Микотоксины. 2

МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И  НАУКИ РФ ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ  БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ

«МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ  ПИЩЕВЫХ ПРОИЗВОДСТВ»

Кафедра: «Методы определения микотоксинов и контроль за загрязнением пищевых продуктов»

Доклад на тему:

«Микотоксины»

Выполнил:  Студент 09-Т-6

Ивашкина  Л.С.

Проверил:

Концевова А.А.

Москва 2013

Основные микотоксины.

Наличие микотоксинов в кормах приводит к ухудшению продуктивности, репродуктивности и иммунного состояния животных. Микотоксины отличаются по химическому строению, токсичности и механизму действия. Общим признаком всех микотоксинов является токсичность большей частью для животных. Наиболее часто используется классификация микотоксинов по молекулярному строению, согласно которой различают афлатоксины, трихотеценовые микотоксины, охратоксины, фумонизин, зеараленон и его производные, монилиформин, фузарохроманон, алкалоиды спорыньи, циклопиазоновую кислоту, патулин, цитринин и т. п.

Трихотеценовые микотоксины синтезируются грибами родов Fusarium, Cephalosporium, Myrothecium, Stachybotrys, Trichoderma и Trichothecium; содержат 12,13-эпоксисесквитерпеноидный остаток (трихотекан); известно около 100 трихотеценовых микотоксинов.

В основе механизма токсичнеского действия лежит способность ингибировать синтез белка.

Агаритин - микотоксин некоторых агариковых грибов (Agaricales), в том числе и шампиньона двуспорового.

Афлатоксины - микотоксины, которые вырабатывают грибы Aspergillus flavus и Aspergillus parasiticus. Они являются загрязнителями арахиса, кукурузы и других зерновых и масличных культур; характеризуются сильным гепатоканцерогенным действием.

Охратоксин вырабатывается грибами родов Aspergillus и Penicillium. Они содержат остаток изокумарина, соединенный пептидной связью с L-аланином. Обладают выраженным нефротоксическим и тератогенным действием

Цитринин вырабатывается грибами родов Penicillium и Aspergillus; характеризуется нефротоксическим действием, а также антибиотическими свойствами против грамположительных и грамотрицательных бактерий; причастен к микотоксикозу «желтый рис» в Японии.

Зеараленон синтезируется грибами из рода Fusarium (F. graminearum, F. tricinctum); относится к лактонам резорциловой кислоты; характеризуется анаболическим и эстрогенным действием.

Фумонизин вырабатывается грибами Fusarium moniliforme и F. proliferatum; содержат диэфир пропан-1,2,3-трикарбоновой кислоты и 2-амино-12,16-диметил-3,5,10,14,15-пентагидроксиэйкозана; загрязняют кукурузу и продукты ее переработки; вызывают уменьшение в сыворотке крови комплекса сфинголипидов при одновременном увеличении сфингозина и сфинганина.

Монилиформин — микотоксин, вырабатываемый некоторыми видами рода Fusarium (F. moniliforme, F. acuminatum, F. avenaceum, F. Oxysporum и др.); представляет собой смесь K- и Na-солей 3-окси-3-циклобутен-1,2-диона; необратимо ингибирует пируватдегидрогеназный комплекс.

Фузарохроманон — микотоксин, который содержится в грибах вида Fusarium equiseti; вызывает большеберцовую дисхондроплазию у кур и индеек и увеличивает смертность куриных эмбрионов.

Аурофузарин относится к димерным нафтохинонам; вырабатывается грибами рода Fusarium; вызывает у кур синдром ухудшения качества яйца.

Патулин — микотоксин, вырабатываемый различными плесневыми грибками из родов Penicillium и Aspergillus и обладающий выраженными токсическими и мутагенными свойствами. В высоких концентрациях патулин обнаруживается в продуктах переработки фруктов и овощей.

Патулин действует как антибиотик широкого спектра действия и проверен на эффективность при общих простудных заболеваниях. Однако эффективность никогда не проверялась на практике и, из-за незначительной токсичности, его использование в медицинских целях не рассматривается по причине его раздражающего действия на желудок и способности вызывать тошноту и рвоту

Симптомы патулин-токсикоза включают геморрагии в желудочно-кишечном тракте крупного рогатого скота (телят). В 1954 году в Японии патулин привел к смерти 100 коров, которые потребляли контаминированный корм.

Смертельная доза патулина для крыс составляет 15 мг/кг тела и 25 мг/кг после подкожной инъекции. При этом смерть была связана с отеком легких. В хронических исследованиях при низких дозировках какого-либо эффекта не наблюдалось. Установлена иммунотоксичность и нейротоксичность патулина. В некоторых исследования установлена генотоксичность, например, что он повреждает ДНК или хромосомы в краткосрочных опытах. Однако эти исследования были проведены на бактериях или на маммилярных культурах клеток с дозами, которые несущественны для человека.

Основываясь на продолжительных  исследованиях на крысах и мышах по исследованию репродукции и канцерогенности, JECFA установила условно переносимую дозу недельного потребления патулина на уровне 7 мкг/кг массы тела.

1.2. Скрининг –  методы определения микотоксинов

Современные методы обнаружения  и определения содержания микотоксинов в пищевых продуктах и кормах включают скрининг – методы, количественные аналитические и биологические методы.

Скрининг – методы отличаются быстротой и удобны для проведения серийных анализов, позволяют быстро и надежно разделять загрязненные и незагрязненные образцы. К ним относятся такие широко распространенные методы как метод тонкослойной хроматографии для одновременного определения до 30 различных микотоксинов, флуоресцентный метод определения зерна, загрязненного афлотоксинами, миниколоночный метод и некоторые другие. Методы тонкослойной хроматографии основаны на различии скоростей перемещения компонентов анализируемой смеси в плоском тонком слое сорбента при движении растворителя (элюента). Растворитель перемещается под действием капиллярных или гравитационных сил. Разница между этими методами заключается лишь в способе формирования рабочего слоя. В ТСХ слой сорбента наносят на поддерживающую подложку (пластинку, пленку). Разделение в ТСХ осуществляется вследствие многократного пересечения молекулами веществ границы фаз твердая — жидкая или жидкая — жидкая, т.е. вследствие многократного распределения вещества между подвижной и неподвижной фазами. Неподвижной фазой служит либо сухой сорбент (адсорбционная хроматография), либо сорбент, покрытый жидкой фазой (распределительная хроматография). Систему растворителей подбирают в соответствии со свойствами разделяемых веществ.

1.3. Количественные  аналитические методы определения  микотоксинов

Количественные аналитические  методы определения микотоксинов представлены химическими, радиоиммунологическими и иммуноферментными методами. Химические методы являются в настоящее время наиболее распространенными и состоят из двух стадий: стадии выделения и стадии количественного определения микотоксинов. Стадия выделения включает экстракцию (отделение микотоксина от субстрата) и очистку (отделение микотоксина от соединений с близкими физико-химическими характеристиками). Окончательное разделение микотоксинов проводится с помощью различных хроматографических методов, таких как газовая (ГХ) и газожидкостная (ГЖХ), тонкослойная хроматография (ТСХ), высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) и масс-спектрометрия. Количественную оценку содержания микотоксинов проводят путем сравнения интенсивности флуоресценции при ТСХ в ультрафиолетовой области спектра (максимум возбуждения 360-365 нм) со стандартами. Афлатоксины В1 и В2 обладают синей флуоресценцией (максимум эмиссии 425 нм), афлатоксины G1 и G2 сине-зеленой флуоресценцией (максимум эмиссии 450 нм). Флуоресцентные методы анализа имеют высокую чувствительность и позволяют обнаружить афлатоксины В1 и G1 на уровне 1-2 мкг/кг, афлатоксины В2 и G2 на уровне 0,5-1 мкг/кг и афлатоксин М1 на уровне 0,5-1 мкг/кг. Отбор проб производится в соответствии с нормативными документами на данный вид продукции. Анализ необходимо произвести в течение 3 суток с момента отбора при условии хранения проб при температуре, предусмотренной для хранения данного вида продукции. Количество пробы, отбираемой для анализа, составляет не менее 100 г. Все более широкое применение находят радиоиммунохимические и иммуноферментные методы, что связано с их высокой чувствительностью. Эти методы основаны на получении антисывороток к коньюгатам микотоксинов с бычьим сывороточным альбумином. Иммуноферментный анализ (ИФА) – относится к группе иммунохимических методов биохимического исследования. Метод основан на специфическом взаимодействии антитела (Ат) с антигеном (Аг) – специфические компоненты реакции. В разных вариантах постановки метода АГ или АТ, помечается так называемой ферментной меткой. Последняя представляет собой очищенный фермент высокой активности, присоединенный посредством физико-химического взаимодействия к молекуле ат или аг. Фермент используется для визуализации иммунного взаимодействия. На последнем этапе постановки реакции добавляется субстрат, на который воздействует фермент с образованием специфического продукта. Еще одним принципиальным условием постановки метода является отделение, образующегося иммунного комплекса от других составляющих реакционной среды. Это достигается, как правило, адсорбцией одного из специфических компонентов реакции на каком-то носителе (чаще всего на материале из которого изготовлена емкость, в которой ставится реакция). Затем посредством отмывания от мешающих компонентов в реакционной среде остается только искомый иммунный комплекс, с ферментной меткой к которому добавляется субстрат. Теоретически метод основывается на одном из фундаментальных законов химии - законе действия масс. Применительно к данному методу используется частный вывод из закона – количество меченого антигена, связавшегося с антителами, будет обратно пропорционально количеству определяемого антигена. Радиоиммунологический метод диагностирования (РИМ) основан на применении радиоизотопной метки антигенов или антител. Обычно используется твердофазовый вариант РИМ. при котором антигены или антитела (в зависимости от задачи исследования) адсорбируются на твердом носителе, (целлюлоза, полистеролы и др). Сущность метода в том, что определяется количество известного меченого антигена (антитела) до и после его контакта с искомыми антителами (или антигенами). 
Если последние соответствуют меченому антигену (антителу) и использованным в опыте антителам (антигену), часть или все активные центры антител (антигенов) будут блокированы этим искомым антигеном (антителом), и добавленный затем меченый антиген (антитело) остаются несвязанными или связанными, лишь частично, что и будет зарегистрировано радиометрически.

1.4. Биологические  методы определения микотоксинов

Биологические методы обычно не отличаются высокой специфичностью и чувствительностью и применяются, главным образом, в тех случаях, когда отсутствуют химические методы выявления микотоксинов или в дополнение к ним в качестве подтверждающих тестов. Однако эти методы широко применяют для общей токсикологической оценки кормов при отравлениях животных на первой стадии лабораторного токсикологического исследования. С помощью этих методов можно установить отравление и исключить заболевания другой этиологии. В качестве тест – объектов используют различные микроорганизмы, куриные эмбрионы, различные лабораторные животные, культуры клеток и тканей.

1.5. Контроль за загрязнением пищевых продуктов

В настоящее время вопросы  контроля за загрязнением продовольственного сырья, пищевых продуктов и кормов микотоксинами решаются не только в рамках определенных государств, но и на международном уровне, под эгидой ВОЗ и ФАО.

В системе организации  контроля за загрязнением продовольственного сырья и пищевых продуктов можно выделить два уровня: инспектирование и мониторинг, которые включают регулярные количественные анализы продовольственного сырья и пищевых продуктов.

Мониторинг позволяет  установить уровень загрязнения, оценить  степень реальной нагрузки и опасности, выявить пищевые продукты, являющиеся наиболее благоприятным субстратом для микроскопических грибов – продуцентов  микотоксинов, а также подтвердить эффективность проводимых мероприятий по снижению загрязнения микотоксинами. Особое значение имеет контроль за загрязнением микотоксинами при характеристике качества сырья и продуктов импортируемых из других стран.

В соответствии с системой Анализа опасности и критических  контрольных точек (HACCP), путем идентификации  и оценки риска, обусловленного наличием микотоксинов, в процессе производства и потребления зерна и комбикормов было выделено 7 критических контрольных точек, на которых необходимо предпринимать меры для предотвращения контаминации: (1) состояние и качество семян, (2) качество обработки почвы, (3) период прорастания, (4) уборка урожая, (5) период после уборки урожая, (6) хранение и (7) переработка. Для того чтобы избежать загрязнения зерна и кормов микотоксинами, необходимо тщательно придерживаться технологических норм в первых шести критических контрольных точках. Если загрязнение все-таки произошло, то следует принять меры по обеззараживанию (деконтаминации) зерна и кормовых субстратов до использования и по профилактике отравлений (микотоксикозов) животных при использовании токсичных кормов.

Процесс деконтаминации зерна представляет собой направленное воздействие физических, химических или биологических факторов (агентов), а также их комбинаций, в результате которого происходит деградация (разрушение) содержащихся в зерне микотоксинов. Зерно подвергают обработке деконтаминирующими факторами либо в сухом виде, либо в водной среде. В большинстве случаев второй подход оказывается более эффективным в силу того, что, во-первых, преобладающее количество реакций, ведущих к детоксикации, происходит в водной среде, во-вторых, в сухом субстрате микотоксины гораздо менее доступны для действия как физических, так и для химических агентов. Недостатком этого подхода является необходимость удаления остатков химических агентов, наличие которых в кормах нежелательно, и продуктов трансформации микотоксинов во избежание возможности обратных реакций и реакций активации. Кроме того, после завершения деконтаминации зерно необходимо высушить, что требует дополнительных энергетических затрат.

Это один из наиболее ранних приёмов по обеззараживанию зерновых продуктов. В основе метода детоксикации зерна путем вымачивания лежат два механизма: (1) экстракция водорастворимых микотоксинов и (2) трансформация ферментами, содержащимися в зерне. Многие микотоксины, молекулы которых содержат гидрофильные группы, эффективно экстрагируются водой. К таким микотоксинам относятся ДОН, ниваленол, НТ-2 токсин, Т-2 триол, Т-2 тетраол. Предложен метод обезвреживания фуражного зерна, согласно которому зерно заливают четырёхкратным объёмом воды и выдерживают, помешивая, 6 часов, после чего воду меняют. Таким образом, в течение суток процедуру повторяют четыре раза. Показано, что обработанная таким образом культура на зерне токсигенного штамма Fusarium sporotrichiella 5750 теряла присущую изначально способность вызывать образование некрозов на коже кролика.

Обработка аммиаком или монометиламином  эффективна в отношении афлатоксинов, зеараленона и охратоксинов. Эфирные и лактонные группы, имеющиеся в составе молекул зеараленона и родственных ему соединений, а также охратоксинов и афлатоксинов, взаимодействуют с первичными и вторичными аминами, в результате чего образуются амиды, что коренным образом изменяет свойства молекул микотоксинов. Однако разрыв лактонного кольца при воздействии этих веществ происходит лишь при инкубации от получаса до нескольких часов в сильнощелочной среде, при температуре 100°С и давлении от 3 до 10 бар. Установлено, что углеаммонийные соли (УАС) способны разрушать афлатоксины B1 и G1, а также Т-2 токсин с образованием Т-2 триола и Т-2 тетраола. При концентрации УАС в зерне 8 % и экспозиции 4 недели концентрация афлатоксина B1 снижалась на 75 %, афлатоксина G1 на 94 %, начальные концентрации которых составляли 40 и 12 мг/кг, соответственно. УАС обладают сильным фунгицидным, бактерицидным и инсектицидным действием. В зависимости от вида и влажности зерна концентрация УАС должна составлять от 2,5 до 4,5 %. В этих концентрациях УАС не оказывают отрицательного воздействия на цыплят.

При контакте микотоксинов с окислителями происходит разрушение функциональных групп, обуславливающих токсические свойства. Образующиеся при этом метаболиты характеризуются высоким содержанием гидрофильных групп, вследствие чего легко вымываются из обрабатываемого субстрата.

Действующим началом гипохлорита  натрия является активный (восстановленный) хлор и кислород. Сильно выраженные окислительные свойства делают ГХН  эффективным дезинфицирующим и  детоксицирующим средством. Разработан способ улучшения качества зерна и семян, который заключается в обработке зерна растворами ГХН. В зависимости от преследуемой цели, обработку осуществляют путем кратковременного погружения зерна в рабочий раствор, аэрозольного распыления раствора над поверхностью зерна или длительного вымачивания. Гипохлорит натрия используют в виде чистого раствора либо в смеси со щелочами, перекисью водорода, органическими растворителями (этанолом, этилацетатом) или органическими кислотами (уксусной, надуксусной). При вымачивании в течение 7 часов в щелочном 0,8 % растворе гипохлорита происходит снижение концентрации ДОНа, ниваленола, зеараленона, монилиформина, фумонизинов, охратоксина А, цитринина и патулина. В результате обработки повышается интенсивность естественной пигментации зерна (яркость) и снижается краснота, которая, как известно, обусловлена наличием пигментов плесневых грибов, многие из которых высокотоксичны, например, аурофузарин. Кроме того, значительно снижается процент семян, инфицированных фитопатогенными бактериями, в том числе родов Xanthomonas и Pseudomonas, и грибами родов Fusarium (F. graminearum, F. solani), Alternaria, Helminthosporium и т. п.

Эффективным окислителем  микотоксинов является озон. Для деконтаминации зерна используют насыщенную озоном воду. При воздействии озона происходит деградация афлатоксинов B1, B2, G1 иG2, циклопиазоновой кислоты, фумонизина B1, охратоксина А, патулина, секаловой кислоты и зеараленона. Вследствие модификации озоном зеараленон теряет эстрогенную активности. Обработка озоном естественно контаминированной афлатоксином кукурузы предотвращает развитие афлатоксикоза у индеек. Показано, что трихотеценовые микотоксины тоже разрушаются при воздействии озона. Наиболее активно молекула озона атакует молекулу трихотецена по двойной связи между атомами С9 и С10, в результате чего образуются нестабильные промежуточные соединения, молозонид и озонид трихотеценов, с сопутствующим гидролизом связи С9-С10.

Микотоксины формируют разнородную по химическому строению группу соединений. Поэтому ферменты, обладающие способностью трансформировать микотоксины, являются представителями нескольких классов и подклассов и специфичны в отношении различных функциональных групп. Детоксикация микотоксинов происходит в результате действия ферментов, обладающих оксидоредуктазной, гидролитической (эпоксидгидролазы, карбоксилэстеразы, лактоногидролазы) и трансферазной (УДФ-гликозилтрансферазы) активностью.

Карбоксилэстеразы катализируют гидролиз сложноэфирных связей, а эпоксидгид-ролазы — 12,13-епоксигруппы в молекулах трихотеценовых микотоксинов. Установлено, что именно эти два процесса осуществляются бактериями, населяющими кишечник кур. Смеси микробов, изолированных из содержимого кишечника, способны трансформировать более 12 различных трихотеценовых микотоксинов. Ранее было установлено, что включение в корм для кур-несушек культуры штамма Escherichia coli, изолированного из толстого кишечника, приводило к увели-чению живой массы и яйценоскости на фоне Т-2 токсикоза, по сравнению с группой, по-лучавшей только Т-2 токсин; концентрация Т-2 токсина в корме составляла 8 мг/кг.

УДФ-гликозилтрансферазы осуществляют конъюгацию микотоксинов с активиро-ванными формами глюкозы. В геноме Arabidopsis thaliana содержится более 100 генов, кодирующих различные изофомы этого фермента. Гены наиболее специфичных в отношении ДОНа УДФ-гликозилтрансфераз экспрессированы в клетках дрожжей. Ферменты, полученные от трансформированных таким образом дрожжей, эффективно разрушают ДОН, 3-ацетл-ДОН и 15-ацетил-ДОН, однако менее действенны в отношении остальных трихотеценовых микотоксинов. Такие дрожжи рекомендуют использовать в пивоваренной промышленности. Для деконтаминации зерна и комбикормов можно использовать как иммобилизованную УДФ-гликозилтрансферазу, так и продуцирующие её дрожжи.

Лактоногидролазы превращают зеараленон в 1-(3,5-дигидрокси-фенил)-10’-гидрокси-1’-ундецен-6’-он, который не имеет эстрогенной активности. Из Clonostachys rosea изолирован ген zdh101, кодирующий лактоногидролазу. Этот ген удалось экспресси-ровать в клетках бактерии Escherichia coli, дрожжей Saccharomyces cerevisiae и культуре клеток риса. Зеараленон эффективно ("100 %) трансформировался в средах с культурами E. coli и клеток риса, тогда как трансформированные дрожжи снижали содержание зеараленона в культуре на 75 %.

Фумонизингидролаза. Из зерен кукурузы изолированы штаммы микроорганизмов — дрожжей Exophiala spinsfera и Rhinocladiella atrovirens, а также бактерий родов Xanthomonas и Sphingomonas, которые могли расти на средах, единственным источником углерода в которых были фумонизины. Установили, что первой и ключевой реакцией процесса биодеградации фумонизина B1 является гидролиз эфирной связи с образованием трикар-баллилата и аминоспиртового производного, обозначенного АР1. Ферменту, осуществ-ляющему эту реакцию, дали название фумонизин гидролаза. Предполагают, что данный фермент относится к эстеразам, специфичным к эфирам трикарбаллилата. Ни одна из коммерческих эстераз не обладает подобной активностью. Тем же способом из кукурузного зерна выделены бактерии Ochrobactrum anthropi, которые в качестве единственного источника углерода могут утилизировать монилиформин. Пока неизвестно, какие именно ферменты участвуют в детоксикации монилиформина, но полагают, что сначала происходит гидролиз двойной связи и разрыв кольца, а затем окисление. Предложен метод деконтаминации кукурузы, согласно которому кукурузу размалывают, заливают равным объемом взвеси бактерий с концентрацией клеток 106 в 1 мл и выдерживают в течение двух недель при комнатной температуре.

Обработка ультразвуком на явлении ультразвуковой микрокавитации — локальном волнообразном образовании пор (пузырьков) с пониженным давлением и повышении давления до 100 кПа и температуры до 1700 °С. Высокочастотные колебания, сообщаемые обрабатываемому материалу ультразвуковыми волнами, способствуют эффективному высвобождению микотоксинов в раствор. Кроме физического воздействия, ультразвуковые волны запускают так называемые сонохимические реакции, отличающиеся по термодинамическим и кинетическим характеристикам от аналогичных реакций, протекающих в нормальных условиях, то есть в отсутствие ультразвукового воздействия. Зерно загружают в контейнеры, на стенках которых расположены генераторы ультразвука, заливают реакционной смесью и обрабатывают ультразвуком с частотой 35—100 кГц в течение 2—4 часов при температуре 12—50 °С. Данный метод позволяет снизить концентрацию Т-2 токсина, НТ-2 токсина, ДОНа, зеараленона, охратоксинов и афлатоксинов в зерне злаковых на 70—80 %. Эффективно разрушается эпоксидная группа трихотеценовых микотоксинов, играющая, как известно, ключевую роль в механизме токсического действия. Гидролизу эпоксигруппы способствует сдвиг кислотно-основного равновесия, как в сторону снижения, так и в сторону повышения рН. Для защелачивания среды можно использовать карбонаты, а также первичные и вторичные амины. В роли катализаторов могут выступать спирты, например, метанол, этанол, пропанол, глицерин или полиэтиленгликоль. Кроме участия в сонно-химических реакциях трансформации микотоксинов, спирты, присутствующие в реакционной смеси, улучшают смачивание зерна и повышают растворимость микотоксинов и, следовательно, их экстракцию из зерна. После завершения ультразвуковой обработки, реакционную смесь сливают, а обработанное зерно промывают водой, при необходимости повторно подвергая воздействию ультразвука, и высушивают.