МИНИСТЕРСТВО  ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ

УО «ГОМЕЛЬСКИЙ  ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ» 
 
 

Кафедра патологической физиологии 
 
 
 
 

Методы  диагностики наследственных болезней 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

Подготовила студентка группы Д-304

Кадовба Дарья Васильевна 
 

Гомель, 2010

   В настоящее время практическая медицина имеет целый арсенал диагностических  методов, позволяющих с определённой вероятностью выявлять наследственные заболевания. Диагностическая чувствительность и специфичность этих методов  различна - одни позволяют только предположить Наличие заболевания, другие с большой точностью выявляют мутации, лежащие в основе болезни или определяющие особенности её течения.

Биохимические методы диагностики наследственных болезней. Иммуно-гистохимический метод.

   Характерные изменения биохимических показателей, выявляемые при той или иной наследственной патологии, служат постоянным, а иногда и единственным признаком заболевания. Кроме того, отклонения в биохимических параметрах, как правило, предшествуют возникновению клинических симптомов, и существенно не зависят от клинико-генетического полиморфизма, обусловливающего вариабельность заболевания по степени тяжести и времени начала манифестации. Таким образом, биохимические параметры можно считать наиболее информативным описанием фенотипа. Подтверждением этого являются биохимические показатели гетерозигот, значения которых часто занимают промежуточное положение между значениями у нормальных и патологических гомозигот: например, гетерозиготные носители рецессивного аллеля фенилкетонурии симптомов заболевания не имеют, но реагируют на введение фенилаланина более сильным повышением концентрации этой аминокислоты в плазме, чем нормальные гомозиготы.

   К тому же не для всех наследственных заболеваний обнаружен молекулярно-генетичсский дефект или имеются возможности для его выявления. В связи с этим, биохимические методы играют важнейшую роль в диагностике наследственных заболеваний, позволяя подтверждать диагноз в случае атипичной клинической картины, проводить доклиническую диагностику и начинать лечение на ранних стадиях заболевания, выявлять гетерозиготных носителей, дифференцировать генетически различные формы болезни со сходной клинической картиной. Результаты диагностики гетерозиготного носительства биохимическими методами могут быть использованы в практике медико-генетического консультирования при расчетах риска рождения ребенка с наследственным заболеванием на основе вероятностных подходов.

   Предметом биохимической диагностики могут быть различные классы органических и неорганических веществ (аминокислоты, углеводы, липиды, мукополисахариды, ионы металлов и др.) и их метаболиты, концентрация и отклонения в активности ферментов. Универсальность биохимической диагностики состоит в том, что исследовать этими методами можно любую ткань или секрет организма (мочу, пот, кровь, слюну, мышцы и др.). Это обусловливает многообразие биохимических методов и необходимость их непрерывного совершенствования.

   Безусловно, биохимические методы играют первоочередную роль в диагностике наследственных нарушений обмена веществ (НБО). Универсальность этих методов позволяет использовать их в дифференциальной диагностике и для выявления гетерозиготного носительства другой моногенной патологии, при которой изменение биохимических показателей является вторичным: например, при прогрессирующей мышечной дистрофии Дюшенна/Бекера (ПМДД/Б) повышается уровень креатин-фосфокиназы (фермент мышц) в крови больных при начальной и развернутой стадии заболевания, а также и у 30% носительниц гена ПМДД/Б.

   Для диагностики ряда состояний используют комбинированные биохимические методы. Так иммуно-генетическое тестирование позволяет поставить или уточнить диагноз при врожденных иммунодефицитных состояниях, при подозрении на антигенную несовместимость матери и плода по тем или иным системам групп крови. Иммуно-гистохимический метод используется для выявления той или иной белковой субстанции в какой-либо ткани при помощи специфичных антител (именно так проводят дифференциальную диагностику поясно - конечностных прогрессирующих мышечных дистрофий и ПМДД/Б: исследуют мышечные волокна на наличие или отсутствие в них дистрофина при помощи антител, специфичных для С-домена, Rod-домена и N-конца белка дистрофина).

   С каждым годом совершенствуясь, биохимические  методы становятся все более сложными, многоступенчатыми, а, следовательно, и дорогими. Использовать их для программ массового скрининга наследственных болезней, многие из которых встречаются в популяциях с сравнительно низкой частотой, невыгодно. Необходимо предварительное «просеивание» популяции.

   Биохимические методы подразделяют на качественные, количественные и полуколичественные.

   Качественные  реакции позволяют обнаружить избыточные концентрации субстратов блокированной ферментной реакции или их производных, накапливающихся при НБО. Качественные тесты чувствительны, просты в применении, отличаются низкой себестоимостью и не дают ложноотрицательных результатов, а информация, полученная с их помощью, позволяет с высокой долей вероятности заподозрить НБО у пациента. Однако на результаты этих тестов влияет применение ряда лекарственных препаратов и их метаболитов, а также некоторых пищевых добавок. Качественные пробы бывают: универсальными (выделяется группа заболеваний, класс веществ; например, ЦПХ-тест для мукополисахаридов) и специфическими (на цистин-гомоцистин, метилмалоновую кислоту и др,). Наиболее распространены качественные тесты с мочой, вследствие доступности и простоты получения материала для исследования.

   Полуколичественные  и количественные тесты проводятся как с мочой (тест с цианид-нитропруссидом - гомоцистинурия, цистинурия; ЦПХ-тест — мукополисахаридозы), так и с кровью (газы крови, глюкоза, ионы аммония, молочная кислота, кетоновые тела, пировиноградная кислота, холестерин, триглицериды) и могут иметь различную степень сложности. Наиболее простые из них, такие как измерение концентрации лактата, пирувата, кетоновых тел, ионов аммония, а также определение кислотно-щелочного равновесия, позволяют планировать дальнейшую тактику диагностики: так метаболический ацидоз служит показанием для проведения газовой хроматографии (ХМС) с целью исключения органических ацидурий, а повышение концентрации ионов аммония — для исключения дефектов цикла мочевины; определение концентрации кетоновых тел и соотношения концентраций лактат/пируватв крови является первым этапом для дифференциальной диагностики митохондриальных болезней.

   Конечно, решающее значение в диагностике  нарушений обмена играют более сложные  и высокоточные количественные методы, такие как флуориметрические, хроматомасе-спектрометрия, спектрофотометрия, различные виды хроматографии и электрофорез гликозаминогликанов (ГАГ), Все эти методы можно условно разделить на две группы: методы позволяющие получить спектр какого-либо класса веществ, например аминокислот, и методы для определения концентрации конкретного вещества, например фенилаланина или тирозина (флуориметрический метод). Хроматографические методы, как правило, дают информацию о спектре и количестве веществ.

   Тонкослойная, колоночная и др, виды хроматографии применяются для выделения и очистки анализируемых соединений, а также для получения результатов на полуколичественном уровне. Так, тонкослойную хроматографию используют для выявления дефектов обмена пуринов и пиримидинов, углеводов, аминокислот, олигосахаридов и гликозаминогликанов (мукополисахаридов). Метод не требует специального дорогостоящего оборудования, интерпретация результатов довольно проста, а стоимость одного анализа невысока, что иногда позволяет использовать этот метод и на первом этапе скрининга. Более того, поскольку тонкослойная хроматография в зависимости от класса используемой аппаратуры может быть качественной, полуколичественной и количественной, она может применяться на разных этапах скрининга.

   Наиболее  точным, но сложным и обладающим малой пропускной способностью (2 анализа в сутки) методом является ионообменная жидкостная хроматография с использованием аминокислотного анализатора.

   Метод высоковольтного электрофореза  с последующей нисходящей хроматографией аминокислот на бумаге дает ту же информацию, но отличается высокой пропускной способностью (30-40 проб в сутки), дешевле, чем ТСХ, но менее чувствителен.

   В последние годы все большее значение приобретают высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) и хроматомасс-спектрометрия (ХМС).

   ХМС - комбинированный метод хроматографии и масс-спектрометрии. Он позволяет получать как количественную, так и качественную информацию, например, определять какие вещества, с какой молекулярной массой, присутствуют в анализируемой пробе и в каком количестве. Кроме того, с помощью ХМС можно получить количественную информацию о неразделенных или совместно элюируемых соединениях, что является одним из важных преимуществ этого метода.

   Тандемная масс-спектрометрия (ТМС) - метод, с помощью которого можно количественно оценить 3000 метаболических маркеров разных групп НБО одновременно и охарактеризовать классы веществ и их молекулярную массу. При этом времени для подготовки проб и проведения анализа затрачивается существенно меньше, чем при использовании некоторых выше перечисленных методов, например, при ГХ.

   Таким образом, совершенствование методов  биохимической диагностики позволяет  выявлять и подтверждать все большее  количество нарушений обмена веществ. Классы НБО, диагностируемые с применением  различных биохимических методов анализа, представлены в таблице.

Близнецовый метод. Задачи и методика близнецового метода.

   Близнецовый метод используется для выяснения  наследственной обусловленности признаков  и хорошо демонстрирует взаимоотношения  между генотипом и внешней  средой. С помощью этого метода удалось оценить значимость генетической предрасположенности к многим заболеваниям, пенетрантность, экспрессивность и условия проявления тех или иных видов патологии. Близнецовые данные оказываются полезными для количественной оценки степени генетической детерминированности отдельных признаков, в связи с чем, близнецовый метод можно считать одним из важных методов количественной генетики.

   Таким образом, близнецовый метод, также  как и анализ родословной, позволяет  установить наследственный характер признаков, и это единственный метод, выявляющий соотносительную роль (удельный вес) генетических (наследственных) и средовых факторов в формировании признака. Авторство близнецового метода приписывают Ф.Гальтону (1876), который сформулировал концепцию: «природа» или «воспитание» (Nature or Nurture), и изложил основные положения вопроса в книге «Близнецы, как критерий силы наследственности и среды». Этот метод сыграл очень большую роль в развитии генетики человека, и одно время рассматривался как своеобразная «королевская дорога» в генетическом анализе человека. В последние годы, несмотря на возможности близнецового метода для понимания роли наследственности и среды, он не имеет столь широкого практического применения, как ранее. Это обусловлено появлением более точных современных методик, дающих однозначный ответ относительно генетической предрасположенности к конкретному заболеванию.

   Принцип близнецового метода прост и заключается в сравнении моно- и дизиготных близнецов. Близнецы - потомство, состоящее из одновременно родившихся особей у одноплодных млекопитающих (человека и животных). Монозиготные близнецы развиваются из одной оплодотворенной яйцеклетки и имеют 100% общих генов, т.е. выявляемые между ними различия не связаны с наследственным фактором. Дизиготные близнецы развиваются из разных яйцеклеток, оплодотворенных разными спермиями. Они имеют 50% общих генов, как обычные сибсы, но, благодаря одновременному рождению и совместному воспитанию имеют общие средовые факторы, следовательно, степень их различия определяется степенью несходства генотипов. Результатом сравнения этих двух групп близнецов является расчет показателей соответствия (конкордантности) и несоответствия (дискордантности), а также вычисление частоты возникновения заболевания /признака в каждой группе близнецов.

   Методологические  основы близнецового метода были разработаны в 1924 г. Сименсом, который показал необходимость исследования близнецов обоих типов и возможность надежной диагностики типа зиготности на основании анализа большого числа критериев. Кроме того, Сименс сформулировал принципы составления близнецовой выборки, создав предпосылки для изучения генетики нормальной изменчивости.

   Таким образом, близнецовый метод включает следующие этапы:

   1) составление выборки, 

   2) определение типа зиготности,

   3) собственно оценка результатов  сопоставления пар. 

   При составлении выборки необходимо соблюдать ряд условий:

   1) обязательно обследовать обоих  членов близнецовой пары (из выборки  исключаются пары в случае  невозможности обследования одного из близнецов);

   2) иметь статистически достаточное  количество пар близнецов, причем  соотношение пар близнецов NDZ/NMZ должно совпадать с таковым для изучаемой популяции, так как и процент многоплодия, и указанное соотношение варьируют у разных рас и народов. Рассчитать количество ди- (NDZ) и монозиготных (NMZ) пар достаточно легко:

   а) NDZ = 2 х (количество разнополых пар), так как рождение однополых и разнополых дизиготных близнецов равновероятно, отсюда NMZ = NDZ + Mz - NDZ;

   б) или по формуле Вайнберга

   3) учитывать соответствие возраста  и пола близнецов в сравниваемых  выборках. Для установления типа  зиготности можно использовать  следующие методы:

   метод оценки количества плодных оболочек (плаценты и хориона) и метод полисимптомного сходства, предложенный Сименсом и Фершуером в 1924 г. и основанный на сравнении партнеров по внешним морфологическим признакам. Но самым надежным диагностическим тестом является метод оценки частоты встречаемости моногенных полиморфных признаков, впервые примененный Смитом и Пенроузом при анализе зиготности близнецов по группам крови. Для установления типа зиготности этим методом можно использовать анализ эритроцитарных и лейкоцитарных антигенов, белков сыворотки крови, ПДРФ-маркеров, восприятие вкуса фtнилтиокарбамида, а также содержание различных веществ в слюне, моче, поте. Сущность этого метода заключается в вычислении по теореме Байеса вероятности дизиготности и монозиготности пары близнецов одного пола при наличии у них одинаковых маркеров. Вероятность наличия у дизиготных близнецов одинаковых показателей в n-системах, равна произведению вероятностей по каждому тесту (Pd = Pdl x Pd2 x Pdn), а то, что они монозиготны - Рт = (1 — Pd). Результаты расчетов вероятностей встречаемости признаков показали, что сходство дизиготных близнецов по пяти локусам от двух гетерозиготных родителей ожидается лишь в 1,4%.

   Оценка  результатов сопоставления пар включает расчет конкордантности пар, а также доли наследственной обусловленности признака.

   Конкордантность (С) — показатель идентичности близнецов пары по определенному признаку; соответствует доле сходных (конкордантных) по изучаемому признаку пар среди обследованных пар близнецов для каждой группы):

   где n - число пар близнецов соответствующей группы, у которых признак отмечен у обоих партнеров, N - общее число обследованных близнецовых пар этой же группы.

   Дискордантность (D) по признаку, как правило, рассчитывается для дизиготных близнецов, как доля дискордантных (т.е. признак выявлен только у одного из двух партнеров) по изучаемому признаку пар среди всех обследованных дизиготиых пар близнецов или по формуле:

   DDZ=100%-CDZ.

   Аналогично  можно рассчитать и дискордантность  для монозиготных близнецов.

   Существуют  таблицы конкордантности близнецов  по различным признакам и заболеваниям, составленные эмпирически. Чем больше наследственная компонента, тем больше различаются по конкордантности моно- и дизиготные близнецы. Для определения доли наследственной обусловленности признака рассчитывается коэффициент наследуемости (Н) по формуле Хольцингера:

   Если  Н > 0,7 (70%), то решающая роль в проявлении признака принадлежит наследственным факторам, если показатель Н находится  в интервале 0,3—0,7 (30—70%), то на проявление признака оказывают влияние как  наследственные, так и внешнесредовые факторы с тем или иным преимуществом. Основная роль факторов внешней среды в проявлении признака предполагается, если Н < 0,3 (30%).

   Близнецовые исследования, (определение коэффициента наследуемости и конкордантности  пар) сыграли значительную роль при изучении генетики поведения, многих инфекционных и, так называемых, мультифакториальных заболеваний.

   Довольно  часто в генетике человека используется не классический близнецовый метод, а его модификации, например, для  изучения возможностей улучшения определенных характеристик интеллекта путем психологической тренировки — метод контроля по партнеру, для исследования сахарного диабета - метод близнецовых семей. Наследование психологических особенностей личности и интеллекта удобно анализировать на разлученных близнецах, которые были разделены в младенческом или раннем возрасте и воспитывались раздельно, не имея влияния общей среды и специфического взаимодействия между собой.

   Однако  не всегда возможно получить достоверные  данные при изучении признаков близнецовым методов, это связано с систематическими различиями между близнецами и не близнецами по ряду признаков (по массе, частоте врожденных аномалий, индексу IQ) и психологическими и социальными особенностями развития близнецов в постнатальный период. Эти факторы и являются ограничениями использования данного метода.

Клинико-генеалогический  метод. 

   В основе генеалогического метода, предложенного в конце XIX века Ф.Гальтоном, лежит составление родословных, на основании выявления всех членов анализируемой семьи, установления степени их родства, и прослеживания того или иного признака в ряду поколений.

   Применительно к целям медицинской генетики этот метод часто называют клинико-генеалогическим, так как наибольший интерес исследователей в этой области вызывает изучение сегрегации патологического симптома или болезни. Клинико-генеалогический метод наиболее универсальный и поэтому используется для решения широкого круга задач медицинской генетики. Несмотря на появление новых лабораторных методов, анализ родословных не потерял своей актуальности и успешно применяется для установления наследственного характера признаков и заболеваний. Правильно составленная родословная с выявлением всех членов семьи, установлением между ними родственных связей и оценкой состояния их здоровья позволяет с достаточно высокой вероятностью установить тип наследования и определить пенетрантность и экспрессивность мутантного гена.

   Тщательный  анализ клинических проявлений заболевания  у больных из одной и той  же семьи может быть использован при расшифровке механизмов взаимодействия генов. Например, если в семье отмечаются различия в тяжести и особенностях клинических проявлений заболевания с аутосомно-доминантными типом наследования у родителя и потомков, то можно предположить наличие модифицирующего влияния рецессивного аллеля здорового родителя на патологический аллель с доминантным эффектом. Продемонстрируем это на примере родословной, представленной на рисунке.

   В данной ядерной семье отец и двое его сыновей страдают заболеванием с аутосомно-доминантным типом наследования, возникновение которого обусловлено мутацией в аллеле гена А, обладающего доминантным эффектом в гетерозиготном состоянии. Второй, рецессивный, аллель, обнаруженный у больного отца, обозначим a 1. Если для данного гена существует система множественных аллелей, то здоровая мать больных сибсов может иметь различное сочетание рецессивных аллелей (в представленной родословной показано, что она имеет аллели а1 и а2). При выявлении различий в клинической картине заболевания у пораженного отца, имеющего генотип Аа1 и его детей с генотипом Аа2 можно предположить наличие модифицирующего влияния аллеля а2 на доминантный аллель А.

   Клинико-генеалогический  метод демонстрирует генетическую гетерогенность многих заболеваний, например, таких как альбинизм, тугоухость, наследственная моторно-сенсорная нейропатия и других.

   В последние годы возросла роль клинико-генеалогического метода при проведении анализа сцепления локуса заболевания с полиморфными маркерами ДНК. Именно тщательно собранные родословные и идентификация генетического статуса всех ее членов могут быть основой для локализации генов и их последующей идентификации.

   Применение  клинико-генеалогического метода может  быть полезным и при изучении интенсивности  мутационного процесса.

   Медико-генетическое консультирование немыслимо без  клинико-генеалогического метода, поскольку  именно он позволяет выявить в  родословной лиц, являющихся гетерозиготными  носителями мутантного гена, и определить прогноз потомства в семье, где  имеется или предполагается рождение ребенка с наследственной патологией.

   Клинико-генеалогический  метод включает три основных этапа: клиническое обследование, составление  родословной и генеалогический  анализ.

   При составлении родословных  принято использовать унифицированные символы, представленные на рисунке. Составление родословной начинается с пробанда (от англ. probe - зондирование), т.е. с лица, первым попавшего в поле зрения исследователя. Чаще всего им оказывается больной или носитель признака, сегрегацию которого необходимо проследить при анализе родословной. Однако им может быть и любой родственник больного, обратившийся за медико-генетической консультацией. Всех детей одной супружеской пары называют сибсами (от англ. аббревиатуры SIBS: Sisters - BrotherS). Если общим у братьев и сестер является только один из родителей, их называют полусибсами. В родословной сибсы располагаются в порядке рождения горизонтально слева направо, начиная со старшего.

   При составлении родословной желательно получить сведения о максимальном количестве родственников 3-4 поколений. Чаще всего родословная бывает представлена последовательными, соединенными между собой горизонтальными рядами, однако, в том случае, если членов родословной оказывается очень много, эти ряды могут быть представлены в виде концентрических окружностей. Все члены одного поколения располагаются строго в одном ряду. Ряды поколений обозначают римскими цифрами. Представители одного поколения нумеруются арабскими цифрами, последовательно — слева направо. Таким образом, каждый член родословной имеет свой шифр двоичной системы, например- 1-1,II-1, II-2 и т.д.

   Необходимо  указывать возраст всех членов родословной, так как некоторые заболевания  проявляются в различные периоды  жизни, и отмечать лично обследованных знаком «!». Супруги родственников пробанда, если они здоровы, могут не изображаться. При рассмотрении нескольких признаков прибегают к буквенным или штриховым изображениям внутри символов.

   Далее, внизу под родословной записывается легенда (данные о состоянии здоровья родственников, причинах и возрасте смерти и др.) и указывается дата составления этого документа.

   Использование клинико-генеалогического метода предполагает плательное клиническое обследование всех членов родословной с целью  выявлена у них стертых или  атипичных признаков заболевания. Иногда это оказывается возможным только с помощью дополнительных параклинических методов исследования (например, рентгенологических, биохимических, электрофизилогических, морфологических и других). При невозможности обследования всех членов родословной сбор информации о наличии в семье пробанда заболеваний или признаков, указывающих на таковое, можно проводить разными методами. Например, путем опроса или анкетирования. К сожалению, в настоящее время составление родословных представляет собой сложную задачу, вследствие того, что люди зачастую имеют скудные, отрывочные или неточные сведения о своих родственниках и состоянии их здоровья. Все это затрудняет постановку диагноза.

   Сбор  анамнестических  данных проводится по определенной схеме.

   1. Сведения о пробанде — анамнез  заболевания, включающий начальные  признаки и возраст их манифестации, последующее течение болезни;  если это ребенок - сведения  о раннем психомоторном и последующем  умственном и физическом развитии.

   2. Данные о сибсах (братьях и  сестрах) и родителях пробанда  — возраст, здоровы или больны, проведение аналогии с заболеванием  пробанда в случае болезни. 

   3. Сведения о родственниках со  стороны матери (родители, их дети, внуки).

   4. Сведения о родственниках со стороны отца (родители, их дети, внуки).

   Полученные  данные записываются в этой последовательности в медико-генетическую карту. Чем  больше родственников пробанда будет  непосредственно опрошено или обследовано, тем выше шансы на получение более достоверных и полезных сведений, так как наследственные заболевания в семье часто скрываются или неправильно диагностируются. Необходимо внимательно анализировать сообщения об инфекциях и травмах, характер течения которых может указывать на сопутствующее наследственное заболевание или предрасположенность к нему. Важно учитывать генетическую гетерогенность и варьирующую экспрессивность наследственных заболеваний.