Введение.

    Генная  инженерия -  направление исследований в молекулярной биологии и генетике, конечной целью которых является получение с помощью лабораторных приемов организмов с новыми, в том числе и не встречающимися в природе, комбинациями наследственных свойств. В основе генной инженерии лежит обусловленная последними достижениями молекулярной биологии и генетики возможность целенаправленного манипулирования с фрагментами нуклеиновых кислот. К этим достижениям следует отнести установление универсальности генетического кода, то есть факта, что у всех живых организмов включение одних и тех же аминокислот в белковую молекулу кодируются одними и теми же последовательностями нуклеотидов в цепи ДНК ; успехи генетической энзимологии, предоставившей в распоряжение исследователя набор ферментов, позволяющих получить в изолированном виде отдельные гены или фрагменты нуклеиновой кислоты, осуществлять in vitro синтез фрагментов нуклеиновых кислот, объединить в единое целое полученные фрагменты. Таким образом, изменение наследственных свойств организма с помощью генной инженерии сводится к конструированию из различных фрагментов нового генетического материала, введение этого материала в рецепиентный организм, создания условий для его функционирования и стабильного наследования.

     Теоретическими  предпосылками формирования генной  инженерии как науки, явились:

1.      Открытие двойной спирали ДНК.

2.      Получение информации о матричном синтезе:

  -Репликации ДНК.

  - Транскрипции ДНК.

  - Трансляции ДНК.

3. Открытие  плазмид.   

4. Открытие  фрагментов рестриктаз.

    5. Осуществление процесса рекомбинации  хромосом

6.Идентификация  и анализ генов.

7.Способность  к гибридизации цепей ДНК.

8.Секвенирование  ДНК. 

ВОЗМОЖНОСТИ ГЕННОЙ ИНЖЕНЕРИИ.

   Значительный прогресс достигнут в практической области создания новых продуктов для медицинской промышленности и лечения болезней человека.

Использование генно-инженерных продуктов в медицине.

    В  настоящее время фармацевтическая  промышленность завоевала лидирующие  позиции в мире, что нашло отражение  не только в объёмах промышленного  производства, но и в финансовых  средствах, вкладываемых в эту промышленность (по оценкам экономистов, она вошла в лидирующую группу по объёму купли-продажи акций на рынках ценных бумаг). Важной новинкой стало и то, что фармацевтические компании включили в свою сферу выведение новых сортов сельскохозяйственных растений и животных, и тратят на это десятки миллионов долларов в год, они же мобилизировали выпуск химических веществ для быта. Добавок к продукции строительной индустрии и так далее. Уже не десятки тысяч, а возможно, несколько сот тысяч высококвалифицированных специалистов заняты в исследовательских и промышленных секторах фарминдустрии,и именно в этих областях интерес к геномным и генно-инженерным исследованиям исключительно высок. 

Очевидно поэтому  любой прогресс биотехнологий растений будет зависеть от разработки генетических систем и инструментов, которые позволят более эффективно управлять трансгенами.

   Для чистого  вырезания трансгенного ДНК в  растительный геном, всё больше  применяют заимствованные из  микробной генетики системы гомологичной  рекомбинации, такие как системы Cre-lox и Flp-frt. Будущее, очевидно, будет за управляемым переносом генов от сорта к сорту, основанного на применении предварительно подготовленного растительного материала, который уже содержит в нужных хромосомах участки гомологии, необходимого для гомологичного встраивания трангена. Помимо интегративных систем экспрессии, будут опробованы автономно реплицирующиеся векторы.осбый интерес представляют искуственные хромосомы растений, которые теоретически не накладывают никаких ограничений на объём вносимой теоретической информации.

Кроме этого  учёные занимаются поиском генов, кодирующих новые полезные признаки. Ситуация в этой области меняется радикальным  образом, прежде всего, существованию  публичных баз данных, которые  содержат информацию о большинстве генов, бактерий, дрожжей, человека и растений, а также в следствии разработки методов, позволяющих одновременно анализировать экспрессию большого количества генов с очень высокой пропускной способностью. Применяемые на практике методы можно разделить на две категории:

1.      Методы, позволяющие вести экспрессионное профилирование: субстракционная гибридизация, электронное сравнение EST-библиотек, «генные чипы» и так далее. Они позволяют устанавливать корреляцию между тем или иным фенотипическим признаком и активностью конкретных генов.

2.      Позиционное клонирование, заключается в создании за счет инсерционного мутагенеза мутантов с нарушениями в интересующем нас признаке или свойстве, с последующим клонированием соответствующего гена как такового, который заведомо содержит известную последовательность (инсерция).

Вышеназванные методы не предполагают ни каких изначальных  сведений о генах, контролирующих тот  или иной признак. Отсутствие рационального  компонента в данном случае является положительным обстоятельством, поскольку неограничен нашими сегодняшними представлениями о природе и генном контроле конкретного интересующего нас признака.

Кроме всего  этого группа ученых, таких как  Марк Адам (ведущий сотрудник института  геномных исследований в штате Мэриленд – США,  частной исследовательской компании, занимающейся исключительной работой в области картирования генов), Крэйк Вентер (директор этого института) и соавторами, разрабатывается проект «Геном человека». Цель этого проекта заключается в выяснении последовательности оснований во всех молекулах ДНК в клетках человека. Одновременно должна быть установлена локализация всех генов, что помогло бы выяснить причину многих наследственных заболеваний и этим открыть пути к их лечению. Что бы последовательно приближаться к решению проблемы картирование генов человека, было сформулировано пять основных целей:

1)      Завершить составление детальной генетической карты, на которой были бы помечены гены, отстоящие друг от друга на расстоянии не превышающем в среднем 2 млн. оснований (1 млн. оснований принято называть мегобазой);

2)      составить физические карты каждой хромосомы (разрешение 0.1 Мб);

3)      получить карту всего генома в виде охарактеризованных клонов (5 тыс. оснований в клоне или 5 Кб);

4)      завершить к 2004 году полное секвенирование ДНК (разрешение одного основание);

5)      нанести на полностью завершенную секвенсовую карту все гены человека.

Ожидалось, что, когда все указанные цели будут  постигнуты, исследователи определят  все функции генов и разработают методы биологического и медицинского применения полученных данных.

Рассмотрев темпы  ускорения работы в рамках проекта  «Геном человека», руководители этого  проекта объявили 23 октября 1998г., что  программа будет полностью завершена гораздо раньше, чем планировалось, и сформулировали «Новые задачи проекта «Геном человека»:

1)      полностью завершить в декабре 1998 года работу по секвенирование генома «Круглого червя» c. elegans (это было сделано в срок);

2)      закончить предварительный анализ последовательности ДНК человека к 2001 году, а полную последовательность к 2003 году;

3)      картировать к 2002 году геном плодовой мухи;

4)      начать секвенирование генома мыши с использованием методов ДНК искусственных хромосом дрожжей (завершить этот проект к 2005 году).

Помимо этих целей, официально включен в поддерживаемый правительством США и рядом других правительств проект, некоторые исследовательские  центры объявили о задачах, которые  будут решаться в основном за счет частных фондов и пожертвователей. Так, ученые калифорнийского университета (Беркли), Орегонского университета и Ракового исследовательского центра имени Фрейда Хатчинсона начали программу «Геном собаки».

Международное общество секвенирование в феврале 1996 года приняло решение о том, что любая последовательность нуклиотидов размером 1-2 Кб должна быть обнародована (через Интернет) в течение 24 часов после ее установления.

    ЧТО БУДЕТ СДЕЛАННО ПОСЛЕ ЗАВЕРШЕНИЯ АНАЛИЗА ГЕНОМА ЧЕЛОВЕКА.

Главная стратегическая задача будущего сформулирована следующим образом: изучить однонуклеотидные вариации ДНК в разных органах и клетках отдельных индивидуумов и выявить различия между индивидуумами. Анализ таких вариаций даст возможность не только подойти к созданию индивидуальных генных портретов людей, что в частности даст возможность лечить болезни, но  и определить различия между популяциями. А также выявлять географические районы повышенного риска, что поможет давать чёткие рекомендации о необходимости очистке территории от загрязнения и выявить производства, на которых есть большая опасность поражение геномов персонала.  

    Эта грандиозная задача рождает не одни радужные ожидания всеобщего блага, но и вполне осознанную тревогу юристов  и борцов за индивидуальные права  человека. Так, в частности, высказываются возражения против распространения персональной информации без решения тех, кого она касается. Один пример помогает понять эти тревоги: уже сейчас страховые компании нацелились на добывание таких сведений правдами и неправдами, они намериваются использовать данные против тех, кого они страхуют. Например, если подающий на страховку несёт потенциально болезнетворный ген, компании не хотят страховать таких людей вовсе или же пытаются заломить бешенные суммы за их страховки. Исходя из этого, .конгресс США уже принял ряд законов, направленный на строгий запрет распространения генетической информации относительно отдельных людей, юристы всего мира интенсивно работают в данном направлении.   

Области практического применения генной инженерии.

       Создание трансгенных растений.

    Еще 10 лет тому назад биотехнология  растений заметно отставала в  своем развитии, но за последние 3 года наблюдается быстрый выброс на рынок  трансгенных растений с новыми полезными  признаками. Трансгенные растения в США в 1996 году занимали площадь 3 млн. акров, в 1997 году площадь увеличилась до 15 млн. акров, в 1998 году – до 60 млн. акров, а в прошлом году до 80 млн. акров. Поскольку основные трансгенные формы кукурузы, сои, хлопчатника с устойчивостью к гербицидам и насекомым хорошо себя зарекомендовали, есть все основания ожидать, что площадь под генноиженерные растения в будущем (2001 году) увеличатся в 4-5 раз.

Так как число  жителей за последнее столетие увеличилось  с 1.5 до 5.5 млрд. человек, а к 2020 году предполагается вырост до 8 млрд., таким образом возникает огромная проблема, стоящая перед человечеством. Эта проблема заключается в огромном увеличение производства продуктов питания, несмотря на то, что за последние 40 лет производство увеличилось в 2.5 раза, все равно этого не достаточно. И в мире в связи с этим наблюдается социальный застой, который становится все более настоятельным. Другая проблема возникла с медицинским лечением. Несмотря на огромные достижение современной медицины, производимые сегодня лекарственные препараты столь дороги, что ¾ населения земли сейчас полностью полагаются на традиционные донаучные методы лечения, прежде всего на неочищенные препараты растительного происхождения.

    В развитых странах лекарственные  средства на 25% состоят из природных веществ, выделенных из растений.  Открытия последних лет (противоопухолевые препараты: таксол, подофиллотоксин) свидетельствуют о том, что растения еще долго будут оставаться источником полезных биологически-активных веществ (БТА), и что способности растительной клетки к синтезу сложных БТА все еще значительно превосходят синтетические способности инженера-химика. Вот почему ученые взялись за проблему создания трансгенных растений.

    Отсчёт  истории генетической инженерии  растений принято вести с 1982 года, когда впервые были получены генетически трансформированные растения. Метод трансформации основывается на природной способности бактерий Agrobacterium tumefaciens генетически модифицировать растения. Реконструированные штаммы Agrobactrium, содержащие неонкогенные варианты Ti-плазмид и обладающие повышенной вирулентностью, стали основой одного из наболее популярных методов трансформации. Первоначально трансформация применялась для генно-инженерных двудольных растений, однако работы последних лет свидетельствуют, что этот метод эффективен и в отношении кукурузы, риса, пшеницы. Другим широко распространённым методом трансформации, является технология, основанная на обстреле ткани микрочастицами золота (или других тяжелых металлов), покрытыми раствором ДНК. Все выращиваемые ныне коммерческие сорта получены с помощью названных выше двух методов.   

    Современный арсенал методов трансформации, однако, довольно обширен и включает такие подходы, как введение ДНК  в голые клетки (протопласты), электропорация клеток, микроинъекций ДНК в клетки, прокалывание клеток путём встряхивания их в суспензии микроигл, опосредованная вирусами инфекции и так далее.

    Генетические  изменённые растения с устойчивостью  к различным классам гербицидов в настоящее время являются наиболее успешным биотехнологическим продуктом. Дело в том, что биотехнология позволила совершить такой прыжок, так как оказалось возможным генетически изменять устойчивость растений к тем или иным гербицидам либо путем введения генов, кодирующих белки, нечувствительные к данному классу гербицидов, либо за счет введения генов, обеспечивающих ускоренный метаболизм гербицидов растений. К настоящему времени клонированы гены, кодирующие нечувствительные к действию гербицидов ферменты-мишени, что дало возможность получать трансгенные растения, устойчивые к таким гербицидам, как глифостат и хлорсульфуроновым, и имидазолиноновым гербицидом. Изолированы также гены,  которые кодируют ферменты деградации некоторых гербицидов, что позволило получить трансгенные растения устойчивые к фосфинотрицину и далапону. В 1997  году устойчивая к Roundup соя, распространяемая компанией "As Grow", была признана в США сельскохозяйственным продуктом года.

    Ученые  пошли далее. Так как множество  растений подвержены нападению и  поеданию со стороны насекомых, то ученые генной инженерии провели эксперимент с давно известной бактерией Bacillus-Thiringiensis, которая продуцирует белок, оказалось она является очень токсичной для многих видов насекомых, но в то же время безопасна для млекопитающих.,  белок  (дельта-эндотаксин, CRY-белок) продуцируется различными штамами Bacillus-Thiringiensis. Это прототаксин который расщепляется в кишечнике насекомых, образуя активированный токсин. Активизированный белок специфично связывается с рецепторами средней кешки насекомых, что приводит к образованию пор и лизису клеток кишечного эпителия. Взаимодействие токсинов с рецепторами строго специфично, что усложняет подбор комбинации токсин-насекомое. В природе найдено большое количество штаммов Bacillus-Thiringiensis, чьи токсины действуют только на определенные виды насекомых. Препараты  Bacillus-Thiringiensis в течение десятилетий использовались для контроля насекомых на полях.

    Встраивание гена этого белка в геном растений дает возможность получить трансгенные растения, не поедаемые насекомые. Но этот метод потребовал большой работы со стороны генной инженерии, в плане подборов необходимых штаммов и созданию генно-инженерных конструкций, которые дают наибольший эффект для конкретных классов насекомых. Кроме видоспецифичности по действию на насекомых встраивание прокариотических генов дельта-токсинов в геном растений даже под контролем сильных эукариотических промоторов не привело к высокому уровню экспрессии. Предположительно такое явление возникло в связи с тем, что эти бактериальные гены содержат значительно больше адениновых и тиминовых нуклеатидных оснований, чем растительная ДНК. Эта проблдема была решена путем создания модефицированных генов, где один из природного гена вырезали и добавили те или иные фрагменты с сохранением доменов, кодирующих активные части дельта-токсинов. Так, например, с помощью таких подходов был получен картофель, устойчивый к колорадскому жуку. В настоящее время так называемый Bt – растения хлопка и кукурузы занимают основную долю в общем объеме генетически модифицированных растений этих культур, которые выращивают на полях США.

     Изменение свойств сельскохозяйственных технических растений

   Современная биотехнология в состоянии манипулировать многими важнейшими признаками, которые можно разделить на группы:

1. Сельскохозяйственные  производства. К ним можно отнести  общей продуктивности растений  за счет регулирования синтеза  фитогормонов или дополнительного  снабжения кислородом растительных  клеток, а также признаки обеспечивающие устойчивость к разного рода вредителям, кроме этого в создании форм растений с мужской стерильностью и возможностью дольше сберегать урожай.

2. К  признакам которые влияют на  качество продукции, относится  возможность манипулировать молекулярным  весом жирных кислот. Растения будут производить биодеградирующий пластик, по цене сопоставимой с полиэтиленом, получаемым из нефти. Открылась возможность получения крахмала с заданными физико-химическими свойствами. Аминокислотный состав у растений запасных белков становится более сбалансированным и легко усвояем для млекопитающих. Растения становятся продуцентами вакцин, фармакологических белков и антител, что позволяет удешевить увеличение разных заболеваний, в том числе и онкологических. Получены и испытываются трансгенные растения хлопка с уже окрашенным волокном, более высоким качеством.

    Генетическая модификация пластид.

    Во  многих случаях генетической модификации  будут подвергаться не ядерные геномы, а геномопластит или метохондрия. Такие системы позволяю значительно увеличить содержание продукта в трансгенном материале.

    В генной инженерии исследуются следующие  направления:

- Управляемая активность генов;

- Селективная экспрессия трансгена в определенных тканях;

- Система экспрессии растения в чужеродной генетической информации, опосредованной вирусами.

    Разработанная усилиями компании “Biosource” (США) технология позволяет быстро и в больших количествах нарабатывать в растениях белки и небольшие молекулы за счет инфицирования растений генетически модифицированными вирусами, со встроенными чужеродными генами тех или иных белков. За этой системой большое будущее так как она позволяет изменить биосинтетические процессы в растениях без длительных и дорогостоящих манипуляций с растительным геномом.

  ГЕННЫЕ ВАКЦИНЫ

       Актуальность разработки новых вакцин

    Вакцины — одно из самых значительных достижений медицины, их использование к тому же чрезвычайно эффективно с экономической  точки зрения. В последние годы разработке вакцин стали уделять  особое внимание. Это обусловлено тем, что до настоящего времени не удалось получить высокоэффективные вакцины для предупреждения многих распространенных или опасных инфекционных заболеваний. По данным созданной в прошлом году международной организации «Всемирный союз по вакцинам и иммунизации» (в числе ее участников — ВОЗ, ЮНИСЕФ, Международная федерация ассоциаций производителей фармацевтической продукции, Программа Билла и Мелинды Гейтс по вакцинации детей, Рокфеллеровский фонд и др.), в настоящее время отсутствуют эффективные вакцины, способные предупредить развитие СПИДа, туберкулеза и малярии, от которых в 1998 г. умерло около 5 млн человек. Кроме того, увеличилась заболеваемость, обусловленная теми инфекциями, с которыми человечество ранее успешно боролось. Этому способствовало появление лекарственно-устойчивых форм микроорганизмов, увеличение числа ВИЧ-инфицированных пациентов с иммунной недостаточностью, ослабление систем здравоохранения в странах с переходной экономикой, увеличение миграции населения, региональные конфликты и др. При этом распространение микроорганизмов, устойчивых к воздействию антибактериальных препаратов, приобрело характер экологической катастрофы и поставило под угрозу эффективность лечения многих тяжелых заболеваний. Повышенный интерес к вакцинам возник после того, как была установлена роль патогенных микроорганизмов в развитии тех заболеваний, которые ранее не считали инфекционными. Например, гастриты, пептическая язва желудка и двенадцатиперстной кишки, ассоциированная с H. pylori, злокачественные новообразования печени.

    Поэтому в последние 10–15 лет правительства  многих стран стали принимать  меры, направленные на интенсивную  разработку и производство принципиально  новых вакцин. Например, в США  в 1986 г. был принят закон («National Vaccine Injury Compensation Act»), защищающий производителей вакцин от юридической ответственности при подаче судебных исков, связанных с развитием побочных реакций при вакцинации, если они не были обусловлены ошибками при производстве вакцины. С изменением ситуации увеличился и мировой рынок вакцин, объем продаж которого в 1998 г. составил 4 млрд долларов США в стоимостном выражении. Однако многие считают, что в ближайшие годы этот сектор фармацевтической промышленности будет развиваться гораздо быстрее. Так, согласно публикациям в американском журнале «Signals Magazine» (январь 1999 г.), который освещает ситуацию в современной биотехнологической промышленности, объем продаж вакцин на мировом рынке через 10 лет составит 20 млрд долларов США. Этот прогноз принадлежит М. Греко, исполнительному директору компании «Merieux MSD», совместного предприятия крупнейших производителей вакцин — компаний «Pasteur Merieux Connaught» (теперь «Aventis Pasteur») и «Merck & Co.».

        Вопросы безопасности применения

    Существуют  опасения, что молекула ДНК-плазмиды может встраиваться в ДНК хромосом человека, что приведет к мутации гена на этом участке. Однако эксперименты на мышах свидетельствуют, что интеграция плазмиды в ДНК мышей наблюдается приблизительно в 1000 раз реже, чем спонтанные мутации генов.

Известно также, что иммунологическая толерантность (неспособность к иммунному ответу на антиген) может быть вызвана повторным  введением очень низких доз антигена. При иммунизации посредством  ДНК иммуногенный протеин также  синтезируется в организме в небольшом количестве в течение продолжительного времени. Эта проблема требует более тщательного изучения, но, по-видимому, не является существенным препятствием в связи с возможностью регулирования количества вводимой ДНК и соответственно числа клеток, синтезирующих антигенный белок.Высказывалось предположение, что введение ДНК-вакцин может приводить к развитию аутоиммунных заболеваний в результате иммунной реакции, направленной против клеток организма человека, экспрессирующих антигенный протеин, или вследствие образования антител к чужеродной ДНК. Однако проведенные эксперименты позволяют надеяться, что введение ДНК-вакцин не повышает риск развития аутоиммунных реакций, во всяком случае по сравнению с применяемыми в настоящее время аттенуированными вирусными вакцинами.

          Генотерапия

    Технологии  генодиагностики и генотерапии  базируются на мировых достижениях  в расшифровке генома человека. Технологии генодиагностики включают разработку приемов точной локализации генов  в геноме человека, ответственных за наследственные и соматические заболевания, а также методологии пренатальной и доклинической диагностики. Их важной составляющей является сравнительный анализ структуры генома в норме и патологии.

    Среди технологий генотерапии в настоящее  время актуальны следующие: генотерапия соматических клеток, генотерапия репродуктивных (половых) клеток, генотерапия с использованием рибозимов и антисенс-ДНК.

    Генотерапия и генодиагностика - это перспективные  технологии фундаментальной и прикладной биомедицины, направленные на лечение и профилактику наследственных (генетических) и приобретенных заболеваний, в том числе онкологических.

    В основе генотерапии, развивающейся  на базе и в комплексе с генодиагностикой, лежит контролируемое изменение  генетического материала клеток, приводящее к "исправлению" не только наследственных, но и, как стало ясно в последнее время, приобретенных генетических дефектов живого организма.

    Важнейшей технологической задачей генотерапии  является разработка системы переноса или адресной доставки корректирующего генетического материала к клеткам-мишеням в организме больного, несущего в своем геноме дефектный ген. Предлагаемые технологии характеризуются точностью выявления гена, ответственного за генетический дефект и выбора системы переноса корректирующих генов, адресностью доставки в организм больного генетического материала, исправляющего генетический дефект.

    Технологии  генодиагностики и генотерапии  применяются в следующих отраслях:

    здравоохранение (развитие методологии генодиагностики и, в частности, системы пренатальной генодиагностики, будет способствовать своевременному выявлению генетических болезней и принятию соответствующих профилактических мер; генотерапия может быть использована для лечения болезней, связанных с мутациями генома (в том числе серповидно-клеточной анемии, эмфиземы, гемофилии и др.), инфекционных заболеваний; для коррекции дефектов центральной нервной системы и для стимуляции иммунного ответа организма при онкозаболеваниях);

    сельское  хозяйство (технологии генодиагностики и генотерапии могут быть применены в ветеринарии и фитопатологии).

    Технологии  генодиагностики и генотерапии  являются инструментом реализации новой  медико-биологической стратегии, конечная цель которой - избавление человечества от генетических и приобретенных болезней. Актуальность генотерапии для человека связана с тем, что более 5000 наследственных и приобретенных заболеваний связано с генетическими дефектами. Генотерапия может использоваться не только для лечения, но и для профилактики наследственных и приобретенных заболеваний. Таким образом, данная технология имеет большое социальное и народнохозяйственное значение.

    За  рубежом генодиагностика и генотерапия  рассматриваются как один из приоритетов  развития биомедицины. К настоящему времени одобрено более 7 протоколов по генотерапии, в которых предложены способы лечения наследственных заболеваний. Такие протоколы разрабатываются в Китае, Франции, Великобритании, Италии, Нидерландах и ряде других стран. В США Национальным Комитетом по рекомбинантным ДНК (RAC) одобрено 18 клинических испытаний с использованием генотерапии, начато лечение одного из видов рака кожи - меланомы. 
В Российской Федерации также освоены основные технологии генотерапии - секвенирование, физическое и генетическое картирование генома человека и животных, осуществляется расшифровка молекулярных механизмов наследственных и онкозаболеваний, решаются проблемы генетической безопасности человека, сохранения его генофонда в условиях разрушающего антропогенного воздействия среды. Вместе с тем, для достижения зарубежного уровня в этой области России необходимо принять срочные меры по увеличению финансирования НИОКР и по усилению приборного обеспечения. Необходимым условием развития предлагаемых технологий в стране является организация международной кооперации.