С.Г. Инге- «Генетика с основами селекции» , с. 280-283
11
Основные ферменты, используемые в генной инженерии
Среди ферментов, используемых в генной инженерии для
клонирования, большое значение имеют эндонуклеазы рестрикции – рестриктазы. Эти ферменты, впервые открытые как часть системы рестрикции–модификации ДНК у бактерий, специфически гидролизуют молекулы двухцепочечных ДНК при наличии в них определенных последовательностей нуклеотидов, называемых сайтами рестрикции. В то же время метилазы используют для ограничения числа сайтов рестрикции и получения более крупных фрагментов ДНК с помощью рестриктаз [5].
Достижения генной инженерии
Технологии генной инженерии разрабатываются не очень много времени, они имеют крупные достижения и в медицине, и в сельском хозяйстве. Методом генной инженерии получен уже ряд препаратов, в том числе инсулин человека и противовирусный препарат интерферон. Около 200 новых диагностических препаратов уже введены в медицинскую практику, и более 100 генно-инженерных лекарственных веществ находится на стадии клинического изучения.
В сельском хозяйстве с помощью рекомбинантной ДНК могут быть получены трансгенные растения, например сорта культурных растений, устойчивые к засухе, холоду, болезням, насекомым-вредителям и гербицидам.
Несколько слов о перспективах генной
инженерии. На основе детального анализа
возможностей и реальных достижений генной
инженерии составлены научные прогнозы
на начало ХХI века. Высказаны, например,
______________________________
[5] – Ю.А.Берлин, В.Г.Коробко,
В.А.Гвоздев – «Экспрессия
12
надежды, что в ближайшие годы будут разработаны препараты
для лечения такого опасного заболевания, как СПИД, к 2009 году будут определены гены, которые связаны со злокачественными
новообразованиями, а к 2010 году будут установлены механизмы возникновения почти всех видов рака. К 2013 году завершится разработка препаратов, предотвращающих рак.
Не менее важна сегодня генная диагностика. Обычно молекулярная диагностика проводится по белкам, и, как правило, с помощью других белков-антител. Недостатки такой диагностики - обнаружение болезни на поздней стадии. Но теперь можно диагностировать и по генам (ДНК), и по синтезированным на них РНК еще до того, как в организме начали синтезироваться и накапливаться чужеродные белки.
Не имея возможности детально останавливаться на генной терапии, кратко перечислим некоторые проблемы, которыми занимаются ученые:
доставка генов к
клеткам-мишеням организма и
введение нового активного гена или регулятора активности гена. Лечение наследственных болезней целиком зависит от успехов в этом направлении,
введение генов или комплексов генов, блокирующих клеточное деление или вызывающих клеточную смерть, как средство кардинальной раковой терапии.
13
Заключение
За короткий срок генная инженерия оказала огромное влияние на развитие молекулярно-генетических методов и позволила существенно продвинуться по пути познания строения и функционирования генетического аппарата. Генная инженерия имеет большие перспективы в лечении наследственных болезней , которых на сегодняшний день зарегестрировано около 2000. Генетическая инженерия призвана помогать исправлять ошибки природы.
В настоящее время для многих специалистов методы генной инженерии – методы рекомбинантных ДНК – являются краеугольным камнем здания биотехнологии.
Использование методов
генной инженерии предполагает направленное,
по заранее заданной программе конструировании
молекулярных генетических систем вне
организма с последующим
Использование методологии генной инженерии в прикладном аспекте предполагает конструирование таких рекомбинантных молекул ДНК, которые при внедрении в генетический аппарат придавали бы организму свойства, полезные для человека.
Благодаря этому решаются многие прикладные проблемы: получение
«биологических реакторов» - микроорганизмов,
растений и животных, нарабатывающих фармакологически
значимые для человека белковые препараты,
создание высоко продуктивных пород животных
с определёнными ценными для человека
признаками, выведение растений, устойчивых
к различным патогенам и вредителям и
так далее. С этими же наукоёмкими технологиями
связана и генетическая паспортизация,
и диагностика генетических заболеваний,
и создание ДНК-вакцин, и терапия различных
заболеваний. Таким образом, сложившаяся
благоприятная ситуация в биологии явилась
мощным толчком в развитии современной
биотехнологии, весьма важной области
практического приложения результатов
фундаментальных наук.
Список использованной литературы
- С.М. Гершензон - Основы современной генетики
- В.Н. Ярыгин – Биология // Москва «Медицина» 1985г.
- Журнал «Биохимия» , 2008г., том 73, выпуск №7
- С.Г. Игне-Вечтомов – Генетика с основами селекции // Москва «высшая школа» 1989г.
- Ю.А. Берлин, В.Г.Коробко, В.А. Гвоздев – Экспрессия генов // Москва «Наука» 2000г.
Интернет ресурсы
- http://ru.wikipedia.org/wiki/
Генная_инженерия - http://dic.academic.ru/dic.
nsf/enc_medicine/8043/ Генетическая
15
