Моноклональные антитела. 2

     Содержание

     1. Введение ………………………………………………………………………………2

     2. Функциональная структура антител…………………………………………………3

     3. Получение моноклональных антител………………………………………………..5

     4. Методы анализа на основе моноклональных антител………………………….…..7

     5. Применение моноклональных антител…………………………………………..…11

     6. Заключение…………………………………….…………………………………..…12

     7. Список использованной литературы………………………………………………..13 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

     Введение  

     При введении в организм животных и человека чужеродных макромолекулярных веществ — белков или полисахаридов (антигенов) в крови появляются  защитные белки - антитела, для которых характерна уникальная специфичность. Каждое антитело узнает только свой антиген, - точнее, одну его детерминантную группу. Детерминантная группа состоит из нескольких аминокислот (обычно из 6—8), образующих пространственную  структуру, характерную для данного белка.

     В одном белке, состоящем из нескольких сотен аминокислот имеется несколько (5-15) разных детерминант, поэтому к одному белку образуется целое семейство различных по своей специфичности антител. Даже к одной детерминанте образуется целый спектр антител, которые отличаются по структуре, степени  специфичности и прочности связывания с ней. Детерминантные группы полисахариднымх антигенов образуются 3—6 остатками моносахаридов.

     Таким образом, при введении антигена возникает  большое семейство антител, направленных к разным его детерминантам. В каждой возникшей группе антитела, направленные к одной детерминанте, различаются между собой. В крови иммунизированных животных появляется богатый и уникальный по составу спектр антител, который и обеспечивает абсолютную специфичность в распознавании данного антигена.

     Антитела  используются для нейтрализации  бактериальных токсинов (дифтерийного, столбнячного), змеиных ядов (кобры, гадюк) вирусов, попавших в кровь (особенно эффективно вируса кори), и для идентификации индивидуальных белков (и других антигенов), находящихся в  клетке или сложнейших тканевых экстрактах. Однако иногда требуются не многокомпонентные смеси антител, возникающие в крови в ответ на введение антигена, а отдельные, элементарные составляющие этой смеси, направленные лишь к одной детерминанте антигена и имеющие одни и те же характеристики. Такие антитела бывают нужны как для изучения их собственной природы, так и для практического использования, например для ставки в опухоли токсических веществ. 
 
 
 
 
 

     2. Функциональная структура антител 

     Моноклональные  антитела - это иммуноглобулины, синтезируемые одним клоном клеток. Антитела синтезируются в организме как проявление защитной реакции при попадании в него чужеродного вещества (антигена). Моноклональное антитело связывается только с одной антигенной детерминантой на молекуле антигена.

     Иммунная  система вырабатывает специфические  антитела на большое количество антигенов. Эта способность обусловлена наличием большого многообразия клонов лимфоцитов, каждый из которых вырабатывает антитела с узкой специфичностью. Антитела, в совокупности называемые иммуноглобулинами (Ig), составляют один из главных белковых компонентов крови - по весу около 20% суммарного белка плазмы.

     В качестве антигенов выступают различные  вещества: клетки микроорганизмов, вирусы, белки, нуклеиновые кислоты, в некоторых  случаях низкомолекулярные вещества типа антибиотиков или пестицидов. Антитела образуются не против всей молекулы белка или бактериальной клетки, а только к небольшим участкам на их поверхности – к антигенным детерминантам. Для  белковой молекулы антигенной детерминантой являются участки поверхности, содержащие около 5 аминокислотных остатков.

       Простейшие молекулы антител  имеют форму буквы Y с двумя  идентичными антиген-связывающими  участками - по одному на конце  каждой из двух “ветвей”. Защитный механизм действия антител основан на том, что при связывании антигенных детерминант происходит потеря определенных функций молекулы или клетки.

     Поскольку участков два, они могут сшивать  антигены:

     Если  молекула антигена имеет три или  больше антигенных детерминант, то антитела могут сшивать их в обширную сеть. Достигнув определенных размеров, такая сеть может выпасть из раствора в осадок:

     Способность больших иммунных комплексов к осаждению (преципитации) дает возможность выявления антител и антигенов. Образование таких комплексов может приводить к агглютинации (склеиванию) молекул. Это явление лежит в основе определения групп крови, когда эритроциты склеиваются антителами той или иной специфичности - реакция гемагглютинации.

     Молекула  антитела образована четырьмя полипептидными цепями: 

     Две из них - идентичные легкие (L-цепь, из 220 аминокислот), а две - тяжелые (H-цепь, из 440 аминокислот). Все четыре цепи соединены между собой нековалентными и ковалентными (дисульфидыми) связями. Антиген-связывающие участки образуются за счет одной H и одной L-цепи. Эффективность реакций связывания антигена возрастает благодаря гибкому шарнирному участку антитела, который позволяет изменять расстояние между двумя антиген-связывающими участками. Шарнирный участок находится на H-цепи. H-цепь образует также “хвостовой” участок молекулы, который содержит также одну или несколько олигосахаридных цепочек, функция которых неясна. Как L, так и Н-цепь построены из повторяющихся сегментов, или доменов, каждый из которых сворачивается независимо, образуя компактную функциональную единицу (эпитоп). Эти участки также могут выступать в качестве антигенных детерминант и, соответственно, связываться другими антителами. 
 
 
 
 

     3. Получение моноклональных антител 

     Иммунный  ответ - сложный процесс межклеточных взаимодействий лимфоидных клеток различных типов с участием специальных гормонов, в результате чего В-лимфоциты начинают активно синтезировать и выделять в кровь специфические антитела против данного антигена. На поверхности В-лимфоцитов существуют рецепторы, аналогичные антителам, взаимодействие которых с антигеном в сложном межклеточном комплексе служит стимулом для начала биосинтеза антител.

       Получение антител для нужд  человека начинается с иммунизации  животных. После нескольких инъекций  антигена в присутствии стимуляторов  иммунного ответа в сыворотке  крови накапливаются специфические антитела. Антитела выделяют из сыворотки в виде g-глобулиновой фракции, осаждая сыворотку крови сульфатом аммония, спиртом, ПЭГ и другими веществами. Полученные антитела содержат много примесных белков. Высокоочищенные антитела выделяют с помощью ионообменной хроматографии.

     Стандартные препараты получить довольно сложно, так как состав их зависит от вида животного, его индивидуальных особенностей, цикла иммунизации и других малоконтролируемых факторов. Но для современного биохимического анализа очень важна специфичность, то есть способность выделить данное вещество в сложных многокомпонентных средах, таких, как сыворотки крови, сок растений, ферментная среда. Такое возможно при использовании иммунохимического метода, использующего антитела, взаимодействующие узко специфично по принципу "антиген - антитело". Для проведения такого анализа необходимы абсолютно идентичные антитела, синтез которых обычными способами не приемлим.

     Решение проблемы было предложено в 1975 году английскими  учеными Георгом Кёлером и Цезарем Мильштейном. Они разработали методику получения клеточных гибридов - гибридом. Гибридомы образуются в результате слияния лимфоцитов, взятых от иммунизированных животных, с клетками миеломы костного мозга, культивируемыми in vitro.

     Животное  иммунизируют, в ответ на введение антигена в организме мыши активизируются продуцирующие антитела В-лимфоциты. Эти клетки могут жить только в  организме хозяина, при переводе на искусственную питательную среду  они гибнут. Если слить иммунную клетку с опухолевой, образуются гибридные клетки, способные неограниченно долго жить в искусственных средах. Одновременно они сохраняют способность синтезировать антитела.

     Гибридомы, синтезирующие определенные виды антител, отбирают на селективных ростовых средах. Затем их помещают в культуральную жидкость, в которой они размножаются и образуют много родственных клеток (клон). Такие клоны могут синтезировать антитела, получившие название моноклональных (МКА). МКА - антитела, однородные по структуре и специфичности, которые можно производить в неограниченных количествах.

     Другой  метод получения антител основан  на инъекции полученной гибридомы в  брюшную полость мышки. Там гибридома  реплицируется и вызывает образование  асцитной опухоли (скопления клеток, плавающих в жидкости, заполняющей брюшную полость). Асцитная жидкость, выделенная из этой мыши, представляет суспензию, содержащую антитела. Клетки и белки, не относящиеся к МКА, удаляются. Оставшийся материал, представленный преимущественно антителами, используют. Этот метод позволяет получать высококонцентрированные препараты антител. Но массовое производство требует одновременного использования нескольких тысяч мышей. Кроме того, получаемый материал требует доочистки. Это дорого и трудоемко, поэтому в настоящее время предпочтение отдается первому способу, с использованием культуры клеток. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

     4. Методы анализа на основе моноклональных антител 

     Методы  анализа: иммуноферментный (ИФА), иммунолюминесцентный, иммунорадиологический

     Высокая специфичность антител к антигену дает возможность использовать их для идентификации различных веществ (макромолекул, клеточных фрагментов или целых клеток).

     Начало  широкому использованию антител  в диагностических целях положил  в 1955 году американский иммунолог А. Кунс. Он присоединил к антителам светящийся краситель. Флюоресцирующие антитела сделали видимыми места расположения интересующих его молекул в клетке. Этот метод получил название иммунофлюоресцентного. Чувствительность метода можно повысить несколькими путями.

       В первом случае иммунный ответ усиливается за счет применения антител нескольких порядков:

     Антиген иммобилизуется на подложке, к нему добавляются антитела 1-го порядка, связывающиеся непосредственно  с антигеном. В исследуемый образец  добавляются антитела 2-го порядка, связывающиеся с антигенными детерминантами антител 1-го порядка. Антитела 2-го порядка имеют флюоресцирующую (или другую) метку. Поскольку участков связывания может быть несколько, то реакция проявляется более отчетливо.

       Другая система усиления сигнала основана на высоком сродстве биотина (низкомолекулярного растворимого витамина) к стрептавидину (бактериальному белку). Здесь возможны два варианта: 
 
 
 

       А. Если возможно ковалентно связать биотин непосредственно с антителами, то стрептавидин метят маркером и используют аналогично антителам второго порядка:

     Б. Система “биотин-антитело + стрептавидин + меченый биотин”:

     В этом случае образуется целая сеть из молекул стрептавидина, связанного с меченым биотином. Следовательно, происходит многократное усиление сигнала.

       Применение антител второго и  третьего порядков позволяет  упрощать процедуру определения  микроорганизмов в мазке. При этом не обязательно иметь меченые антитела против всех бактерий. Достаточно иметь обычные антитела кролика или мыши против интересующего микроорганизма и меченые МКА против этих иммуноглобулинов. Если микроорганизм в мазке присутствует, то к нему “приклеятся” специфические антитела, а к ним уже - меченые. В результате мазок будет светится при люминесцентной микроскопии. Фотометрические или флуоресцентные методы могут быть использованы не во всех случаях, например, если измерение проводят очень мутной среде.

     Кроме красителя в качестве метки можно  использовать фермент (иммуноферментный анализ) или радиоактивный изотоп (иммунорадиологический). От чувствительности детекции маркера зависит чувствительность метода анализа. 

     Радиоактивные метки.

     Одним из важных этапов в проведении анализа является выбор маркера и способа его «привязки» к антигену. Первоначально широко применялись радиоизотонные метки (радиоиммунный анализ - РИА), предложенные американскими исследователями С. А. Берсон, Р. С. Ялоу в 1959 году. Но в последние годы в качестве маркеров больше используются ферменты, что обусловлено рядом трудностей, связанных с применением изотопныx маркеров. Так, изотоп ¹²⁵I имеет время полураспада 60 суток, чем ограничивается срок его использования.

Изотоп ³Н имеет длительное время жизни (12,5 лет), но под действием бэта-излучения происходит распад молекул антигена, в результате чего время жизни меченых 3Н-соединений тоже ограничено. Ограничивающими факторами РИА являются сложность и высокая стоимость оборудования, необходимость централизованной системы распределения иммунохимических наборов, меченных радиоактивными изотопами, определенная опасность изотопов для окружающей среды. Учитывая трудности использования радиоизотопных меток, были предложены в качестве маркеров ферменты.

     При иммуноферментном анализе антиген  связывается с поверхностью лунки  полистирольного планшета. В лунку  добавляют антитела, несущие фермент  в качестве метки, инкубируют и отмывают. Далее приливают субстрат, который  меняет окраску при взаимодействии с этим ферментом. Изменение окраски можно измерить с помощью спектрофотометрии. Таким способом проводится индикация и количественная оценка биоорганических соединений с чувствительностью до 10-12 г/литр.

     В настоящее время известно более 2000 разных ферментов, однако только некоторые находят применение в иммуноферментном анализе. Это объясняется высокими требованиями, предъявляемыми к свойствам ферментов. Фермент должен быть высоко активен, а продукты его реакции детектироваться с высокой чувствительностью, он должен быть стабилен, так чтобы его активность сохранялась не менее одного года. Содержание фермента-маркера в определяемом образце должно быть минимальным. Именно из-за этого для разных объектов используют разные ферменты. Во многих случаях, когда необходим качественный результат, оценка иммунохимической реакции может быть проведена визуально.

     Для введения ферментативной метки разработано  много разных химических, биохимических  и иммунологических способов.

     Первым  реагентом, использованным для синтеза иммуноферментных конъюгатов, был глутаровый альдегид, реагирующий с аминогруппами лизина белковых молекул. С помощью глутарового альдегида получены конъюгаты антител и антигенов с пероксидазой, щелочной фосфатазой, глюкоамилазой. В настоящее время широко используются иммунопероксидазные конъюгаты и конъюгаты с бэта-галактозидазой.

     Ковалентные методы получения иммуноферментных конъюгатов нашли весьма широкое  распространение, но в некоторых случаях действие сшивающего реагента отрицательно сказывается на ферментативной и иммунологической активности компонентов гибридной макромолекулы. В связи с этим определенный интерес представляют иммунологические методы введения ферментной метки.

     Один  из подходов получил название метода «гибридных антител». Ферментативным гидролизом получают Fab-фрагменты молекул антител против определяемого антигена и используемого фермента. Затем смесь продуктов гидролиза подвергают восстановлению меркаптоэтанодом; при этом Fab-фрагменты обратимо диссоциируют на симметричные части. После удаления восстанавливающего агента молекулы снова ассоциируют, образуя гибридные молекулы антител, специфичные к определяемому антигену и ферменту. При добавлении фермента образуется комплекс антитело—фермент. Гибридомная технология открывает принципиально новый путь получения гибридных антител, который заключается в том, что сливаются моноклональные клетки, специфичные против данного антигена и фермента-маркера, в результате чего образуются гибридомы второго поколения, синтезирующие антитела, с двумя специфичностями.

     Другой  путь заключается в том, что получают антитела одного и того же вида животного (например, кролика) против определяемого  антигена и фермента, которые соединяют  между собой через антитела другого  вида животных (антитела барана против кролика). Добавление фермента к такой тройной молекуле также приводит к образованию комплекса антитело—фермент. В настоящее время разрабатываются подходы получения гибридных антител методами клеточной и генной инженерии, что позволит существенно упростить способ их получения.

     Стабильность  иммуноферментных конъюгатов при хранении — важнейший параметр, обусловливающий  возможность их практического использования. Методы направленной стабилизации конъюгатов пока еще не разработаны. Не существует также корреляции между стабильностью конъюгатов и методом их получения. Однако высокая стабильность гибридных молекул обеспечивает их применение на практике и значительно превосходит стабильность антител и антигенов, меченных радиоактивными изотопами. В лиофилизованном состоянии ферментные конъюгаты сохраняют свои свойства до двух лет.

     Кроме ферментов в качестве маркеров могут  быть использованы субстраты. В частности, в иммунокофакторном анализе  применяются в качестве меток  АТФ и НАД, которые могут быть «пришиты» к молекуле антигена через адениновый остаток таким образом, что сохраняется их способность взаимодействовать с ферментом. Аналогично были использованы субстраты пероксидазы (люминол, изолюминол), которые могут быть окислены пероксидом водорода в реакции хемилюминесценции, катализируемой пероксидазой. 

     5. Применение моноклональных антител 

     Наиболее  широко используются моноклональные антитела в медицинской диагностике. Разработаны  сумки-укладки для постановки диагнозов. Если к антителами присоединить радиоактивные или магнитоактивные материалы и ввести их в живой организм, то можно выявить в нем патологические зоны. Такие МКА присоединяются к пораженным болезнью клеткам организма, а соответствующие индикаторные материалы позволяют выяснить их местонахождение.

     МКА используются и в процессах очистки веществ. Современные технологии основаны на присоединении антител к твердой матрице носителя. К ним добавляют смесь молекул, содержащую искомый антиген. Затем комплексы антиген - антитело отмываются от примесей, не связанных с матрицей. После разрушения ковалентных связей антиген - антитело в растворе остаются свободные антигены.

     Если  получить антитела определенного типа и иммунизировать ими животное, то образуются анти-антитела (анти-идиотипные антитела). Они действуют на иммунную систему как псевдоантиген и поэтому могут быть использованы для ее стимуляции. На этом принципе основано получение вакцин нового типа. Наборы МКА могут быть также предназначены для борьбы с аллергенами.

     Моноклональные  антитела и “мишенная” лекарственная терапия. Предполагается, что большое разнообразие раковых заболеваний обусловлено активацией эндогенных генов, вызванной химическими агентами, внутренними хромосомными перестройками. Эти гены кодируют определенные белки, и поэтому раковые клетки могут содержать уникальные белки на поверхности клетки. Возможно, именно эти белки участвуют в супрессии роста здоровых клеток. Инактивируя эти белки, можно тормозить рост раковых клеток.

     Благодаря высокий специфичности МКА широко используются в качестве зондов для точного определения природы молекул поверхности клеток и клеточных органелл. С их помощью также можно проводить детекцию активности ферментов.

     Методы  иммуноферментного анализа применяют  в диагностике вирусных заболеваний  растений. Это позволяет сократить время получения безвирусного посадочного материала, отбирать новые вирусоустойчивые сорта. При генно-инженерных экспериментах можно быстро отбирать клоны - продуценты. 
 
 

     Заключение 

     Получение и использование моноклональных антител - одно из существенных достижений современной иммунологии. С их помощью можно определить любое иммуногенное вещество. В медицине меченые изотопами или другим способом моноклональные антитела используются для диагностики рака и определения локализации опухоли, для диагностики инфаркта миокарда. Получены моноклональные антитела к различным возбудителям: малярии, трипаносомозу, лейшманиозу, токсоплазмозу и др. Ученые считают, что в самом ближайшем будущем моноклональные антитела займут доминирующее положение в диагностике болезней.

     Для использования в терапии моноклональные антитела можно соединять с лекарством (например, с токсическими веществами). Благодаря специфичности антител они доносят это вещество непосредственно к раковым клеткам или патогенным микроорганизмам, что позволяет значительно повысить эффективность лечения. Можно использовать моноклональные антитела для определения пола у крупного рогатого скота на предимплантационной стадии развития, а также для стандартизации методов типирования тканей при трансплантации органов, при изучении клеточных мембран (так были изучены антигены Т-лимфоцитов), для построения антигенных карт вирусов, возбудителей болезней. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

     Список  использованной литературы 

1.Албертс Б., Брей Д., Льюис Дж. и др. Молекулярная  биология клетки. Т. 1. М. : Мир, 1994. 

2. Тартаковский А.Д. Питательные среды для культивирования клеток млекопитающих. Методы культивирования клеток. Л.: Наука, 1988. С. 44 - 63. 

3.Фрешни Р.  Культура животных клеток. Методы. М.: Мир, 1989. 318 с. 

4.Фридлянская И.И. Получение моноклональных антител (гибридомная технология). Методы культивирования клеток. Л.: Наука, 1988. С. 194 - 205. 

5. Петухов В.Л., Короткевич О.С., Стамбеков С.Ж.  и др. Генетика. Учебник. Новосибирск:  СемГПИ, 2007.